专利名称：改进的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及改进的启动子及其应用，尤其是那些对其进行了改进以在转化株构建过程中不进行甲基化的启动子及其应用。
背景技术：
在构建所需的转化株植物时，一个重要因素是高表达的启动子。启动子序列是决定基因在植物细胞中的转录水平的主要因素，因此一般选用具有强转录活性的启动子序列来增强靶外源基因的表达水平。此外，由于通过增强标记基因表达水平来获得转化株植物变的相当容易，所以，高表达启动子在表达药物抗性基因以生产转化株植物过程中也是很重要的。
在这种情况下，已经有很多报道说在植物中获得了高表达启动子。典型的启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子，以及土壤杆菌属细菌异戊烯转移酶(ipt)基因和胭脂碱合成酶基因(nos)的启动子。此外，人们也观察到一些情况，其中包括从一个作为转化株宿主对象的植物的基因组中获得了高表达基因启动子，并对它进行了利用(Genschik et al.，Gene，148(1994)195-202)。最近几年，已经证明从结合了多种启动子的嵌合启动子中可获得具有显著提高的启动子活性的启动子。利如，Min Ni等证明通过将土壤杆菌属细菌章鱼碱合成酶(ocs)基因启动子和甘露碱(man)合成酶基因启动子进行结合就可获得在烟草中表现高表达的启动子(Plant Joumal，7(1995)661-676)。
然而，即使使用这些高表达启动子，也不一定能在各种植物中获得具有所需的外源基因表达水平的植物。原因之一可能是特异性的存在，而这种特异性是建立在每种植物细胞中存在的RNA聚合酶的差异基础之上的。此外，据推测，另一个原因是植物具有一种抑制外源基因表达的机制。在这种基因失活或表达抑制机制中基因组中的胞嘧啶甲基化被看作其中的一个重要因素。(Meyer and Saedler，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，47(1996)23-48)。
已经知道这种胞嘧啶甲基化较为显著的发生在双链DNA序列中，而这个双链DNA序列中的CG和CNG(N代表任一核苷酸序列)核苷酸序列形成回文结构(Matzke and Matzke，Plant Physiol.107(1995)679-685)。已经知道，甲基化甚至也发生在其他DNA序列的胞嘧啶中(Meyer et al.，EMBO loumal，13(1994)2084-2088)。当胞嘧啶甲基化后，许多生物体中的基因表达就受到了抑制(Razin、EMBO lournal，17(1998)4905-4908)。此外，因为与其他生物体相比较，植物体基因组中甲基化胞嘧啶的比率要高，所以有报道说甲基化与基因失活有着密切的联系(Meyer and Saedler，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，47(1996)23-48)。尤其是对于通过基因操作等手段导入的外源基因抑制现象，也就是“基因沉默”的原因来讲，DNA甲基化导致的基因失活可能是其中之一。
然而，到目前为止没有报道说对启动子的甲基化进行控制能提高基因表达。只有一个关于通过体外强制性甲基化使一个基因构建物出现基因表达瞬时下降的报道，其中的这个基因构建物是通过将CaMV 35S启动子连接到β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)基因上制备得到的(Hohn et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，93(1996)8334-8339)。然而，在上述报道的试验中并没有证实体内哪个核苷酸序列遭到了甲基化，以及甲基化结果是否导致了表达下降。此外，Hohn等观察到不仅是启动子甲基化导致Gus基因表达的下降，结构基因部分的甲基化也导致Gus基因表达的下降，他们得到结论说使结构基因部分不遭受甲基修饰对高表达来讲是很重要的。因此，他们并不赞同通过去甲基化启动子来获得高基因表达的观点。
因此，没有已知的特定方法可通过避免启动子甲基化来提高基因表达水平。在上述情况下，为了利用避免甲基化的方法来获得较高表达的转化株宿主，需将启动子部分或包含有启动子部分的DNA链中的哪个CG或CNG序列特异性修饰成其他何种核苷酸也是未知的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一个启动子，当将其安插到结构基因的5′端时就能够活化结构基因的表达。此外，本发明的另一个目的是提供包含这个启动子的DNA链。另外，本发明的另外一个目的是提供利用DNA链转化过的宿主以及利用宿主进行的结构基因的高表达方法。
鉴于以上提到的种种问题，发明者们想到可以在不损失启动子活性的前提下，通过对由启动子DNA双链中的CG和CNG组成的DNA回文序列进行修饰，使之成为不含有CG和CNG序列的其他核苷酸，这样进行甲基化作用的可能性就很小。在这个观点基础之上，大量研究的结果是发明者们发现通过将一个新设计的启动子连接到一个组成元件如翻译增强子、结构(报告)基因、翻译终止密码子和终止子之上，并利用这个启动子来转化菊科(Chrysanthemum)植物，菊科植物中的外源基因的表达水平就能得到显著提高。利用这一发现完成了本发明。
