专利名称：获自烟草的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及由Nicotiana tabecum(烟草)中鉴定的启动子。本发明还涉及运用所述启动子控制外源目的DNA在不同植物种转基因植物中的表达。
背景技术：
农杆菌属的细菌具有将特定DNA区段(T-DNA)转入植物细胞，在其中的核染色体上稳定整合的能力。对载有该T-DNA的植物所进行的分析表明该遗传元件可以在多个位点整合，偶尔还能在基因内找到。一种已经利用来鉴定基因内整合事件的策略是用特殊设计的T-DNA载体转化植物细胞，所述载体含有一个缺少顺式作用转录和翻译表达信号(即“无启动子”)并位于T-DNA末端的报告基因。整合时，无启动子基因(报告基因)的起始密码子将与植物序列并置。T-DNA邻近基因启动子元件下游插入的结果可能是报告基因表达的激活。产生的杂种基因，称为T-DNA介导的基因融合体，包含有位于染色体中它们天然位点上的未知并因而未表征的植物启动子，以及位于插入T-DNA上的标记基因的编码序列(Fobert等，1991,Plant Mol.Biol.17,837-851)。
无启动子或无增强子标记基因的激活通常假定是由于T-DNA在基因内或紧邻基因处的插入产生的。最近对于几个T-DNA插入突变体的分离(Koncz等，1992,Plant Mol.Biol 20,963-976；Feldman的综述，1991,Plant J.1,71-82；Van Lijsebettens等，1991,Plant Sci.80,27-37；Walden等，1991,Plant J.1:281-288；Yanofskg等，1990,Nature 346,35-39)，表明对于至少一些插入而言情况是这样。但是，存在其它可能性。这些可能性之一是该T-DNA的整合激活了与基因无关联的沉默调控序列。Lindsey等(1993,Transgenic Res.2,33-47)称这样的序列为“假启动子”并暗示它们或许负责激活人为一些转基因品系中的报告基因。Fobert等(1994,plant J.6,567-577)已经克隆了这种序列，并将其称为“隐蔽性启动子”。
发明概述本发明涉及由Nicotiuna tabacum(烟草)鉴定的启动子。
转基因烟草植株T1275含有包含2.15kb无启动子GUS-nos基因和2.23kb 5’侧翼烟草DNA(2225bp)的4.38kb的EcoRⅠ/XbaⅠ片段。此5’侧翼DNA未显示与已知序列有同源性。
因此，本发明包括一个特征为含有至少18bp SEQ ID NO:1的邻接序列的启动子。
用Southern印迹杂交法在大豆、番茄、向日葵、Arabidopsis，甘蓝型油菜，甘蓝，玉米、小麦或黑云杉中检测不到此启动子。所述克隆片段在转基因烟草-烟草栽培品种Petit Havana,SRI以及转基因甘蓝型油菜栽培品种Westar中的表达可在叶片、茎、根、发育中的种子以及花中观察到。运用瞬时表达分析法，也在大豆、苜蓿、拟南芥属、烟草、甘蓝型油菜、碗豆的叶片组织以及燕麦、玉米、小麦和大麦的悬浮培养细胞中观察到GUS活性。
因此本发明也提供组成型的启动子。进而，此启动子在克隆载体上导入时在不同植物种中发挥功能。
本发明还包括具有一段DNA序列、实质上与SEQ ID NO:1同源的组成型启动子。
转基因烟草中导入的GUS基因的转录起始位点位于植物DNA中的所述插入位点上游。这在叶片、茎、根、种子和花中是相同的。另外，在未转化烟草和转基因烟草中所述天然位点均是沉默的。
因此按照本发明，提供来自烟草的隐蔽性组成型启动子，当它在克隆载体中导入时，在不同的植物物种发挥功能。
本发明也涉及嵌合型基因构建物，它包括一段希望组成型表达的目的DNA以及一个含有至少18bp SEQ ID NO:1邻接序列的组成型启动子。
本发明还涉及包含所述嵌合型基因构建物的克隆载体。
本发明也包括已经用所述嵌合基因或所述克隆载体转化的植物细胞。进而，本发明包括含有所述嵌合基因或所述克隆载体的转基因植物。
本发明还涉及含有一个组成型启动子的任何转基因植物，所述启动子具有实质上与SEQ ID NO:1同源的一段DNA序列，有效连接于被转录成RNA的DNA区。
