专利名称：新的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及在假丝酵母属(Candida)酵母中可以进行基因表达的新型启动子。具体地，本发明涉及在假丝酵母属酵母中，可以不依赖于培养条件或培养基条件等诱导条件而组成性并且高效地表达有用基因的启动子。
背景技术：
随着基因重组技术的发展，开始用微生物来生产有用的蛋白质和有用的化学物质等。目前正在积极开发采用原核生物大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)的基因重组系统，其中，特别是采用大肠埃希氏菌的宿主-载体系统已经用于生产各种有用的物质。但是，在大肠埃希氏菌中生产的蛋白质有时在菌体中形成不溶性颗粒，并且它们不进行糖基化，而这是真核生物中的特征。
对此，也进行了以真核生物酵母为宿主的系统的开发。酵母自古就用于酿造和面包制造，还曾进行生产用于饲料，其高安全性得到保证。另外，对其所产生的蛋白质进行糖基化也是其与原核生物相区别的特征。
除遗传学发现很丰富的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)外，在许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、Yarrowia属和假丝酵母属中也在开发宿主-载体系统(Nonconventional Yeasts in Biotechnology，Klaus Wolf著，Springer出版)。
在这些酵母中，有的即使是以直链烃链(正链烷)作为唯一的碳源也能生长。它们是假丝酵母属的麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)等，或多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、Yarrowialipolytica等。这些酵母具有氧化正链烷烃末端的酶系统，将氧化产生的长链羧酸通过过氧化物酶体β氧化系统分解成作为TCA循环基质的乙酰CoA，从而可以用作能量源。
利用正链烷烃的酵母不仅能以直链烃作为碳源而繁殖，而且对阻碍一般酵母繁殖的疏水性物质具有耐受性。因此，它们有望作为通过转化疏水性化学物质来产生有用物质的反应领域的宿主。因此，通过在这样的酵母中构建基因表达系统，可以不产生有害副产物、不浪费能量而构建新的有用化学物质生产体系。
在利用正链烷烃的酵母中，正在积极努力在麦芽糖假丝酵母中构建基因表达系统。M.Kawamura等人在麦芽糖假丝酵母中发现了导致高效率转化的区域(转化能力，以下简称为“TRA”)(M.Kawamura等，Gene，vol.24，157(1983))。已经揭示该区域包含在麦芽糖假丝酵母中参与自主复制的序列(自主复制序列，以下简称为“ARS”)和着丝粒序列(以下简称为“CEN”)。迄今为止，已经开发了包含整个TRA区域的低拷贝数载体和去除了CEN区域、有望高水平表达导入基因的高拷贝数载体(M.Ohkuma等，Mol.Gen.Genet.，vol.249，447(1995))。
在麦芽糖假丝酵母中，基因表达必需在该酵母中起作用的启动子，现在已经有多种可用于这方面的启动子。麦芽糖假丝酵母在链烷烃的存在下高水平地产生正链烷烃氧化系统的酶。特别是强有力地诱导编码参与链烷烃早期氧化的细胞色素P450的基因(以下简称为“ALK”)的转录(M.Ohokuma等，DNA and Cell Biology，vol.14，163(1995))，还诱导编码β氧化系统的基因的转录(Y.Masuda等，Gene，vol.167，157(1995))。ALK基因群中，ALK1基因的启动子被正链烷烃最强有力地诱导，可以用于基因表达。另外，在脂肪酸的存在下，适合使用ALK2或ALK5基因的启动子。
已知糖酵解途径中的磷酸甘油酸激酶(以下简称为“PGK”)的启动子在葡萄糖的存在下诱导强有力的基因表达。麦芽糖假丝酵母的PGK启动子已经被Y.Masuda克隆(Y.Masuda等，Curr.Genet.，vol.25，412(1994))。另外，在半乳糖的存在下具有强有力的基因表达诱导活性的GAL启动子也已经被克隆(S.M.Park等，Yeast，vol.13，21(1997))。如上克隆的ALK启动子、PGK启动子和GAL启动子可以用于麦芽糖假丝酵母中的基因表达。
然而，在利用葡萄糖等碳源时，ALK启动子几乎不起作用，而以脂肪酸或正链烷烃为碳源时，PGK启动子几乎不起作用。因此，在麦芽糖假丝酵母中适于生产有用物质的碳源不一定适于强有力的基因表达。并且，GAL启动子仅在以半乳糖作为碳源时被诱导，因此由于必须采用昂贵的半乳糖而不适于工业生产。
因此，为了在麦芽糖假丝酵母中高效地生产有用物质，亟待一种能不受碳源种类的限制而强有力地进行基因表达的新型启动子。
另一方面，在啤酒糖酵母中，醇脱氢酶1基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶3基因(以下简称为“GAP3”)、PGK和GAL等的启动子已经被克隆，并广泛用作表达外源基因的启动子。已经揭示在以啤酒糖酵母为宿主时，这些启动子的活性很强。因此，有望在以麦芽糖假丝酵母为宿主时也高水平地表达。但是，在麦芽糖假丝酵母中这些启动子区域的基因尚未被克隆，其克隆还处于等待之中。
但是，与啤酒糖酵母不同，假丝酵母属酵母尚未发现有性世代，它们大多具有二倍体基因组。另外，还有报告指出在遗传密码子的读取中存在异常。有报告指出，Candida cylindraceae(Y.Kawaguchi等，Nature，vol.341，164(1989))或麦芽糖假丝酵母(H.Sugiyama等，Yeast，vol.11，43(1995))将通常编码亮氨酸的CUG密码子读成丝氨酸。因此，可以说假丝酵母属酵母的性质与啤酒糖酵母大不相同，因此还不知道来自啤酒糖酵母的启动子区域在假丝酵母属酵母中是否具有同等的活性。
发明概述鉴于以上现状，本发明提供一种新型启动子，其在假丝酵母属酵母、特别是麦芽糖假丝酵母中中，可以不受碳源种类的影响而组成性地并且高效地生产有用物质。
本发明人经过悉心研究，结果首次鉴定了麦芽糖假丝酵母的肌动蛋白合成酶1基因(以下简称为“ACT1”)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶3基因(以下简称为“GAP3”)启动子、原生质膜质子ATPase 1基因(以下简称为“PMA1”)启动子和翻译延伸因子1基因(以下简称为“TEF1”)启动子的序列，发现这些启动子的活性等同或高于现有ALK启动子、PGK启动子和GAL启动子的活性，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及包含以下(a)～(d)中任意一项的DNA的ACT1基因启动子(a)SEQ ID NO9所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO9所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO9所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO9所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA；另外，本发明还涉及包含以下(a)～(d)中任意一项的DNA的GAP3基因启动子(a)SEQ ID NO10所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO10所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO10所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO10所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA；另外，本发明还涉及包含以下(a)～(d)中任意一项的DNA的PMA1基因启动子(a)SEQ ID NO11所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO11所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO11所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO11所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA；另外，本发明还涉及包含以下(a)～(d)中任意一项的DNA的TEF1基因启动子(a)SEQ ID NO12所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO12所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO12所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO12所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA；另外，本发明还涉及包含上述任意一项的启动子以及连接在该启动子序列下游的结构基因的DNA。
本发明还涉及包含上述DNA和终止子的基因表达单元。
本发明还涉及包含上述基因表达单元的质粒。
另外，本发明还涉及往宿主细胞中导入上述DNA或上述质粒所得的转化细胞。