因而，本发明提供了下面(a)或(b)表示的DNA
(a)包含有由SEQ ID NO1中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(b)包含有由SEQ ID NO1中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
此外，本发明提供了下面(c)或(d)表示的DNA(c)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(d)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
此外，本发明提供了下面(e)或(f)表示的DNA(e)包含有由SEQ ID NO2中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(f)包含有由SEQ ID NO2中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列(此处核苷酸NO.185到186和197到198是单个CG)。
此外，本发明提供了下面(g)或(h)表示的DNA(g)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(h)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列(此处核苷酸NO.185到186和197到198是单个CG)。
此外，本发明提供了下面(i)或(j)表示的DNA(i)包含有由SEQ ID NO3中第7到322个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(j)包含有由SEQ ID NO3中第7到322个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
此外，本发明提供了下面(k)或(1)表示的DNA(k)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(1)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
此外，本发明提供了下面(m)或(n)表示的DNA(m)包含有由SEQ ID NO4中第7到422个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(n)包含有由SEQ ID NO4中第7到422个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
此外，本发明提供了下面(o)或(p)表示的DNA(o)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(p)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
此外，本发明提供了包含有上述任一DNA的DNA链。这样的DNA链优选的包含一个结构基因DNA和上述任一DNA，而上述的DNA是以一种能令其表达的方式结合到结构基因DNA 5′端的。这些DNA链可包括选自以下的组成元件翻译增强子、翻译终止密码子、终止子及其组合。另外，本发明提供了利用上述DNA链转化过的宿主。这种宿主优选植物细胞。
进一步，本发明提供了在植物中表达结构基因的方法，其特征在于可对上述DNA链转化后的宿主进行培养或培育以保证结构基因的表达。在这种方法中，结构基因可以是外源基因。此外，本发明提供了利用上述DNA链转化的宿主来生产蛋白的方法，这种蛋白是结构基因的表达产物，而这个外源基因是通过具有启动子活性的DNA来活化其转录或促进其表达的。
此外，本发明提供了转化株直物，而这些转化株植物是通过对上述DNA链转化过的植物细胞进行再生获得的。
此外，本发明提供了包含有选择性标记基因DNA和上述任一DNA的DNA链，而上述DNA是以一种令选择性记基因表达的方式结合到选择性标记基因DNA5′端的。另外，本发明提供了选择转化株宿主的方法，它包括利用DNA链转化宿主，以及在特定条件下培养这个宿主的步骤，在这样的特定条件下选择性标记基因可进行表达，并且可对其进行鉴定来确定宿主表达了选择性标记基因与否。优选的宿主是植物细胞。
本说明书包括日本专利申请NO.2000-59276的说明书和/或图表中公开内容的部分或全部，日本专利申请NO.2000-59276是本申请的优先权申请。
序列表说明SEQ ID NO14包含启动子序列的合成DNASEQ ID NO5-24引物
图1A和1B展示了本发明中的启动子MF-48的DNA序列(图.1A)和MF-18(图.1B)的DNA序列(分别是上面的线)，与pBI121的35S启动子DNA序列(下面的线)间的比较。
图2图示了质粒pKT81(A)、pKT83(B)、pMF-28(C)和pKT11(D)的部分结构。
图3图示了质粒pMF-48-Gus及其衍生物pMF-48-2和pMF-48-4.