本发明也包括使基因在植物中组成型表达的方法，包括将一段希望组成型表达的外源目的DNA有效连接于一个含有至少18bp SEQID NO:1邻接序列的组成型启动子上，以产生嵌合型基因构建物并将其导入能够表达此嵌合型基因构建物能够表达的植物中。
附图简述通过参考以下附图，本发明的这些或那些特征会更明显
图1表明GUS在植珠T1275所有组织中的组成型表达，所述组织包括叶片段(a)、茎剖面(b)、根(c)、花剖面(d)、子房剖面(e)、未成熟胚(f)、成熟胚(g)以及种籽剖面(h)。
图2表示GUS的比活，它表明T1275中GUS表达的水平比得上叶片组织中表达CaWV 35S-GUS-nos基因的植物中的水平。
图3是用GUS基因编码区探针(泳道1)和nptⅡ基因编码区探针(泳道2)对经EcoRⅠ消化的T1275 DNA进行的Southern印迹杂交分析，表明植株T1275中的单一T-DNA插入位点。
图4表明从pT1275克隆的GUS基因融合体。箭头表示所述植物DNA序列中GUSmRNA起始位点。
图5表明所述分离的植物DNA序列的限制性内切酶图谱。箭头表示所述植物DNA序列中GUS mRNA的起始位点。
图6表明在随机选出的单独、再生、温室生长的烟草植物叶片中GUS的比活不同(图6A)，并通常与用RNase保护试验和放射自显影谱光密度检测法测量出的累积GUSmRNA水平有关(图6B)。
图7表明在未转化(泳道U)或转基因(泳道T25)烟草植株叶片中相应于天然植物序列原位转录物不积累(3)；而与插入转基因植物T25的T-DNA中的GUS基因融合的同一植物序列，其相应的转录物(泳道T25)出现在所示的被保护片段(2)中。泳道P中的未消化探针(1)作对照。
优选实施方案的描述本发明涉及植物基因调控序列。更确切地说，本发明涉及一个启动子，该启动子是通过用无启动子的β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)作为T-DNA标签，以产生组成型表达GUS活性的转基因烟草植物鉴定的。
本发明亦涉及含有SEQ ID NO:1的至少18bp相邻核苷酸序列的启动子。不低于18bp的寡核苷酸可用于构建包含如SEQ ID NO:1中所定义的启动子片段的异源启动子。这样的异源启动子的运用已在文献中较好建立。例如，已复制35S CaMV启动子中的特殊元件片段或将其与其它启动子片段结合以产生具有所需性质的嵌合启动子(如U.S.5,491,288、5,424,200、5,322,938、5,196,525、5,164,316)。另外，18bp或更长的寡核苷酸在鉴别或扩增其它组织或生物中有关DNA或RNA序列中可用作探针或PCR引物。
在本说明书的上下文中，名词“启动子”或“启动子区”是指通常在结构基因编码序列的上游(5’)的一段DNA序列，它通过为RNA聚合酶和/或从特殊位点起始转录所需的其它因子提供识别来控制编码区的表达。
通常有两种类型的启动子，即诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子是一种能够直接或间接地响应诱导物而激活一个或多个DNA序列或基因的转录的启动子。当缺乏诱导物时，所述DNA序列或基因将不转录。特异性地结合于诱导型启动子以激活转录的蛋白质因子通常以无活性形式出现，然后它被所述诱导物直接或间接地转化为活性形式。所属诱导物可以是化学试剂，如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物或直接由热、冷、盐、或有毒元素或间接通过病原体或诸如病毒之类的致病因素作用而施加的生理胁迫。含有诱导型启动子的植物细胞可通过诸如喷洒、浇水、加热或类似方法从外部提供诱导物给细胞或植物使其暴露于诱导物。