另外，本发明还涉及3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚聚酯的生产方法，该方法包括培养下述转化细胞，该细胞中的结构基因来自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)，其编码参与3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚聚酯合成的酶。
发明详述来自麦芽糖假丝酵母的ACT1基因启动子、GAP3基因启动子、PMA1基因启动子和TEF1基因启动子是本发明首次鉴定的新型启动子。下面对其进行详细说明。
(1)新型启动子的克隆ACT1基因是参与合成构成细胞骨架的肌动蛋白的酶之一，GAP3基因是糖酵解系统的酶之一，PMA1基因是据说占糖酵母属中原生质膜蛋白的10％的原生质蛋白之一，TEF1基因是蛋白质合成中的翻译延伸因子之一，已知所有在啤酒糖酵母中对应的启动子都是强有力的启动子。
本发明中，为了通过杂交法克隆麦芽糖假丝酵母的ACT1基因、GAP3基因、PMA1基因和TEF1基因的启动子区域，首先通过PCR法从亲缘较近的啤酒糖酵母扩增相应的结构基因的部分DNA序列，将其用作探针片段。例如，已经报告了啤酒糖酵母的ACT1基因序列(Daniel，H.M.等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，vol.51，1593(2001))。可以从该序列合成啤酒糖酵母ACT1基因扩增用的PCR引物。啤酒糖酵母的GAP3结构基因序列已经被报告(Holland，M.J.等，J.Biol.Chem.，vol.254，5466(1979))，可以从该序列合成啤酒糖酵母GAP3基因扩增用的PCR引物。另外，Capieaux，E.等人已经报告了啤酒糖酵母的PMA1基因序列(J.Biol.Chem.，vol.264，7437(1989))，可以从该序列合成啤酒糖酵母PMA1结构基因扩增用的PCR引物。Cottrelle，P.等人已经报告了啤酒糖酵母的TEF1结构基因序列(J.Biol.Chem.，vol.260，3090(1985))，可以从该序列合成啤酒糖酵母TEF1结构基因扩增用的PCR引物。
啤酒糖酵母和麦芽糖假丝酵母的染色体DNA可以用市售的试剂来分离。以分离得到的啤酒糖酵母染色体DNA为PCR模板，用上述合成的引物进行PCR，由此可以扩增对应于各引物的啤酒糖酵母的ACT1、GAP3、PMA1和TEF1结构基因的一部分。将扩增过的DNA片段用放射性化合物或者碱性磷酸酯酶标记，以此作为杂交检测探针。
分离麦芽糖假丝酵母的染色体DNA，用适当的限制酶分段，并进行琼脂糖凝胶电泳，然后与上述检测探针进行Southern杂交，由此可以估计出包含各目的启动子序列的片段的长度。对于各启动子，用上述Southern杂交所用的限制酶切割麦芽糖假丝酵母的染色体，用克隆载体制作基因文库。转化该文库，使得在含有抗生素的琼脂培养基上出现适当数量的集落，然后在硝酸纤维素膜上培养，并将该膜进行碱变性处理，然后中和、洗涤并干燥后，进行杂交，由此可以克隆包含麦芽糖假丝酵母每一种目的启动子的染色体DNA片段。所得的DNA不仅包含启动子区域，还包含结构基因。因此，可以根据与相应已知启动子或结构基因的碱基序列(如啤酒糖酵母)的相似性(同源性)，采用常规方法鉴定启动子区域并将其与结构基因分离，由此确定启动子的碱基序列。
通过以上方法，可以获得本发明的新型ACT1基因启动子、GAP3基因启动子、PMA1基因启动子和TEF1基因启动子。这些启动子的碱基序列分别如SEQ ID NO9、10、11和12所示。
本发明的上述启动子可以通过上述方法获得，也可以在鉴定碱基序列后，通过化学合成获得。
本发明启动子不仅可以是上述SEQ ID NO9、10、11和12所示的DNA，也可以是包含上述碱基序列号中所示碱基序列的DNA，只要其具有启动子活性，还可以是包含在上述碱基序列号所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列的DNA，以及与上述碱基序列号中所述的碱基序列在严紧条件下杂交、来自假丝酵母属酵母的DNA。
包含上述碱基序列号中所示的碱基序列的DNA和包含在上述碱基序列号所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列的DNA，是指包含下述碱基序列的DNA，该碱基序列通过Protein，Nucleic Acid，Enzyme，Supplemental IssueGene Amplification PCR Technology TAKKAJ 35(17)，2951-3178(1990)或Henry A.Erlich(ed.)，PCR Technology(the translationedited by Ikunoshin Kato)(1990)等中记载的本领域技术人员公知的方法缺失、添加、插入和/或取代了可以进行缺失、添加、插入和/或取代的数量的碱基。
与上述碱基序列号中所示的碱基序列在严紧条件下杂交的DNA是指以包含上述序列号所示的碱基序列的DNA为探针，通过菌落杂交、蚀斑杂交或Southern杂交等方法获得的DNA。
本发明的DNA优选包含与上述碱基序列号所示的碱基序列具有80％或80％以上同源性的碱基序列，同源性优选为90％或90％以上，更优选95％或95％以上，进一步优选98％或98％以上。
“同源性”如下计算将待对比的两个碱基序列以最适方式排列，计数两个序列之间的配对碱基(A、T、C、G、U或I)位置数，用该数除以比较碱基总数，所得结果乘以100。具体地，可以用Hitachi Soft Engineering公司的DNASIS、Software Development公司的GENETYX或Finland CSC公司的Clustal X分析软件进行计算。
这些DNA可以通过以下方法容易地获得通过本领域技术人员公知的上述方法在上述碱基序列号所示的DNA中缺失、添加、插入和/或取代至少1个碱基，或通过根据Molecular Cloning，2nd Edition(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中记载的方法进行杂交来获得。
本发明中，“具有启动子活性”的启动子是指其通过后述功能分析测得的酶活性为上述碱基序列号中所示的DNA在相同条件下测定的酶活性的50％或50％以上、优选70％或70％以上、更优选80％或80％以上、进一步优选90％或90％以上、特别优选95％或95％以上的启动子。
(2)启动子功能的分析新型启动子的功能分析可以通过测定由该启动子转录的mRNA或由该mRNA翻译的基因产物的量来进行。
本发明的启动子在其下游连接结构基因时，可以表达该结构基因的功能。对本发明所用的结构基因没有特殊限制，例如，可以列举编码参与聚羟基链烷酸酯(特别是3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚酯P(3HB-co-3HH))合成的酶的基因、抗体基因、编码淋巴因子等有用蛋白质的基因等。
另外，如果需要，本发明的启动子、其下游连接的结构基因以及终止子可以用作基因表达单元。这里的终止子可以使用适当的公知终止子，只要其可以用于目的表达系统中。对所述终止子没有特别限制，可以列举ALK1、GCN4等。
另外，还可以将上述基因表达单元插入到质粒中使用。本发明所用的质粒没有特殊限制，可以列举pUTU1、pBTH10B(Nakazawa，等，J.Bacteriol.，vol.179，5030(1997))。
本发明中，可以将上述质粒转化到构成表达系统的宿主细胞中制备转化细胞，培养该转化细胞，使转化的结构基因表达。另外，也可以不导入质粒，而将包含本发明启动子及其下游连接的结构基因的DNA直接整合到宿主染色体中。这里所用的宿主没有特别限制，只要本发明的启动子能在其中发挥作用，但优选假丝酵母属酵母，特别优选麦芽糖假丝酵母。
可以按照公知的方法用本发明的质粒转化宿主细胞，例如可以采用钙法(E.M.Lederberg等，J.Bacteriol.，vol.119，1072(1974))或电穿孔法(CurrentProtocols in Molecular Biology，vol.1，para.1.8.4，1994)。另外，可以利用FastTrackTM-Yeast Transformation Kit SM(Geno Technology)等市售的转化试剂盒。
用所得的转化体来分析新型启动子的功能可以通过将该转化体用其可以利用的碳源进行培养来进行。培养时，可以用加入了碳源的YPD培养基(酵母提取物1％、聚胨2％)、YNB培养基(Yeast nitrogen base 0.67％)等通常用于培养转化体培养所用的培养基。另外，还可以用完全合成的培养基等。本发明所用的碳源没有特别限制，可以用例如葡萄糖、麦芽糖等糖类，正链烷烃、脂肪酸和油脂等。对培养温度、培养时间没有特殊限制，只要适合于转化体的生长，但优选在10～40℃培养2～72小时。培养完毕的细胞通过分析培养液或细胞内的蛋白质来分析启动子的功能。由连接在启动子下游的基因表达的酶等表达在细胞外时，不必将细胞破碎，但当该酶留在细胞内时，则必须将细胞进行处理。进行细胞处理的方法没有特别限制，可以用Zymolyase等细胞壁溶解酶将细胞消化后，通过超声处理或冻融法等进行。另外，也可以用玻璃珠进行直接的物理性破碎。