图4展示了由4种载体转化过的菊科植物叶子中Gus基因平均表达水平(10种或更多种植物)的相对值，而这些相对值是建立在以pBI121转化过的重组烟草Gus基因的表达水平为比较之上的。
图5展示了具有不同Gus基因表达水平相对值的植物(以pBI121转化过的重组烟草做化较)的分布，而此Gus基因是存在于经由3种载体转化过的菊科直物叶子中的。
具体实施例方式
(1)启动子本发明中的DNA是包含有SEQ ID NO1-4表示的核苷酸序列或其部分核苷酸序列并具有启动子活性的DNA。这些DNA是通过对CaMV35S启动子核苷酸序列中的部分核苷酸进行修饰而制备得到的。
从CaMV35S启动子转录起始位点起始的250bp上游区域内含有13个CG或CNG，据推测CG甲基化酶或CNG甲基化酶分别对这些核苷酸序列进行了甲基化作用。因此，含有由未遭受甲基化作用的序列替代的这些序列的DNA就是包含有SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列的DNA。在SEQ ID NO1中，具有启动子活性的部分是NO.7-272位核苷酸部分。
此外，利用包含有SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列的DNA(启动子)无甲基化这一特性，可对一个含有大约20个核苷酸、称做ocs区域或as-1区域的启动子区域进行进一步的修饰，这种修饰具有显著的效用。于是，虽然ocs区域仍然保留有CG序列，对其进行修饰就能形成具有6个核苷酸(GACGTC)的回文结构，从而得到含有SEQ ID NO2所表示核苷酸序列的DNA。SEQ ID NO2表示的核苷酸序列中具有启动子活性的部分是NO.7-272位核苷酸部分。
对SEQ ID NO1所表示核苷酸序列和SEQ ID NO2所表示核苷酸序列(转录起始位点上游)与包含在pBI121载体(Clontech公司制备)中的35S启动子序列进行的比较如图1A和图1B所示，其中的pBI121载体是植物基因操作中最常用的载体。
此外，据认为，对ocs区域进行的修饰可用来进行启动子中重复的ocs区域的合成，并且，据认为这可增强启动子活性。因此，对ocs区域进行重复使得SEQ IDNO1中有两个ocs区域，从而得到包含有SEQ ID NO3所表示的核苷酸序列的DNA。在SEQ ID NO3中，7-322位核苷酸部分具有启动子活性。进一步，在SEQIDNO1中，对ocs区域进行重复以至其中含有4个ocs区域，这样就得到了含有SEQ ID NO4所表示的核苷酸序列的DNA。SEQ ID NO4中具有启动子活性的是7422位的核苷酸部分。
依照核酸生物合成方法，我们可对上述本发明中的DNA进行化学合成。
此外，本发明中的DNA包括具有启动子活性并含有特定核苷酸序列的DNA，相对于上述的任何核苷酸序列，这些特定核苷酸序列中缺失、添加或插入了一到多个核苷酸。在这里，缺失、添加或插入的核苷酸数目没有特别的限制，但优选的是一到多个，更优选的是1-3个，最优选的是1个。此外，本发明中的DNA可包括具有启动子活性，并包含有与上述任何DNA的核苷酸序列具有80％或更多，优选90％或更多，更优选94％或更多，以及最优选99％或更多同源性的DNA(变体)。此处的这些同源性数值是通过利用核苷酸序列对比程序DNASIS-macv3.7、使用缺省参数进行计算得到的。
因此，这些变体包含有与SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列部分不同的核苷酸序列，但在这种情况下却要求保留上述CaMV 35S启动子的重排位点。换句话说，在SEQ ID NO1中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位核苷酸是不变的。同样的，在SEQ ID NO2中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位核苷酸是不变的。此外，在SEQ ID NO3中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位核苷酸是不变的。进一步，在SEQ ID NO4中，NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位核苷酸是不变的。