组成型启动子指导基因在整个植物的各个部分表达，并在整个植物发育过程连续表达。已知的组成型启动子的例子包括与以下有关的那些启动子CaMV 35S转录子(Odell等，1985,Nature,313:810-812)、水稻肌动朊1(Zhang等，1991,Plant Cell,3:1155-1105)和磷酸丙糖异构酶1(Xu等，1994,Plant Physiol.106:459-467)基因；玉米遍在蛋白质1基因(Comejo等，1993,Plant Mol.Biol.29:637-646)、拟南芥属遍在蛋白质1和6基因(Holtorf等，1995,Plant Mol.Biol.29:637-646)和烟草翻译起始因子4A基因(Mandel等，1995,Plant Mol.Biol.29:995-1004)。本发明涉及含有一个能够指导基因表达的启动子的一段DNA序列。所述启动子最好从烟草分离出的组成型启动子。
用于此处的名词“组成型”不必表明基因在所有细胞类型中有相同表达水平，而是表明所述基因在广泛细胞类型中表达，虽然常可观察到丰度的某些变化。
本发明还涉及含有有效连接于本发明启动子的目的DNA的嵌合基因构建物。可以按照本发明使用和操作任何外源基因，以产生所述外源基因的表达。目的基因可以是包括(但不限于)编码蛋白质的基因、转录产生反义RNA的DNA或者介导其它DNA表达的某种方式起作用(如导致其它DNA共抑制或类似功能)的转录产物。
本发明的嵌合型基因构建物可以还包括一段3’非翻译区。3’非翻译区是指基因的一部分，该部分包括含有多腺苷酸化信号的DNA片段或能够实现mRNA加工或基因表达的任何其它调控信号的DNA区段。多腺苷酸化信号通常的特征为实现朝mRNA前体的3’末端添加聚腺苷酸。多腺苷酸化信号一般以出现典型的5’AATAAA-3’形式的同源性而被识别，虽然变异并非不普遍。
适合的3’区例子是含有农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合酶(Nos基因))和植物基因(如大豆储藏蛋白基因以及1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基)的多腺苷酸化信号的3’转录非翻译区。因此，来自本发明结构基因的3’端非翻译区可以用于构建在植物中表达的嵌合基因。
若需要的话，本发明的嵌合型基因构建物也可以还包括增强子，或者是翻译增强子或转录增强子。这些增强子是本领域技术人士熟知的，可以包括ATG起始密码子及邻近序列。起始密码子必须与编码序列的可读框架相协调以保证翻译全部序列。所述翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源，天然的和合成的均可。翻译起始区可由转录起始区提供，或来自结构基因。其序列亦可来源于选择表达该基因的启动子，并可以进行特殊修饰以增强mRNA的翻译。
为了有助于转化植物细胞的鉴别，本发明的构建物可进一步操作以包括植物选择标记。有用的选择标记包括可提供对如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等等的抗生素抗性的酶。同样地，也可使用提供可通过颜色变化(如GUS(β-葡萄糖苷酸酶))或发光(如荧光素酶)鉴别的化合物的酶，或为一个复合物产物。
本发明也考虑的部分是含有包含本发明启动子的嵌合基因构建物的转基因植物。从植物细胞再生成整株植物的方法是本领域公知的，获得转化和再生植物的方法对于本发明并不重要。通常，将转化植物细胞培养于适合的培养基，所述培养基可含有如抗生素的选择剂，这里使用选择标记以便于转化植物细胞的鉴别。一旦形成愈伤组织，按已知的方法可通过施加适当的植物激素以促进苗形成，并将苗转入生根培养基以再生植株。所述植株继而可用于从种籽或用营养增殖技术建立重复世代。
本发明构建物可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、电穿孔等导入植物细胞。此类方法的综述可参见如Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法，学术出版社，纽约Ⅷ，第421-463页(1988)；以及Geierson和Corey，植物分子生物学，第二版(1988)，本发明还包括含有所述嵌合基因构建物的适合载体。
当本发明中提到特定序列时，可理解为这些序列包括在其与所述特定序列“实质性同源”的序列范围之内。当至少约70％、优选至少约80％、最优选至少90％的所述核苷酸与限定长度的该分子相匹配时，这些序列即为“实质性同源”。“实质性同源”的序列包括该序列内的任何置换、缺失或加入。实质性同源的DNA序列可在Southern杂交实验中，例如在严格的杂交条件下(参见Maniatis等，分子克隆(实验手册)，冷泉巷实验室(1982)，第387-389页)得以鉴别。