启动子的功能分析可以通过以下方法进行，该方法能够特异性地检测出由启动子下游连接的基因表达的酶等的活性或量。对分析方法没有特殊限制，例如，可以用(1)中克隆的各启动子区域，构建下述基因的表达载体，该基因编码参与3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚聚酯P(3HB-co-3HH)合成的酶，此酶来自豚鼠气单胞菌(以下简称为“ORF2S”)，然后通过以下文献方法(Valentin，H.E.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，vol.40，699(1994))测定该酶的活性。具体地，用ORF2S测定启动子的活性时，通过将ORF2S掺入(R)-3-羟基丁基-CoA得到游离的CoA-SH，将其以等摩尔比与DTNB(5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸))反应，同时测定与游离CoA-SH以等摩尔比反应所生成的离子化TNB(2-硝基-5-巯基苯甲酸)在单位时间内在约412nm的吸光度的增加，由此可以简便地测定酶活性。
所得的酶活性值用酶活性测定中所用的细胞破碎溶液中的蛋白量进行标准化，可以将所得的酶活性值计为通过本发明启动子表达的酶比活性，由此可以相互比较启动子的活性。
本发明的启动子中，ACT1基因启动子、PMA1基因启动子和TEF1基因启动子都是生长繁殖所必需的基因的启动子，因此，其不受碳源种类的限制，只要在麦芽糖假丝酵母可以生长繁殖的条件下就可以起作用。另外，GAP3基因启动子是糖酵解体系中的酶的启动子，特别是在以葡萄糖作为碳源时有望强表达，从这点讲，其具有任何公知启动子所不具有的性质。
本发明的生产方法中，可以通过培养上述转化细胞来生产上述共聚聚酯，该转化细胞的结构基因是来自豚鼠气单胞菌的基因，它编码参与3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚聚酯的合成的酶。
此培养所用的碳源可以是任何一种碳源，只要转化体可以利用。另外，可以使用含有碳源以外的营养源例如氮源、无机盐类或其他有机营养源的培养基。培养温度只要是该细胞可以生长繁殖的温度即可，优选20～40℃。对培养时间没有特殊限制，可以是1～7天左右。然后，可以从所得的培养细胞或培养物中回收聚酯。
碳源可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖等碳水化合物、油脂类、脂肪酸类以及正石蜡烃等。油脂可以列举例如菜籽油、椰子油、棕榈油和棕榈仁油等。脂肪酸可以列举己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、豆蔻酸等饱和或不饱和脂肪酸，或这些脂肪酸的酯或盐等脂肪酸衍生物。作为一例，在麦芽糖假丝酵母的培养中，可以用油脂作为碳源进行培养。在不能利用或不能有效利用油脂的转化体的情况中，可以往培养基中加入脂肪酶来改善利用效率。另外，可以通过转化脂肪酶基因赋予油脂利用能力。
氮源可以列举例如氨，氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐，蛋白胨、肉浸膏、酵母提取物等。作为无机盐，可以列举磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁和氯化钠等。
其它的有机营养源可以列举氨基酸类(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等)、维生素(例如维生素B1、维生素B12、生物素、烟酰胺、泛酸、维生素C等)等。
本发明中，可以用如下的方法从细胞中回收聚酯，例如，在培养结束后，用离心分离器从培养液中分离细胞，用蒸馏水和甲醇等将所得细胞洗涤，然后干燥。用氯仿等有机溶剂从所得的干燥细胞中提取聚酯。将包含聚酯的有机溶剂溶液通过过滤等除去细胞，往滤液中加入甲醇和己烷等不良溶剂使聚酯沉淀。通过过滤或离心分离除去上清液，将沉淀的聚酯干燥，从而可以回收聚酯。
附图简述
图1表示实施例9中用于构建质粒的质粒pUAL-ORF2S的限制性图谱。
图2表示实施例9～13中用于构建质粒的质粒pSTV-ALK1-ORF2S的限制性图谱。
图3表示实施例9～13中用于构建质粒的质粒pUTA1的限制性图谱。
图4表示实施例9中构建的质粒pUTA-ALK1-ORF2S的限制性图谱。
图5表示实施例10中构建的、作为本发明一个实施方案的质粒pUTA-ACT1-ORF2S的限制性图谱。
图6表示实施例11中构建的、作为本发明一个实施方案的质粒pUTA-GAP3-ORF2S的限制性图谱。
图7表示实施例12中构建的、作为本发明一个实施方案的质粒pUTA-PMA1-ORF2S的限制性图谱。
图8表示实施例13中构建的、作为本发明一个实施方案的质粒pUTA-TEF1-ORF2S的限制性图谱。
发明的最佳实施方案下面通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
(实施例1)酵母染色体DNA的制备用E.Z.N.A.Yeast DNA试剂盒(OMEGA BIOTEK公司)制备啤酒糖酵母和麦芽糖假丝酵母的染色体DNA，制备方法如该试剂盒中随附的说明书所述。
(实施例2)啤酒糖酵母的ACT1、GAP3、PMA1和TEF1基因片段的扩增按照下述方法扩增碱基序列已知的啤酒糖酵母ACT1、GAP3、PMA1和TEF1基因片段以实施例1中制备的啤酒糖酵母染色体DNA为模板，用SEQ ID NO1和2(对于ACT1)、SEQ ID NO3和4(对于GAP3)、SEQ IDNO5和6(对于PMA1)以及SEQ ID NO7和8(对于TEF1)所示的合成DNA作为引物，用TaKaRa Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)通过PCR扩增。所采用的条件如所述试剂盒中随附的说明书所述。具体地，往模板DNA 1μg、最终浓度分别为1μM的两种引物、2.5U的ExTaq聚合酶、附带的缓冲剂0.01ml和附带的dNTP混合液0.008ml中加水至体积为0.1ml，然后将其进行PCR25个循环(每个循环包括98℃15秒、55℃1分钟、72℃1分钟)，由此扩增啤酒糖酵母约400bp的ACT1基因片段、或约1kb的GAP3基因片段、或约2.8kb的PMA1基因片段、或约1.5kb的TEF1基因片段。
(实施例3)标记探针片段的制备、杂交、洗涤和阳性克隆的检测将扩增后的各探针片段用Amersham-Pharmacia公司的Gene imagesAlkPhos试剂盒根据随附的说明书用碱性磷酸酯酶标记。
杂交用Amersham-Pharmacia公司的Gene images AlkPhos试剂盒根据随附的说明书在55℃过夜进行。
洗涤用Amersham-Pharmacia公司的Gene images AlkPhos试剂盒根据随附的说明书在55℃和室温进行。
阳性克隆的检测用Amersham-Pharmacia公司的CDP-Star试剂盒根据随附的说明书进行。
(实施例4)麦芽糖假丝酵母ACT1基因启动子区域的克隆将实施例1中制备的麦芽糖假丝酵母染色体DNA用限制酶BglII切断，在琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶提取约1kb～3kb的片段，将所述片段连接到用限制酶BamHI处理过的pUC19，然后转化大肠埃希氏菌DH5α菌株。将约3,000株转化株以用碱性磷酸酯酶标记的啤酒糖酵母ACT1基因片段作为探针进行杂交，结果得到6株阳性克隆，确定插入片段的部分碱基序列，结果发现是含有麦芽糖假丝酵母ACT1启动子区域的基因。克隆片段的一部分序列如SEQ ID NO9所示。
(实施例5)麦芽糖假丝酵母GAP3基因启动子区域的克隆将实施例1中制备的麦芽糖假丝酵母染色体DNA用限制酶EcoRI切断，在琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶提取约7kb～9kb的片段，将所述片段连接到用相同限制酶处理过的pUC19，然后转化大肠埃希氏菌DH5α菌株。将约2,000株转化株以用碱性磷酸酯酶标记的啤酒糖酵母GAP3基因片段作为探针进行杂交，结果得到2株阳性克隆，确定插入片段的部分碱基序列，结果发现是含有麦芽糖假丝酵母GAP3启动子区域的基因。克隆片段的一部分序列如SEQ ID NO10所示。
(实施例6)麦芽糖假丝酵母PMA1基因启动子区域的克隆将实施例1中制备的麦芽糖假丝酵母染色体DNA用限制酶XbaI切断，在琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶提取约2kb～4kb的片段，将所述片段连接到用相同限制酶处理过的pUC19，然后转化大肠埃希氏菌DH5α菌株。将约5,000株转化株以用碱性磷酸酯酶标记的啤酒糖酵母PMA1基因片段作为探针进行杂交，结果得到5株阳性克隆，确定插入片段的部分碱基序列，结果发现是SEQ ID NO11所示的含有麦芽糖假丝酵母PMA1启动子区域的基因。
(实施例7)麦芽糖假丝酵母TEF1基因启动子区域的克隆将实施例1中制备的麦芽糖假丝酵母染色体DNA用限制酶EcoRI和PstI切断，在琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶提取约2kb～4kb的片段，将所述片段连接到用相同限制酶处理过的pUC19，然后转化大肠埃希氏菌DH5α菌株。将约400株转化株以用碱性磷酸酯酶标记的啤酒糖酵母TEF1基因片段作为探针进行杂交，结果得到7株阳性克隆，确定插入片段的部分碱基序列，结果发现是SEQ ID NO12所示的含有麦芽糖假丝酵母TEF1启动子区域的基因。
(实施例8)参与聚酯合成的基因的合成以来自豚鼠气单胞菌的聚羟基链烷酸酯(PHA)合成酶(T.Fukui，等，FEMS Microbiology Letters，vol.170，69(1999))的氨基酸序列为基础合成参与聚酯合成的酶基因。由于麦芽糖假丝酵母是将CTG密码子翻译成丝氨酸而不是亮氨酸的酵母，因此没有将CTG指定为亮氨酸密码子。各氨基酸相应的密码子优先选择在麦芽糖假丝酵母中使用频率高的密码子。密码子的使用频率参考Klaus Wolf著的“Nonconventional Yeasts in Biotechnology”(Springer出版)。如上设计PHA合成酶基因(以下简称为“ORF2S”，SEQ IDNO13)，并完全合成ORF2S基因部分。