此外，上述变体的核苷酸序列要求不含有CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续核苷酸序列，但SEQ ID NO2中，NO.185到186及197到198位核苷酸例外的却是CG。
只要包含有SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列或其变体的DNA具有启动子活性，其启动子活性水平并没有特别的限制，但是优选的是基本上保留包含有SEQ ID NO14所表示的核苷酸序列的DNA的启动子活性或其部分DNA的启动子活性。在应用启动子活性的实例中，此处的“基本保留这些DNA的启动子活性或其部分DNA的启动子活性”表示在与这些DNA及其部分相同的应用条件下几乎保留有相同的有用活性水平。此外，此处描述的启动子活性优选的定义为在植物细胞中的活性，更优选的是在菊科植物细胞中，最优选的是在菊花品种Reagan(chrysanthemum morifolium cv Reagan或chrysanthemum grandiflorum cv Reagan)中。
很明显，只要是本领域中的熟练技术人员，参考SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列，依照文献如分子克隆(Sambrook等编.(1989)Cold Spring Harbor Lab.Press，New York)的描述进行操作，在筛选和制备这些变体时就不会有任何特别的困难。此外，依照Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)5662-5666、WO85/00817、Nature316(1985)601-605、Gene 34[198S]315-323、Nucleic Acids Res.13(1985)4431-4442、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)6409-6413、Science 224(1984)I431-1433等所描述的技术，参照对与上述SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列相关的核苷酸序列进行人工替代、缺失、插入或添加一或多个核苷酸(突变的位点特异性衍生)的技术，本领域中的熟练技术人员就可获得并利用这些变体。
利用下文描述的一种确定启动子活性的方法，我们就可证明上面获得的变体是否具有启动子活性，并进一步确定他们是否基本保留含有SEQ ID NO1-4所表示的核苷酸序列的任一DNA的或部分DNA的启动子活性。
可对上述变体的启动子活性进行计算，优选的方法是通过制备含有多种报告基因，如β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)、虫荧光素酶(Luc)、氯霉素乙酰转移酶(Cat)、β-半乳糖苷酶(Gal)、胭脂碱合成酶(nos)、章鱼碱合成酶(ocs)等的、连接到新颖启动子下游区域上的载体(″植物基因转化和基因表达；试验手册″，Draper，J.等编辑，Blackwell Scientific Publication，1988)；利用多种常规的、众所周知并普遍使用的转化方法(下文有描述)将载体插入植物细胞基因组中；测定报告基因的表达水平；但启动子活性水平的计算方法不局限于此种。在这种方法的一个实例中，报告基因是Gus，宿主细胞中的启动子活性测定是依照(i)组织化学Gus染色法和/或( )使用荧光底物的方法(这两种方法可在Gelvin和Schilperoort编著的、Kluwer Academic Publishers出版的植物分子生物学手册C2(1994)I-32(版)中查到)进行的。此外，蛋白量是依照如Bradford法进行测定的(Anal.Biochem 72(1976)248-254)，并将Gus活性转化为单位蛋白量含有的值(例如以pmoleMU/min/mg蛋白来计算)来确定启动子的活性。