本发明中所指的特定序列也包括与所述特定序列“功能相同”的序列。本发明中功能相同的序列是指虽与所所述特定序列不一致，但提供相同或大致相同功能的序列。功能相同的DNA序列包括该序列内的任何置换、缺失或加入。参照本发明，功能相同的序列将指导外源基因的组成型表达。
尽管以优选实施方案作特定参考详细地描述本发明，但提供所述实施方案是为了说明，而不是限制本发明。
实施例组成型启动子-GUS融合体的表征将双构建物转移入农杆菌以及烟草SR1叶圆盘的转化按Fobert等(1991,Plant Mol.Biol.17,837-851)的描述进行。在体外培养的全过程中植物组织保持在100μg/ml硫酸卡那霉素(Sigma)上。
从产生的转基因植物中，选择其中之一的T1275以进行详细的研究，由于它高水平地组成型表达GUS。
荧光团检测和组织学GUS检测按Jefferson(Plant Mol.Biol.Rep.,1987,5,387-405)方法，按Fobert等(Plant Mol.Biol.,1991,17,837-851)的修改法进行。对于初次筛选，从体外生长的小植株采摘叶片。之后，从生长于温室中的植物收集并分析九种不同组织叶片(L)、茎(S)、根(R)、花药(A)、花瓣(P)、子房(O)、萼片(Se)、以及开花后10天龄的种子(S1)和开花后20天龄的种子(S2)。详细地说，从体外生长的卡那霉素抗性F1子代收集叶片、茎和根组织，进行GUS活性的定量分析。在第8-10发育阶段(Kdtunow等，1990,Plant Cell 2,1201-1224)，从原始转基因植株采摘花组织。也将花贴上标鉴并从开花后10天和20天的蒴果(capsule)中收集发育中的种子。在所有情况下，称量组织，立刻在液氮中冷冻，并贮藏于-80℃。
用组织学检测分析的组织处于与以上所列组织相同的发育阶段。对分析每个器官的不同手切切片。对每株植物，至少两个不同的时期进行组织学检测以保证重复性。除花器官之外，所有组织均参照Jefferson(1987,Plant Mol.Biol.Rep.5,387-405)法，在磷酸缓冲液中以1mM X-Glnc(Sigma)作为底物进行检测。花在含有20％(v/v)甲醇的相同缓冲液中检测(Kosugi等，1990,Plant Sci.70,133-140)。
在植株T1275的所有组织中发现了GUS活性。图1表明用X-Gluc对T1275进行组织化学染色后(显示)GUS的组成型表达，包括叶片(a)、茎(b)、根(c)、花(d)、子房(e)、胚(f和g)和种子(h)。
GUS的组成型表达用转化植株T1275植物组织的更灵敏的荧光团检测法所确认。这些结果示于图2。GUS在包括叶片(L)、茎(S)、根(R)、花药(A)、雌蕊(P)、子房(O)、萼片(Se)、10天龄种子(S1)和20天龄种子(S2)的所有组织中表达明显。并且，GUS的表达水平可与含有GUS-nos融合体中组成型启动子CaMV 35S的转化植物的表达水平相比。据Fokert等(1991,Plant Molecular Biology,17:837-851)的报道，在含有包含CaMV 35S-GUS-nos嵌合基因的PBⅠ121(Clontech)的转化植物中，GUS活性高达18,770±2450(pmole MU每分钟每毫克蛋白)。转基因植株T1275的遗传学分析所述T-DNA含有卡那霉素抗性基因。将自花授粉转基因植物的种子置于70％乙醇中1分钟和未稀释的Javex漂白剂(6％次氯酸钠)中25分钟进行表面消毒。然后用无菌蒸馏水将种子漂洗数次，在层流下干燥，并如MiKi等所述(1993,Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology,Eds.,B.R.Glick和J.E.Tompson,CRC Press,BocaRaton,67-88)置于含有补充了100μg/ml卡那霉素的MSO培养基的培养皿中。每一转化体至少计数90株小植株。4-6周后计数绿色小植株(卡那霉素抗性)和白化植株(卡那霉毒敏感)的数目，并用Chi2测试法在显著性P＜0.05下的进行分析。