(实施例9)用麦芽糖假丝酵母ALK1启动子构建ORF2S表达载体为了使上述ORF2S在麦芽糖假丝酵母中表达，在5’上游连接麦芽糖假丝酵母Alk1基因的启动子ALK1p(SEQ ID NO15)，并在3’下游连接麦芽糖假丝酵母Alk1基因的终止子ALK1t(SEQ ID NO14)。用于将启动子和终止子与结构基因连接的限制酶位点通过PCR法制备。对于启动子部分，以SEQ ID NO15所示的启动子为模板，用SEQ ID NO16和SEQ ID NO17所示的DNA进行PCR，制备在5’末端具有PvuII位点、3’末端具有EcoRI位点的ALK1p片段。对于终止子部分，以SEQ ID NO14所示的终止子为模板，用SEQ ID NO18和SEQ ID NO19所示的DNA进行PCR，制备在5’末端具有HindIII位点、3’末端具有EcoRV位点的ALK1t片段。将上述ALK1p片段连接到pUCNT(公开于WO 94/03613)的PvuII-EcoRI位点，ALK1t片段连接到pUCNT的HindIII-SspI位点，由此构建pUAL1。然后在pUAL1的NdeI-PstI位点结合ORF2S片段，构建质粒pUAL-ORF2S(图1)。接着将该质粒用SalI进行部分切割，用XhoI接头(Takara Shuzo)将SalI位点转变成XhoI位点。这样修饰过的质粒一旦被PvuI和PvuII切割，就与pSTV28(Takara Shuzo)的PvuI和SmaI片段连接，由此构建如图2所示的pSTV-ALK1ORF2S。
进一步地，使用pUTA1载体(图3)，该载体的标记基因已经用pUTU1(M.Ohkuma等，J.Biol.Chem.，vol.273，3948(1998))和麦芽糖假丝酵母ADE1基因(Genebank D00855)由尿嘧啶变成腺嘌呤。该载体的构建如下进行用XhoI从pUTU1消除URA3基因，用SalI将切出的ADE1基因片段连接到剩余部分。
用EcoT22I切割pSTV-ALK1-ORF2S，制备包含启动子、ORF2S和终止子的片段，并将其插入pUTA1的PstI位点，由此构建图4所示的pUTA-ALK1-ORF2S。
(实施例10)用麦芽糖假丝酵母ACT1启动子构建ORF2S表达载体用实施例4中克隆的麦芽糖假丝酵母ACT1启动子区域按照下述方法构建ORF2S表达载体。用SEQ ID NO20和21所示的合成DNA作为引物，以包含麦芽糖假丝酵母ACT1启动子区域的片段(SEQ ID NO9)为模板进行PCR，得到5’-末端具有EcoT22I限制酶位点、3’-末端具有NdeI限制酶位点的片段，并用EcoT22I和NdeI处理该片段。将实施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S用EcoT22I和NdeI同法处理，制备不含ALK启动子的片段。将上述两个片段进行连接，构建pSTV-ACT1-ORF2S。用EcoT22I限制酶处理该质粒，制备ACT1-ORF2S片段。将该片段插入实施例9中所得的pUTA1的PstI位点，由此构建图5所示的pUTA-ACT1-ORF2S表达载体。
(实施例11)用麦芽糖假丝酵母GAP3启动子构建ORF2S表达载体用实施例5中克隆的麦芽糖假丝酵母GAP3启动子按照下述方法构建ORF2S表达载体。用SEQ ID NO22和23所示的合成DNA作为引物，以包含麦芽糖假丝酵母GAP3启动子区域的片段(SEQ ID NO10)为模板进行PCR，得到5’-末端具有XhoI限制酶位点、3’-末端具有NdeI限制酶位点的片段，并用XhoI和NdeI处理该片段。将实施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S用XhoI和NdeI同法处理，制备并不含ALK启动子的片段。将上述两个片段进行连接，构建pSTV-GAP3-ORF2S。用限制酶XhoI和SalI处理该质粒，制备GAP3-ORF2S片段。用SalI处理实施例9中所得的pUTA1质粒，并将所得的两个片段进行连接，由此构建图6所示的pUTA-GAP3-ORF2S表达载体。
(实施例12)用麦芽糖假丝酵母PMA1启动子构建ORF2S表达载体用实施例6中克隆的麦芽糖假丝酵母PMA1启动子按照下述方法构建ORF2S表达载体。用SEQ ID NO24和25所示的合成DNA作为引物，以包含麦芽糖假丝酵母PMA1启动子区域的片段(SEQ ID NO11)为模板进行PCR，得到5’-末端具有XhoI限制酶位点、3’-末端具有NdeI限制酶位点的片段，并用XhoI和NdeI处理该片段。将实施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S质粒用XhoI和NdeI同法处理，制备不含ALK启动子的片段。将上述两个片段进行连接，构建pSTV-PMA1-ORF2S。用限制酶XhoI和SalI处理该质粒，制备PMA1-ORF2S片段。用SalI处理实施例9中所得的pUTA1质粒，并将所得的两个片段进行连接，由此构建图7所示的pUTA-PMA1-ORF2S表达载体。
(实施例13)用麦芽糖假丝酵母TEF1启动子构建ORF2S表达载体用实施例7中克隆的麦芽糖假丝酵母TEF1启动子按照下述方法构建ORF2S表达载体。用SEQ ID NO26和27所示的合成DNA作为引物，以包含麦芽糖假丝酵母TEF1启动子区域的片段(SEQ ID NO12)为模板进行PCR，得到5’-末端具有XhoI限制酶位点、3’-末端具有NdeI限制酶位点的片段，并用XhoI和NdeI处理该片段。将实施例9中得到的pSTV-ALK1-ORF2S质粒用XhoI和NdeI同法处理，制备不含ALK启动子的片段。将上述两个片段进行连接，构建pSTV-TEF1-ORF2S。用限制酶XhoI和SalI处理该质粒，制备TEF1-ORF2S片段。用SalI处理实施例9中所得的pUTA1质粒，并将所得的两个片段进行连接，由此构建图8所示的pUTA-TEF1-ORF2S表达载体。
(实施例14)麦芽糖假丝酵母转化株的分离用电穿孔法转化麦芽糖假丝酵母AC16株(根据布达佩斯条约委托保藏，国际保藏局独立行政法人产业技术综合研究所特许生物委托保藏中心(1-1-3 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏日为2000年11月15日，保藏号为FERM BP-7366)。将用YPD培养基在30℃过夜培养过的培养液1ml接种到装入了相同培养基100ml的500ml Sakaguchi烧瓶中，在30℃培养7小时。以3,000rpm在室温离心10分钟后，用冰冷却的1M山梨糖醇溶液约50ml洗涤，共3次。将细胞悬浮到3ml相同的溶液中，将悬浮液分成0.1ml每份，并在80℃保存，作为转化用细胞。基因转化时用ECM 600M(BTX)。具体地，将0.1ml待转化的细胞和约1μg实施例9～13中构建的任意一种表达载体装入具有2mm宽的空隙的小试管中，在模式2.5kV、电压1.9kV和电阻246Ω的条件下进行电穿孔，然后立即冰冷却，加入0.5ml的1M山梨糖醇，并在室温保温1小时，然后于30℃在YNB选择板上培养。选择板用没有氨基酸的0.67w/v％Yeast Nitrogen Base(Difco)、2w/v％葡萄糖和2w/v％Bacto Agar(Difco)。
通过上述制备，得到包含实施例9～13中构建的表达载体的5种转化体。
(实施例15)启动子功能的分析将实施例14中得到的转化株用没有氨基酸的0.67w/v％Yeast NitrogenBase(Difco)和2w/v％葡萄糖过夜预培养后，将2.5ml预培养物接种到装入了50ml相同培养基的500ml Sakaguchi烧瓶中，在30℃培养24小时。仅在作为比较例的由ALK1启动子制备的表达载体的培养中，用2w/v％的正十二烷作为碳源。将相当于约10ml的培养液以3,000rpm在室温离心10分钟，然后用生理盐水洗涤，并在相同条件下再次离心。将细胞悬浮在1ml 0.5M的磷酸钾溶液(pH＝7.2)中，将悬浮液与等量的酵母破碎用玻璃珠(0.45mm，Biospec Products)混合，用Mini Bead Beater(Biospec Products)处理5次，每次1分钟，使细胞破碎，然后用台式离心机以3,000g离心分离10秒，回收上清作为测定ORF2S活性的样品。用该样品和Protein Assay试剂盒(BioRad)测定蛋白浓度，并按照Valentin，H.E.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，vol.40，699(1994)所述的测定酶活性。
具体地，将包含0.01ml细胞破碎液和7mg/ml(R)-3-羟基丁基-CoA(Sigma)的水溶液0.01213ml和溶于0.5M磷酸钾溶液(pH 7.2)的3.8mg/ml的DTNB(Sigma)0.04ml混合到0.338ml水中，在室温测定所得混合物在412nm处5分钟内的吸光度变化。吸光度的测定采用岛津制作所的分光光度计进行。根据下式计算活性活性(U/ml)＝ΔA412/min×103×VT/ε412×VE。
在上式中，ΔA412/min表示每分钟的吸光度增加量，VT表示反应液的量(ml)，ε412为15.6×103(M-1·cm-1)，VE表示酶液量(ml)。