多种植物细胞如包括水稻、MUGI(小麦、大麦、黑麦和燕麦的通用名)、玉米、洋葱、百合、兰花等在内的单子叶植物细胞，以及包括大豆、油菜籽、番茄、马铃薯、菊花、玫瑰、康乃馨、牵牛花、gypsophila、樱草属植物等在内的双子叶植物细胞优选的用做本发明中的DNA的示范性宿主细胞。尤其优选的示范性宿主细胞包括植物细胞如具有高染色体多倍体的菊花细胞。这样优选的原因在于一般认为植物可使基因甲基化而导致同源基因失活，由于高多倍体的植物含有多个同源基因，所以预期这些基因将会被多种更强的甲基化机制失活(Leitch and Bennett，Trendsin Plant Sci.，2(1997)470-476)。化外，由于基因组中含有大量的CG(Thomas andSherratt，Biochem.J.，62(1956)1-4)，所以含有大量甲基化反应靶序列的植物细胞也是优选对象。
(2)DNA链按照本发明，此处提供了包含有本发明中的DNA的DNA链。这样的DNA链可用于转录任何基因，而在对其进行应用时，待转录DNA是以一种可表达的形式结合到这个DNA链中的。代表性基因是结构基因。从而，本发明进一步提供了结构基因DNA和含有本发明中的DNA的DNA，而本发明中的DNA是以利于表达结构基因DNA的方式结合到结构基因的5′端的。
按照本发明，DNA链的特定实例为，如将本发明中的DNA作为部分组成元件插入到质粒或噬菌体DNA中。
当将结构基因DNA结合到这样的DNA链中时，本发明中的DNA或结构DNA就进行排列以便使结构基因得以表达。结构基因DNA实例包括β-葡聚糖elicitor受体(Umemoto et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)1029-1034)、pacl(Sano etal.，Biotechnol.15(1997)1290-1294)及编码2-SAase or RnaseL的DNA(Ogawa et al，Natl.Biotechnol.14(1996)1566-1569)，但并不局限于此。
本发明中的DNA链可进一步包括组成元件如翻译增强子、翻译终止密码子、终止子等。对翻译增强子、翻译终止密码子和终止子来讲，可对已知的这些元件进行适当的细合应用。源自病毒的翻译增强子包括烟草花叶病毒序列、紫花苜蓿花叶病毒RNA4、bromomosaic病毒RNA3、马铃薯病毒X、烟草腐蚀病毒等(Gallie etal.，Nuc.Acids Res.，15(1987)8693-8711)。此外，源自植物的翻译增强子实例包括源自大豆S-1，3-葡聚糖酶(Glu)的序列(Isao ISHIDA，Norihiko MISAWA，KodanshaScientific编，″Saibo-kogaku-jikkenn-sousa-nyumon″(细胞工程实验操作导论)，Kodansha Ltd.，p.119，1992)，及源自烟草铁氧还蛋白亲和性亚单位的序列(PsaDb)(Yamamoto et al.，J.Biol.Chem.，270(1995)12466-12470)。终止子实例包括nos基因终止子、ocs基因终止子等(Annu.Rev.Plant Physiol Plant Mol.Biol.，44(1993)985-994，″植物基因转化和基因表达；前述的“一种实验手册”)。此外，有报道说通过识别作为启动子转录增强子的35S增强子并将多个35S增强子相互进行串联可提高启动子活性。(Plant Cell，1(1989)141-150)。35S增强子可作为DNA链的一部分。这多种组成元件优选的以可依照其性质进行作用的方式结合到DNA链中去。本领域中熟练技术人员可恰当的进行这样的操作。
本发明中的DNA(启动子)包括源自大豆Glu基因转录起始位点后的翻译曾强子(在SEQ ID NO1和2中是NO.279之后的，在SEQ ID NO3中是NO.329之后的，在SEQ ID NO4中是NO.429之后的)。虽然这个序列与由无甲基化导致的转录增强没有直接联系，但它能进一步促进靶基因的表达。翻译增强子并不局限于本发明中用到的、源自大豆Glu基因的翻译增强子，但要有相同的预期效果，甚至在被其他翻译增强子如上述目前已经报道的增强子替代的情况下也要有相同的效果。此外，在本发明中，翻译增强子的CG序列可用其他核苷酸替代。此外，当其他翻译增强子含有CNG序列，而不是CG序列时，此CNG序列可被其他核苷酸替代，方式与被CG序列替代相同。本领域中熟练技术人员可恰当的进行这样的修饰。