遗传学分析结果示于下列表1，它表明T-DNA座位以单个插入座位分离。
表1转基因植物T1275的遗传学分析
Southern印迹分析运用GUS基因编码区探针或nptⅡ基因编码区探针对转基因植物T1275中的T-DNA进行分析。
用Sanders等的方案(1987,Nucleic Acid Res.15,1543-1558)从冻干叶片中分离基因组DNA。用生产商所提供的补充有2.5mM亚精胺的适合缓冲液，以EcoRⅠ酶切数小时消化10mg T1275 DNA。在通过0.8％TEA琼脂糖凝胶电泳后，以标准程序进行Southern印迹分析。由于来自含有组成型启动子-GUS-nos构建物的构建物的T-DNA只包含单一EcoRⅠ识别位点，因此所述杂交片段由T-DNA和侧翼烟草DNA序列组成。所述片段长度将根据最近的EcoRⅠ位点的位置而变动。用GUS基因作探针(图3-泳道1)，将可探测出在植物DNA中最近EcoRⅠ位点近旁的片段。用T1275定位一个这样的片段。用nptⅡ编码区作探针(图3-泳道2)，它与所述EcoRⅠ位点对侧的序列杂交，又仅有一条杂交带明显。正如从图3也可以看出的，所述T-DNA内未发生重大的重排。所述组成型启动子-GUS融合体的克隆和分析按Hattori等的方法(1987,Anal.Biochem.165,70-74)从叶片分离基因组DNA。按生产商的操作要求用EcoRⅠ和XbaⅠ消化10μgT1275总DNA。消化后的DNA在0.7％琼脂糖凝胶上进行大小分级分离。用Elu-Quick试剂盒(Schleicher和Schnell)从该凝胶中分离出约4-6kb的DNA片段，将其与预先用EcoR和XbaⅠ消化并用磷酸酶处理的λGEM-2臂相连接。基本上如Rutledge等(1991,Mel.Gen.Genet.229,31-40)所述，将约40,000个噬菌斑转至尼龙膜(Hybond,Amersham)上，用32p标记的分离自PBI121的2kb GUS插入片段进行筛选。分离出阳性克隆。从λ噬菌体分离出XbaⅠ-EcoRⅠ片段(参见图4和图5的限制性图谱)，将其克隆进预先用XbaⅠ和EcoRⅠ消化并用小牛肠磷酸酶处理的pTZ19R中。
该克隆中的植物DNA序列先前尚未在序列数据库中报道过。也未在多个物种中观察到，因为Southern印迹在大豆、土豆、向日葵、拟南芥属、甘蓝型油菜、甘蓝、玉米、小麦或黑云杉(数据未显示)中未显示与该片段杂交的带。在烟草中，Southern印迹未揭示在T-DNA插入位点处或其上游有显著重排的证据(数据未显示)。
为了分析生物发射(biolistics)(Sandford等，1983，Methods Enzymol,217:483-509)介导的GUS活性的瞬时表达，将XbaⅠ-EcoRⅠ片段亚克隆进PUC 19，如上所述用X-Glnc染色检测到了GUS活性。检查了温室生长的植物叶片或细胞悬浮培养物的染成蓝色斑点的数目。如表2所示，在所检查的多个物种中所述T1275启动子-GUS nos基因均有活性。
表2多个植物种组织中GUS活性的瞬时表达
>*蓝色斑点数目1-10(+),10-100(++),100-400(+++)用HindⅢ和EcoRⅠ消化pTZ-T1275，分离含有约2.2kb的T1275启动子与GUS基因和nos 3’端融合的4.2kb片段。将所分离的片段连接进预先用HindⅢ和EcoRⅠ消化并用小牛肠磷酸酶处理的pRD400载体(Datla等，1992,Gene,211:383-384)中。如上所述将双载体转移入根癌农杆菌并进行烟草SR1的叶圆盘转化。检查多个独立转基因品系的多种器官中的GUS活性。在未转化和转基因组织中均用图谱分析所述mRNA 5’末端的探针以RNA酶保护法(Melton等，1984,Nucleic AcidsRes.121:7035-7056)也对相同器官中的GUS mRNA作了检查。用TRIZOL试剂(Life Technologies)按生产商所描述的方法从冷冻研磨的组织中提取RNA。每次试验取10-30μg总RNA与相应于T1275序列的600碱基及GUS基因的400碱基的反义RNA探针杂交。用RPAⅡ试剂盒(Ambion CA)按生产商所述方法进行试验。在5％大范围丙烯酰胺(Long Ranger acrylamide)(J.J.Baker,N.J.)变性凝胶上分离被保护片段，将凝胶干燥并用Kodak X-RP胶片曝片。