用上述文献和下式所示的比活性(U/mg)来表示所述酶活性比活性(U/mg)＝活性(U/ml)/蛋白浓度(mg/ml)。
所得结果如表1所示，由该结果可知，根据本发明克隆的ACT1、GAP3、PMA1和TEF1启动子区域是在麦芽糖假丝酵母细胞中与ALK1启动子同等或较之更高效地发挥作用的启动子。
表1
产业适应性根据本发明，可以在假丝酵母，特别是麦芽糖假丝酵母中高效地表达有用的基因。
序列表<110>钟渊化学工业株式会社(KANEKA CORPORATION)<120>新的启动子<130>T747.SBP-7<150>JP 2002-105240<151>2002-4-18<160>27<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-ACT1 5′的PCR引物<400>1ccggaattca tggattctgg tatgttcta 29<210>2<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-ACT1 3′的PCR引物<400>2ccggaattca agacagcacg aggagcgtc 29<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-GAP3 5′的PCR引物<400>3atgatcagaa ttgctattaa cggtttcggt 30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-GAP3 3′的PCR引物
<400>4ttaagccttg gcaacatatt cgatcaagt 29<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-PMA1 5′的PCR引物<400>5atgactgata catcatcctc ttcatcatcc 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-PMA1 3′的PCR引物<400>6ttaggtttcc ttttcgtgtt gagtagagac 30
<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-TEF1 5’的PCR引物<400>7atgggtaaag agaagtctca cattaacgtt 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Sc-TEF1 3’的PCR引物<400>8ttatttctta gcagcctttt gagcagcctt 30<210>9<211>1300<212>DNA
<213>Candida maltosa<220>
<223>Cm-ACT1启动子<400>9gatctcggct gtgaatcgca atttgccatg acacctctcg ctatttccga attacataag 60accatcagtg aaagattgga gagaaaaaaa tgtgaacaga atagtcggag tttatattaa 120attcatcgtc caaaaaaacc tgaatatcat tggctctgcg gtttattaaa aagtgtaccg 180ccgacttatc cgaacaatta aacgtaacat gactgcaaaa aaaaaccatg aagaaaacat 240ttacaaaata tttgtaatat cgtcgaagat aataaaccat accagacgga aagttggatg 300aaattgttgc aaaaataatt atgctactcg ttctcacgtt taaatataca cgtagatcaa 360accagcaaac ttctataaat tgccatcgat ccaccaaaca tcgtcaaaaa caattttgta 420actttattgc ctctcatacg tttaaatttc aaaatcaata aatattaatc aaccgtgtaa 480caaaaaaaaa aaactgagat agtgcacagc ccaaaaaggt ttagtgattg cctccaaaca 540tacataatag gttatttttt tcgttgaacg catttcttgc tcgctcaccg aatttctgcc 600aacgaaacaa attttatata tttcattttt ttctctttca tgtaattttt tctttctttc 660tgctttttct tttttttttc ttttccttcc caatcccccc ctacattaat atattaatta 720tcatttaaaa tggacggtgg tatgtttaaa ctatttcatt gacttgattg atcgattgat 780tgattggttg atttcttcaa agcacggact ttttttcttt ctccattatt tgatttttag 840attttgggtg atttttttgt tttttttggg gagtgactga tctaatctca attcaggatt 900atgggacgaa gaagaatcga gagatggaat ctagatatat caatttcaat ttttattgtt 960ttgatctcga gagtatttat ggaaagattt gattgaacaa cttttttttt cattggcctg 1020gatcaattcc gtccataaaa gaaagagagc tttacactga tcgattcatt catatttttt 1080acactggagt ttcttcaaaa atcattggat tctacccaat ggcaatccta catcttaaaa 1140atcatcattt attacgagtt tattggataa tggtcacttt aaattcttgg tatcttgaat 1200ttgttttttt tttttttttt tttcagaaat ttgtaccccc ttttaaaaat gttcagaatt 1260tttttttttt tttcgtcaaa cccacacaca cacatttttc 1300
<210>10<211>3000<212>DNA<213>Candida maltosa<220>
<223>Cm-GAP3启动子<400>10ctgcaggtgg gatcttcaga ctgtttaata tttcttcaat atgatgggtc ccataattag 60aaaccccaat actcttaaca atccccttgg acacggcttc ttccatgact ttccaacttt 120ccaatcgttt ttgtttccca ggtaatggtg aatggatcaa taacaaatcg atatatttca 180aatcaccaat ttgatccaac atagtagtga tcgcatgtct tgtatttgtt gtacccaatt 240gactattcca tagtttggtg gtatagaaaa actctgaacg agggatatct ggattatcgt 300gaaggaattt cgttatccct tctgccactt cttcttcgtt gccgtacaaa actgcggtat 360caaaatgtcg atatccgact ttacaggctt cgtagacaat gctggccgtt ttatttcttg 420gaatgtcgta acagcctaaa ccgattgaag ggatgctata tccggaattg agtttgatta 480atcgaaatga catgattgtg ttgagtatat tgaaagcaat aattaatata aaaaaaagag 540gaacgaaaaa aaagagagat gttgaagtgg ttgggttatg taagtacgta tttattcact 600gattattaat tgctatctta ataatatttt tttccctccc atttttactt tttttggata 660tcttgtttga aatgtggggg caaaaaaaaa aaaaatttac atagccctat tccataaaat 720ataaatcttt tatgtatatt tgcaacatcg acacaatttg atatttccaa atactccagg 780tttttttttc tttttcattc acagtctcgg gattaagtgt gaaacccggg ggaaatcgaa 840attttttttt ttcagcattg tttatacaca atttcagttt gtccgaatac acccgcacgt 900gattccccca aacaggcaaa aaaaaaaaaa aatgaatata tagtgagtac gtgtcccgcg 960gctcaggaac ctcttttttt tttagaggtg gtatgatgtg aagtattttt tttttttcct 1020