应用基因工程领域中常用的方法，本领域中的熟练技术人员就可以很容易的制得上述DNA链。此外，本发明中的DNA链并不局限于人工构建物，只要它具有上述的结构，就能从天然源中分离到。可利用熟知并常用的核酸生物合成方法通过合成手段来获得DNA链。
(3)转化包含有本发明中具有启动子活性的DNA的DNA链可对宿主进行转化，对获得的转化株进行培育或培养，从而对结构基因的表达进行诱导或对结构基因进行高效表达。此处的结构基因可以是外源基因。
在进行转化后，本发明中的DNA链就以结合到质粒、噬菌体或基因组DNA中的形式存在于微生物体(尤其是细菌)、噬菌体颗粒或植物中了。此处，细菌的典型实例包括，但并不局限于大肠杆菌、土壤杆菌等。
在本发明的一个优选实例中，本发明中的DNA链是以某种形式存在于植物中，从而本发明中的DNA(启动子)、翻译增强子、结构基因DNA、翻译终止密码子、终止子等全部连接并结合到基因组中，这样那些试图表达某种蛋白的结构基因就能稳定的在植物中进行表达了。
优选的宿主实例包括单子叶植物细包如水稻、MUGI(小麦、大麦、黑麦和燕麦的通用名)、玉米、洋葱、百合、兰花等的细胞，以及双子叶植物细胞如大豆、油菜籽、番茄、马铃薯、菊花、玫瑰、康乃馨、牵牛花、gypsophila、樱草属植物等的细胞，尤其优选的实例是植物细胞，如菊花等具有高染色体多倍体的植物细胞。此外，典型的植物部位包括生长点、原始芽、分生组织、叶、茎、根、块茎、柄、愈伤组织、花药、花粉、花粉管、花序梗、花葶、花瓣、萼片等。
对于将外源基因导入宿主细胞的方法来讲，报道过的和已被接受的多种方法都可作为合适的方法加以选用。优选的实例包括以病毒或土壤杆菌的Ti质粒、Ri质粒等作载体的方法，以及利用电穿孔、聚乙二醇、基因枪、微量注射器(″植物基因转化和基因表达；前述的“一种实验室手册″)、氮化硅晶须、碳化硅晶须(Euphytica85(1995)75-80，In Vitro Cell.Dev Biol.31 101-104，PlantScience 132(1998)31-43)来导入外源基因的物理方法，等等。本领域中的熟练技术人员可适当的选择并应用这些外源基因导入方法。
此外，可通过对植物细胞进行再生的方法来制备能表达其细胞中导入基因的转化株植物，而待再生的植物细胞是已经通过本发明中的DNA链进行转化过的。按照已知的、一般的将植物细胞再生为植物的方法，本领域中的熟练技术人员可很容易的进行这样的操作。对于植物细胞再生为植物，可参见文献，如″SHOKUBUTU-SAIBOU BAIYOU MANUAL(植物细胞培养手册)(YasuyukiYamada编，Kodansha Scientific，1984)。
当已经进行过表达诱导的或已高度表达的基因产物作为单独产物具有所需的用途时，则可按照依赖于表达产物的适当方法将其从培养物中分离和纯化出来。在表达产物存在的条件下，在宿主细胞生长并且细胞特性进一步改变时，对宿主进行培养可高度表达靶结构基因的表达产物，或当宿主是去分化植物时，对这些植物进行培养也可使靶结构基因表达产物进行高度表达。
此外，利用可表达如卡那霉素抗性基因(如NPTII)的选择性标记的DNA链，本专利所公开的高表达启动子能显著提高植物的转化效率。这可通过利用选择性标记基因DNA和包含有上述任一DNA的DNA链实现，而上述任一DNA是以利于表达选择性标记基因的形式结合到选择性标记DNA的5′端的。因此，特定方法没有细节限制，但这种方法可包括如利用DNA链转化宿主细胞，并在能表达选择性标记基因的条件下培养制备得到的宿主，以及确定宿主细胞是否表达选择性标记基因。宿主可以是其他的植物细胞，对此没有特别的限制，但优选植物细胞。在这里，可选用任何选择性标记基因，对其没有特别的限制，但优选抗药性基因如NPTH基因(卡那霉素抗性基因)，Hygr基因(潮霉素抗性基因)也是可行的。在这种情况下，宿主是否表达选择性标记基因的条件的确定是通过将其与含有此基因所耐受的药物的培养基共培养得到的。当NPTII基因用做选择性标记基因时，选用的药物可以是卡那霉素(Km)，但并不局限于此，也可有选择的选用G418或巴龙霉素。此外，应用能表达如潮霉素抗性基因(如Hyg)的选择性标记的DNA链也可收到相同的效果。在这种情况下选用的药物可为潮霉素。