对随机挑选的温室生长的由培养物再生植株的叶片所进行的分析，表明了广泛的GUS特殊活性(图6A)。用含有35S-GUS-nos基因的PBI121(CLONETECH)转化的植株产生了类似的比活水平(数据未示)。通常，叶片中GUS mRNA的水平(图6B)与GUS比活相关。并且，所有样品中出现约600个碱基的单一条带表明GUS转录起始位点位于植物DNA序列中T-DNA插入位点的上游约180碱基处。
为分析不同器官中的GUS表达，详细地检查了得自以上品系子代的品系。表3表明这些植株之一中的GUS比活。它在叶片、茎、根、发育中的种子和花器官、萼片、花瓣、花药、雌蕊以及子房中以不同水平表达，确认为组成型表达。将相同载体导入甘蓝型油菜也在这些器官中(资料未示)显示GUS活性的表达，表明组成型表达并非烟草特有的。对烟草各器官中GUSmRNA的检查表明，每一个的转录起始位点都相同，并且mRNA水平除在花芽中较低外均相似(表3)。
使用与以上相同的探针对未转化烟草的叶片、茎、根、发育中的种子和花中的RNA所进行的测试没有显示出被保护片段(图7)。因此假定所述插入位点在未转化烟草中是转录沉默的并被T-DNA插入所激活。所以所述插入位点的上游区是另一例植物隐蔽型启动子(Fobert等，1994,Plant J,6:568-577)。
表3转基因品系T64子代器官中的GUS比活和相对RNA水平
*未做一切科学出版物及专利文件包括都通过引用结合到本文中。
已参考优选实施方案对本发明作了说明。但是，对于本领域技术人员而言，很明显，可作一些不偏离以下权利要求书中所说明的本发明范围的变化和修改。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)姓名HER MAJESTY IN RIGHT OF CANADA,REPRESENTED BY THE MINISTER OFAGRICULTURE AND AGRI-FOOD CANADA(B)街道Central Experimental Farm(C)城市Ottawa(D)省安大略省(E)国家加拿大(F)邮政编码(ZIP):K1A 0C6(A)姓名PIERRE FOBERT(B)街道707 Tobin Terrace(C)城市Saskatoon(D)省Saskatchewan(E)国家加拿大(F)邮政编码(ZIP):S7N 4P4(A)姓名VENKATRAN N.IYER(B)街道2595 Maqumna Road(C)城市Kelowna(D)省British Columbia(E)国家加拿大(F)邮政编码(ZIP):VIW 2R9(ⅱ)发明名称获自烟草的启动子
(ⅲ)序列数1(ⅳ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MSDOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度2224个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅹⅰ)顺序描述；SEQ ID NO:1:TCTAGACTTA CAGAAAGTCT CTAACACGTG AGGGAATGAT CCCTTTCCTT ACCTCCCTGT60AGAGATATTG GCTTTTCAAC AACTAGTACA TAAATATGCG ACTTTGACCG TGTATCCCCA 120GTCAAAAGGG AACTTCACCC TCCTAGTTCT TTATTTCCAA CATACATGGG GAGTAATGCT 180AAATTTACAT AGAAGAATAA TAAAATGAAC TGTAACTAAT GATGTACTGT TCCAAAGAGA 240TGAGGACGTC AACATATTTA