ttttcctttt cctttttcat tcacaccacc accatataga atttacttac gtcaggttat 1080attctagaca acctttgtgg tttttttttt taaagggaat ttgagccact atgtccatag 1140aaaacttttt actgtaacga aaatctatag tctgagataa aggggaaaat ggtaaccacg 1200tattttttta tttttttttg gattcctata accccgatat ttatgttcgg aattgtagat 1260atatagatat tccagattac ttggctgtaa tgtaggctat ggaaatgata ctactcatca 1320atataaaccc attgacagta taagatagat aattatactg tggtggtacc atataaaatt 1380aatatgttga tcaggtgctt ttggcaacac cacgagcttt gcgcaagttt tttttttttg 1440ttcttttttg ttttttgttg gttgtttgat gcaaatggat gataatgccc cgggcgcggg 1500cgtgtgtgac gcaaatccaa tagaaaaaat tcacctggtt aaacctattt tcactgacaa 1560atcaatttat tttgccaaaa gaaaaaaaga atatataata acccttgaat gtccaattgg 1620aatttttttt ctctttctaa aatttttctt tctttctttc ttttcttctt cttttcttct 1680ttacacaatc aattgacttt aaacctcaat taaacaacac ataactttca aacttacttt 1740ttaacataca aaaaatggct attaaaattg gtattaacgg tttcggtaga atcggtagat 1800tagtcttgag aattgcttta ggcagaaaag acattgaagt tgttgccgtc aacgatccat 1860tcattgctgc tgattacgct gcttacatgt tcaaatacga ttccacccac ggtagataca 1920aaggtgaagt caaatctgaa ggtaacgatt tagtcattga cggtaagaaa atccaagtct 1980tccaagaaag agacccagct aacattccat ggggtaaaga aggtgttgaa tatgttattg 2040actccactgg tgttttcacc aagattgaag gtgctcaaaa acacattgat gctggtgcca 2100aaaaagttat catcactggt tcatctgctg atgctccaat gttcgttgtt ggtgttaacg 2160aagacaaata caccccagac ttgaaaatca tttctaacgc ttcctgtacc actaactgtt 2220tagctccatt agctaaagtt atcaacgata ctttcggaat tgaagaaggt ttgatgacca 2280ctgtccactc catcactgct acccaaaaga ctgttgacgg tccttcccac aaagattgga 2340gaggtggtag aactgcttcc ggtaacatta tcccatcttc tactggtgct gctaaagccg 2400tcggtaaagt tatcccagaa ttaaacggta aattgactgg tatgtctttg agagttccaa 2460ccaccgatgt ctccgttgtt gacttgactg tcagattatc taaaccaacc acttacgaag 2520aaatctctga agctatcaag aaagctgctg atggtccatt gaacggaatc ttgggttaca 2580ctgaagatgc tgttgtctct actgacttct tgtcttctaa ctactcttct gttttcgatg 2640ctaaagctgg tatcttgttg tccccaactt tcgtcaaatt gatctcttgg tacgataacg 2700
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<223>Cm-PMA1启动子<400>11tctagaattt atattggttt ctttcttttt ttttagatcg tttattaatt aattagttaa 60ttaattactt cataacatgt aaattagatt taaccaaaaa aaagaaaagt taaagataat 120ggctaagtag atgttaaagc caggttcaat tgtttataat actcatcatc atcaatcaat 180taaattgcaa aaacaaacaa acccgttgaa aaaaggaaag aaaaaaaaaa cacggctggt 240aataaatctt tcatgtactg gtcaattaat taaccgacgt aataagagat ccttggataa 300atagtaagaa tatccagcaa tttacgtacg taaatgaaac acaaatgaat gaatgctgaa 360ctttcatgac ttaattgagt agtttagttg gttggtatat gcgaaattta tttattccga 420taattattat caataggttg tagcgggaaa tttaaaacca aacaggagat tagaagcggc 480agaatgaaat aaaaaaaaac atggccggcg aaaaaaaaaa ggaaaaaaag gaaggaaaaa 540aaaacgaaaa agggtcgggt aaatctactc aacaaatatt ataataatga ttgtttattt 600atctatggat gtttggatga attaagtcaa gtttgtgtta tttcgtatga aagagacata 660gttagagata gagatagata gacaaataga tttgagagat gaggtggttc agttacatta 720
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<223>Cm-TEF1启动子<400>12ctgcagcagc ttctactgct gccgctccaa cattaggtgc tgaatatact agcggtactg 60gtaaattagt tggtgtggtt acattgactg atattttggg attatttgcc acatcaaaag 120gtagaagaac tgatccacaa gctgcaagaa accaaagaag aagaagttcc acttccacta 180cgagatcatc tgttgatagt gcattaaacg ctgaaggtgt gattaatcct tctgccacca 240
ccaccaccga tgccattcct ggtaataaca attctagtcg tagagaaagt gttgatgctt 300caagtgatgt tttcagaaaa tcatttacta aaccccaaga aaatgtattt tccaaagagt 360aagggttcct tctttcataa caaaaaaaga aaaacaatca ccgatttatt tatttatttg 420caatgctatt tataatatat tttgtagata aaaacaaatg aaaaatcttg ttagctatgt 480atactactac atatatacta caataaaaac acaccaaaat gaaacgtgtt ttgcacaatt 540tcgcacgact cagaggcatc gcatttctgt cctttttgta cgtcattgta atttttttta 600tgttattttt tttacagcaa gcaatccaaa aaaacaaaaa aaaaatgaga gagaaaaaaa 660tgagggggtt gatttaaaaa gatggtcaaa aatattcgtg acatattaca taatcgatga 720gtttgatatg gaacgaatat tgatggtttt ggtctgaatt gatatggtgt aagtatttgt 780tggtgataat tttatcaaca taaactcaat tccgctcaat tgtacaaaat tgaccttctt 840tcgccttttg ttcaatgcca ttttttccaa taattttttt tttcaaattt tgccatccag 900cacaaagaaa aaaaaaattt acatgtccga caactcaccg gtgtttctga caacaattga 960caacaccagt ctgtagaccc aattggtaag tcaatgataa ctactacatc tacctagttg 1020ttatctttta acttaaaatt agcaaagaaa taataatggt tatcattgaa gatggtttca 1080caaaattaaa cgaatacgtg tacgttttac caaaaagatt tttttttttc tctttagttt 1140ttttttcgtt gttcttccca tcactgaaaa atttttctcc ctctatataa atcaatccca 1200tcaacgaaaa ttttttttct tcctttttga attttttttt tctccttttt ttttctcctt 1260tttttttctc cttttctttc ttcatctaac ttatatttaa tcaatcatgg gtaaagaaaa 1320aactcacgtt aacgtcgttg ttattggtca cgtcgattct ggtaaatcta ctaccaccgg 1380tcacttgatc tacaagtgtg gtggtattga caaaagaacc attgaaaaat tcgaaaaaga 1440agctgctgaa ttaggtaaag gttctttcaa atacgcttgg gtcttggata aattgaaggc 1500tgaaagagaa agaggtatca ccattgatat cgctttgtgg aaattcgaaa ctccaaaata 1560ccacgttacc gttattgatg ctccaggtca cagagatttc atcaaaaata tgattactgg 1620tacttctcaa gctgattgtg ctattttgat tattgctggt ggtactggtg aattc 1675<210>13<211>1794