也是在这种情况下，对于通过向宿主细胞中导入DNA链获得转化株植物的方法来讲，上述的任何方法都可选用。当如报告基因是Gus时，可通过使用上述(i)组织化学Gus染色法和/或( )利用荧光底物的方法(植物分子生物学手册，C2(1994)1-32，前面有描述)等来确定植物的表达。
一般来讲，在细胞分化期间，已知基因失活是由甲基化作用引起的。预期本发明所公开的启动子不仅能够导致未分化植物细胞如转化过的愈伤组织中靶基因的高度表达，也能够导致植物细胞中靶基因的高表达。
工业实用性按照本发明，利用普遍认为对植物如菊花来讲是高表达启动子的花椰菜花叶病毒35S启动子，可提高对结构基因显示弱表达的植物的表达效率。
实施例下文将参照以下实施例对本发明进行描述，但本发明并不局限于下列实施例。
制备无甲基化载体在CaMV35S启动子的mRNA(转录)起始位点上游250bp区域内有13个CG或CNG，据推测CG甲基化酶或CNG甲基化酶已分别对这些核苷酸序列进行了甲基化作用。因此，利用没有遭受甲基化的序列替代这些序列，在这个区域就合成了一个DNA。(MF-48SEQ ID NO1)。对于认为能产生很大影响，尤其是对转录活性具有很大影响的ocs区域，虽然保留了其中的CG序列，却可以通过对其进行修饰来制备DNA以获得6个核苷酸的回文结构(GACGTC)。(MF-18SEQ IDNO2)。对MF-48和MF-18序列(转录起点上游区域)和包含在pBI121载体中的35S启动子序列进行的比较如图1A和1B所示，而pBI121载体是植物基因操作中最常用的载体。
除上述外，已经修饰过的、具有35S启动子甲基化靶位点的基因(质粒名为pSan9Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)8334-8339，前面有描述)是从Friedrich.Miescher-Institut(Switzerland)的Dr.Hohn处转让过来的。此基因由mRNA转录起始位点上游大约250个核苷酸对的启动子部分、其下游CaMV35S基因的大约50个核苷酸对的5′非翻译序列(下文启动子部分与5′非翻译序列的结合可参照“MF-28”)、其远下游包含Gus结构(报告)基因的Gus基因表达箱以及一个35S终止子组成。
制备含有无甲基化启动子的载体为了确定上述在转化株植物中制备的MF-48、MF-18和MF-28的效用，构建了表达载体。下面的表达载体全部由Gus基因的表达单位和存在于侧面与边缘序列相连以便进行反方向转录的区域中的NPTII基因组成的。对这些表达箱来说，基本的载体是可由土壤杆菌和大肠杆菌进行扩增的二元载体pKT11，将Gus基因启动子和NPTII基因取代，就构建了pKT81、pKT83和pMF-28。
二元载体pKT11的组成包括土壤杆菌A281的RB区域大约250bp的XhoI-EcoRI部分、作为Gus基因表达单位部分大约3.5kbp的HindIII-EcoRI部分(从5端开始连接，依次是一个CaMV 35S启动子、一个烟草PsaDb的翻译增强子、一个含有蓖麻过氧化物酶基因内含子的Gus基因以及一个nos基因终止子)、NPTII基因表达单位部分大约1.7kbp的HindIII-KpnI部分(植物中通过nos基因启动子来驱动进行作用的NPTII基因终止子和nos基因终止子)、左侧边缘区域与pBI121相连的大约5.5kbp的KpnI-XhoI部分以及土壤杆菌和大肠杆菌扩增的复制原点。此外，二元载体pKT11中的Gus基因是由一个与大豆衍生的Glu基因翻译增强子相连的启动子表达的(图2D)。
利用琼脂糖凝胶对实施例1中制备的DNA片段(启动子)进行纯化，质粒pKTll的35S启动子区(HindIII-Xbal)替代，制得质粒pKT81和pKT83(图2).