TTCCTTCAGC CCTTTTCAGA ATAATACCAT AAGTAGAAGA 300AATGGCACAT AAAATGAAGT CCTCGGCAAG TCAAATGTAA ATCTGAACCC ACCCAGCTAA 360CCCAGTGAAC TCAACTTTCC TGGATAGATC AGCACTCCTT CATGACATTG CATGCCTTCT 420CTTTAAAGAG CCGCTTGATC TCTGAAAACC AAATGAATCT CCACAGAGAG ATTTCGAGCT 480CCATGAGACG CCTTTTGGTT CTTGATTTAC TAAACCTATA AAAATGAAAG GAAGTAGGAC 540AACTGCATTT TGCCGCTTAA GATGCTTCGG CGCTTTGTGA ATTTTAAGTC ATGAGAAAGT 600ACAATGTTGG AATCTCACAT TAGAACAATG TATTTGTAAT AACCTAGGAA AGCAAAGCTA 660GAAGGGAGGT GCAGCTAAAT CTTCTTCTAC CTTGTTATCC TTGCATTTCT TGAGGAGGAG 720GAACTGTCCT CGCAGGTGCA AAATCTGCAG TCGCCCAAAA GGATATTCAG AAGTATATTA 780CAACATGTTT AATGGTTAAC CAAGTGAAAG ATCAAAATAG TCATTAGAAC AAAATGCGTG 840CTCAGAGCGT ATCTACTAGT TCATCAACCC AGTACACATC TCTGAATTTC ATCTCTTGCC 900GTTGAACTAA GTCAATTGGT CAAAGACGCA TAACATGAGA GACACTCATA AAACGGCTGA 960ATAACATGCA GAAGACGTCA TGCGCCTTAG GTCTCATTAT GCATGAGATT ATTAGTTATA 1020TGCTCCTTCA GTTTGACTAG AAATGAAAAA TCAGTTAAGC CTGTAACGAA ATGATAACCT 1080GCTTCAAGAA GATTAGACTA TTTTTCATAA AATATGCAGT GCCGTGAAAT AGATACTTAA 1140TCTTAGGCAG GAAAAATCTT CTATTGGGCC ATAATAAGAA CTACCAATTA GAAAGGAGGT 1200AGAAAGCTCC GATACTGTTA TGAAGGCCAT TCTAAGTGCT GATGTGAATT TCCCAATACA 1260AAATGACAAC AAAAACAAAA GCCTCAATCC TAAGCTAGTT GGGGTCGCTA TATAAATCCT 1320CGACATCCAT TTAACTCCAC TTGGACTCCT TTCTTTCCAA TATTTTAATA TTGTTAGATT 1380AATCATAAAA TTGCTTAGCT TTCTACTGGC ACTTAACCTA CTGCAACCCT CCTCTTCTGG 1440GATTCCAACA CAAACAACTA AGAGGAATTT GAAAAAAGAA AAGCAAATGT GAGAAGAGAC 1500AAAATGTACA ATGATACCTC TTCTTGCAGC AAAGGAGGCA GGTTCTCTGC TGAGACAAGG1560TTCTCTATTT CCTGCAAGAC CTTCGTATCT TTTATTCGAG ACCATGTATG TGGAGGTAAC1620GCCAGCAATA GTGCTGTCAG CACATCGTTG CTTGCAGGGG ATCTTCTGCA AGCATCTCTA1680TTTCCTGAAG GTCTAACCTC GAAGATTTAA GATTTAATTA CGTTTATAAT TACAAAATTG1740ATTCTAGTAT CTTTAATTTA ATGCTTATAC ATTATTAATT AATTTAGTAC TTTCAATTTG1800TTTTCAGAAA