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ORF2S<400>13atg tct caa cca tct tat ggt cca ttg ttc gaa gct ttg gct cat tac48aat gat aaa ttg ttg gct atg gct aaa gct caa acc gaa aga act gct96caa gcc ttg ttg caa act aac ttg gat gat ttg ggt caa gtt ttg gaa144caa ggt tct caa caa cca tgg caa ttg att caa gct caa atg aat tgg192tgg caa gat caa tta aaa ttg atg caa cac act ttg tta aaa tct gct240ggt caa cca tct gaa cca gtt att act cca gaa aga tct gat aga aga288ttt aaa gct gaa gct tgg tct gaa caa cca att tat gat tac tta aaa336caa tcc tat ttg tta act gct aga cat ttg ttg gct tct gtt gat gct384ttg gaa ggt gtc cca caa aaa tct aga gaa aga ttg aga ttc ttt act432aga caa tac gtc aac gct atg gct cca tct aat ttc ttg gct act aac480cca gaa ttg tta aaa ttg act ttg gaa tcc gat ggt caa aat ttg gtt528aga ggt ttg gct tta ttg gct gaa gat ttg gaa aga tct gct gat caa576tta aac att aga ttg act gat gaa tcc gct ttt gaa tta ggt aga gat624ttg gct ttg act cca ggt aga gtt gtt caa aga act gaa tta tat gaa672tta att caa tac tct cca act act gaa acc gtt ggt aaa acc cca gtt720ttg atc gtt cca cca ttc att aat aaa tat tac att atg gat atg aga768cca caa aac tcc ttg gtc gct tgg ttg gtc gct caa ggt caa acc gtt816ttc atg att tcc tgg aga aac cca ggt gtt gct caa gct caa att gat864tta gat gat tat gtt gtt gat ggt gtc att gct gct ttg gat ggt gtt912gaa gcc gct act ggt gaa aga gaa gtt cac ggt att ggt tac tgt att960ggt ggt acc gct ttg tct tta gct atg ggt tgg ttg gcc gcc aga aga1008
caa aaa caa aga gtt aga act gct act ttg ttt act act ttg ttg gat 1056ttc tcc caa cca ggt gaa ttg ggt att ttt att cat gaa cca att atc 1104gcc gcc tta gaa gcc caa aat gaa gct aaa ggt att atg gat ggt aga 1152caa ttg gcc gtc tcc ttc tct ttg ttg aga gaa aac tct tta tat tgg 1200aat tac tat att gat tct tac tta aaa ggt caa tct cca gtt gct ttt 1248gat ttg ttg cac tgg aac tct gat tct act aat gtt gcc ggt aaa act 1296cat aac tct ttg ttg aga aga tta tat ttg gaa aat caa ttg gtt aaa 1344ggt gaa tta aaa att aga aac act aga att gat tta ggt aaa gtt aaa 1392act cca gtt ttg ttg gtt tct gcc gtt gat gat cac att gct tta tgg 1440caa ggt acc tgg caa ggt atg aaa ttg ttc ggt ggt gaa caa aga ttt 1488tta ttg gcc gaa tcc ggt cat att gct ggt att att aat cca cca gct 1536gct aac aaa tac ggt ttc tgg cac aat ggt gct gaa gct gaa tct cca 1584gaa tct tgg ttg gct ggt gcc acc cat caa ggt ggt tcc tgg tgg cca 1632gaa atg atg ggt ttt att caa aac aga gat gaa ggt tct gaa cca gtc 1680cca gcc aga gtc cca gaa gaa ggt ttg gct cca gct cca ggt cac tat 1728gtc aaa gtt aga tta aac cca gtt ttc gct tgt cca acc gaa gaa gat 1776gct gct tct aaa ttg taa 1794<210>14<211>218<212>DNA<213>Candida maltosa<220>
<223>终止子ALK1t<400>14
Atagatggat ttttcttttt tatgtgtatt tccggttaat aaatgtttaa attttttttt 60taataaaaat atttgtagtt atttatatgc aaaaaaaaaa aatattcaaa gcaatcttcc 120tttctttctt tatctttccc ccatgctaag gtctaaaaca ccacaactta aaacccaact 180taaccgtata atactaagat caatctccaa agatgcat 218<210>15<211>1017<212>DNA<213>Candida maltosa<220>
<223>启动子ALK1p<400>15atgcatgaac aggatttaat cccaagaaaa aagtctattt tctattttca caaggaaact 60ggaaaaacct ttttgtgttt tgaagtagct ccgtaataac ctgtaaaaaa ataaattttg 120aagatttgac ttgctgatga aaatgctatc agtgtagctc tagacttgat actagactat 180gatggcaaca catggtggtc aacgtgcaag acatcaccca atgagaagac tgctaaccag 240aaaaaaaagg ggacaaaaga aaaactcgag agaaaaagtc aaattggtgt aaaattggct 300atttttggta ctttcctaat ggggaaatta attgtttaaa attccagttt ttccagagtt 360aagatttcga ccaattattt ttaatccata tgatcttcat cattatcaac ttgtgaaaaa 420taataatcga ggtacgttta atacgagata ttagtctacg gctatgaatg ttggatatac 480ttcattgacg atcagaagct tgattggtta ttcaggtgca tgtgtggata taaacccaac 540aaattatcta gcaactgtgc cttccccaca ttggtcaaag aaaccctaaa gcaaattaaa 600atctggataa ataaatcatt catttcacat tttccggtta gtataaggtt ttttaaattt 660ttttttacag tttagccctt tcaattacca aatacggtaa caatgtgctt tgtaacatgc 720aggggatttt ctccgttgct gttttctcca catgctttta atgtgtaata aattaaaaaa 780