TTATTTTACT ATTTTTTATA AAATAAAAGG GAGAAAATGG CTATTTAAAT1860ACTAGCCTAT TTTATTTCAA TTTTAGCTTA AAATCAGCCC CAATTAGCCC CAATTTCAAA1920TTCAAATGGT CCAGCCCAAT TCCTAAATAA CCCACCCCTA ACCCGCCCGG TTTCCCCTTT1980TGATCCAGGC CGTTGATCAT TTTGATCAAC GCCCAGAATT TCCCCTTTTC CTTTTTTAAT2040TCCCAAACAC CCCTAACTCT ATCCCATTTC TCACCAACCG CCACATATGA ATCCTCTTAT2100CTCTCAAACT CTCTCGAACC TTCCCCTAAC CCTAGCAGCC TCTCATCATC CTCACCTCAA2160AACCCACCGG AATACATGGC TTCTCAAGCC GTGGAAACCT TATACTCACC TCCCTTTGCT2220CTTA 222权利要求
1．分离的启动子，包含含有SEQ ID NO:1的至少18bp邻接序列的核苷酸序列。
2．权利要求1的分离启动子，含有特征为图5中从XbaⅠ至SalⅠ的限制性图谱的DNA片段。
3．权利要求1的分离启动子，其中所述启动子是组成型启动子。
4．权利要求1的分离启动子，其中所述启动子是隐蔽型启动子。
5．权利要求3的分离组成型启动子，其中所述启动子具有与SEQID NO:1实质性同源的核苷酸序列。
6．权利要求3的分离的组成型启动子，其中所述启动子具有与SEQ ID NO:1功能相同的核苷酸序列。
7．含有SEQ ID NO:1核苷酸序列的分离DNA分子。
8．嵌合基因构建物，含有期望组成型表达的目的DNA和按照权利要求3所述的组成型启动子的。
9．权利要求8所述的嵌合基因构建物，其中所述组成型启动子具有与SEQ ID NO:1实质性同源的核苷酸序列。
10．含有权利要求7的分离DNA分子的嵌合基因构建物。
11．含有权利要求9的嵌合基因构建物的载体。
12．含有权利要求10的嵌合基因构建物的载体。
13．在植物中赋予基因组成型表达的方法，包括将期望组成型表达的目的DNA有效连接于来自烟草的组成型启动子，所述的组成型启动子包括SEQ ID NO:1的至少18bp邻接序列，以产生一个嵌合基因构建物，并将所述嵌合基因构建物导入能够表达所述基因构建物的植物中。
14按权利要求13的方法，其中所述的组成型启动子具有与SEQID NO:1实质性同源的核苷酸序列。
15．含有权利要求8中的嵌合基因构建物的转基因植物细胞。
16．按照权利要求15的转基因植物细胞，其中所述的组成型启动子具有与SEQ ID NO:1实质性同源的核苷酸序列。
17．含有权利要求10的嵌合基因构建物的转基因植物细胞。
18．按照权利要求16的转基因植物细胞，选自烟草、甘蓝型油菜、大豆、苜蓿、拟南芥属、玉米、小麦以及大麦。
19．含有权利要求8的嵌合基因构建物的转基因植物。
20．按照权利要求19的转基基植物，其中所述的组成型启动子具有与SEQ ID NO:1实质性同源的核苷酸序列。
21．含有权利要求10的嵌合基因构建物的转基因植物。
22．按照权利要求21中的转基因植物，选自烟草、甘蓝型油菜、大豆、苜蓿、拟南芥属、玉米、小麦以及大麦。
全文摘要
用无启动子的β－葡萄糖苷酸酶(GUS)基因作为T－DNA标鉴产生了组成型表达GUS活性的转基因烟草植株。已经克隆并测序了该基因融合体。已经用农杆菌介导的转化将其重插入烟草。所述GUS基因上游的烟草DNA大约长2kb并且未显示与已知序列同源。含有组成型启动子的该DNA可用于控制外源基因在多种植物物种的转基因植物中的表达。
文档编号C12N15/09GK1214736SQ97193391
公开日1999年4月21日 申请日期1997年1月31日 优先权日1996年2月1日
发明者皮雷·福伯特, 文卡特拉姆N·伊耶尔, B·米基, J·哈托里, H·拉贝, T·奥埃勒特, E·E·杰梅斯, E·福斯特-阿特金森 申请人:加拿大农业及农业食品部, 皮雷·福伯特, 文卡特拉姆N·伊耶尔