attacaaaga aaaaccggca tataagcatc ggagtttaca ttgttaacta actgcaaaat 840ggcgatgttt caaatcaaca aaatttaaaa aaaccccaaa aaaaaagtat catataaatt 900aaactcaaaa tccttttgat tgcataaaat ttttaaatct cttctttttt ttctttttta 960ctttcttatc tattctattc tttttttata tatctaattc atttataaca tctggtc1017<210>16<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1p 5’的PCR引物<400>16tttttcagct ggagctcgtc gacatgcatg aacaggattt aatccc46<210>17<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1p 3’的PCR引物<400>17ccggaattcc atatgcagat gttataaatg aattagata39
<210>18<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1t 5’的PCR引物<400>18cggaagctta tagatggatt tttctttttt at 32<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ALK1t 3’的PCR引物<400>19tttttgatatc gagctcgtcg acatgcatct ttggagattg atctt45<210>20<211>47
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-ACT1p 5′的PCR引物<400>20cgcggatccg aattcgtcga catgcatgga tctcggctgt gaatcgc 47<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-ACT1p 3′的PCR引物<400>21gcgggatccc atatgtatcc aataaactcg taata35<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-GAP3p 5′的PCR引物<400>22atggctatta aaattggtat taacggtttc ggtag35<210>23<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-GAP3p 3′的PCR引物<400>23agaagcattg gagataatct tcaagtctgg agtgt35<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-PMA1p 5′的PCR引物<400>24gaatatctct cttccagtca ctcgagttgt attc 34
<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-PMA1p 3′的PCR引物<400>25ctcatatgaa gtttttgttt tctgtctc28<210>26<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-TEF1p 5′的PCR引物<400>26gcgggatcct cgagtaaggg ttccttcttt cata 34<210>27<211>38
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cm-TEF1p 3′的PCR引物<400>27ttttctttac ccatatgtga ttaaatataa gttagatg 38
权利要求
1.ACT1基因启动子，其包含下述(a)～(d)中任意一项的DNA(a)SEQ ID NO9所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO9所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO9所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO9所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA；
2.一种DNA，其包含权利要求1所述的ACT1基因启动子和连接在该启动子序列下游的结构基因。
3.基因表达单元，其包含权利要求2所述的DNA和终止子。
4.一种质粒，其包含权利要求3所述的基因表达单元。
5.权利要求4所述的质粒，该质粒为pUTA-ACT1-ORF2S。
6.GAP3基因启动子，其包含以下(a)～(d)中任意一项的DNA(a)SEQ ID NO10所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO10所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO10所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO10所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA。
7.一种DNA，其包含权利要求6所述的GAP3基因启动子和连接在该启动子序列下游的结构基因。
8.基因表达单元，其包含权利要求7所述的DNA和终止子。
9.一种质粒，其包含权利要求8所述的基因表达单元。
10.权利要求9所述的质粒，该质粒为pUTA-GAP3-ORF2S。
11.PMA1基因启动子，其包含以下(a)～(d)中任意一项的DNA(a)SEQ ID NO11所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO11所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO11所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO11所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA。
12.一种DNA，其包含权利要求11所述的PMA1基因启动子和连接在该启动子序列下游的结构基因。
13.基因表达单元，其包含权利要求12所述的DNA和终止子。
14.一种质粒，其包含权利要求13所述的基因表达单元。
15.权利要求14所述的质粒，该质粒为pUTA-PMA1-ORF2S。
16.TEF1基因启动子，其包含以下(a)～(d)中任意一项的DNA(a)SEQ ID NO12所示的DNA；(b)包含SEQ ID NO12所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(c)包含在SEQ ID NO12所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；(d)与SEQ ID NO12所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性、来自假丝酵母属酵母的DNA。
17.一种DNA，其包含权利要求16所述的TEF1基因启动子和连接在该启动子序列下游的结构基因。
18.基因表达单元，其包含权利要求17所述的DNA和终止子。
19.一种质粒，其包含权利要求18所述的基因表达单元。
20.权利要求19所述的质粒，该质粒为pUTA-TEF1-ORF2S。
21.一种转化细胞，其通过往宿主细胞中导入权利要求2、7、12或17所述的DNA而获得。
22.一种转化细胞，其通过往宿主细胞中导入权利要求4、5、9、10、14、15、19或20所述的质粒而获得。
23.权利要求21或22所述的转化细胞，其中所述宿主细胞为麦芽糖假丝酵母。
24.权利要求21～23中任意一项所述的转化细胞，其中所述结构基因来自豚鼠气单胞菌，编码参与3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚聚酯合成的酶。
25.一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚聚酯的方法，该方法包括培养权利要求24所述的转化细胞。
全文摘要
本发明涉及SEQ ID NO9所示的ACT1基因启动子、SEQ ID NO10所述的GAP3基因启动子、SEQ ID NO11所述的PMA1基因启动子、SEQID NO12所述的TEF1基因启动子，以及包含含有上述启动子的基因表达单元的质粒，导入了上述质粒的转化细胞。本发明还涉及共聚聚酯的生产方法，该方法包括培养上述转化细胞。
文档编号C12N15/11GK1646686SQ0380751
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月8日 优先权日2002年4月8日
发明者长冈哲也, 横沟聪, 官本宪二, 小坂田史雄, 松本圭司, 高木正道, 太田明德 申请人:株式会社钟化