pKT81和pKT83各含有源自大豆的大豆衍生Glu基因翻译增强子，它们分别连接到MF-48和MF-18的下游，这样就可达提高翻译效率的目的，另外在pKT81和pKT83的远下游端都含有一个表达单位，其中的Gus基因是与nos基因启动子相连接的，此处的Gus基因是报告基因。同时，它们都包含有连接有一个ipt基因启动子、一个源自大豆Glu基因的翻译增强子、一个NPTII基因和一个nos基因终止子的表达单位。
在pMF-28中，pSan9的整个Gus基因表达箱与pKT11的Gus基因表达箱进行了交换。
利用MF48、MF-18和MF-28启动子来表达Gus基因的pKT81、pKT83和pMF-28载体的限制性酶图谱如图2A，B和C所示，作为最基本载体的pKT11的限制性酶图谱如图2D所示。
此外，为了制备含有增加的ocs区域的启动子，将限制性酶BamHI的BgIII切割位点之间的序列，这是一个包含有MF-48启动子的ocs元件的区域，插入到利用BamHI切割启动子制得的片段中，这样就制备了含有同方向彼此连接的序列的两个拷贝的启动子(MF-48-2SEQ ID NO3)以及含有同方向彼化连接的序列的四个拷贝的启动子(MF-48-4SEQ ID NO4)(图3)。
表达Gus基因的菊花愈伤组织的制备作为对照，利用电穿孔技术将利用MF-48和MF-18启动子表达Gus基因的pKT81载体和pKT83载体连同pKT11载体导入根瘤土壤杆菌LBA 4404菌株中，向制得的菌株中接种3ml YEB-Km培养基，28℃下避光培养16小时。其后，离心收集菌株细胞，将其悬浮在10ml下述的感染培养基中制备感染液。YEB-Km培养基和感染培养基的组成如下。
YEB-Km培养基5g/l牛肉浸膏，1g/l酵母浸膏，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖，2mM硫酸镁(pH7.2)，以及50mg/l卡那霉素感染培养基1/2 MS培养基(Murashige&Skoog，Physiol.Plant.，15(1962)473-497)浓度的无机盐和维生素，15g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，以及10mM MES(pH 5.4)。
将无菌植物Reagan(Chrysanthemum morifodium ev.Reagan或Dendranfhemagrandiflorum ev.Reagan)，菊花的一个栽培品种的叶子切割成5-7mm见方的叶片，并将这些叶片在土壤杆菌感染液中浸泡10分钟以使载体pKT11、pKT81和pKT83导入。用滤纸吸净多余的感染液，将叶片转移到共培育培养基中，并在25℃下避光培养。培养3天后，将叶片转移到随后的选择培养基中培养3周，从而得到Km抗性愈伤组织。在选择培养基中的培养条件是25℃、16小时光照(光强32uE/m2s)/8小时无光照。每种载体导入到4片含有制得的Km抗性愈伤组织的叶子中，这样共有12片叶子用于Gus活性确定，以此来确定Gus基因的表达。
共培育培养基MS培养基浓度的无机盐和维生素，30g/l蔗糖，1mg/l萘乙酸、2mg/k苄基腺嘌呤，8g/l琼脂，5mM MES(pH5.8)，以及200uM乙酰丁香酮选择培养基MS培养基浓度的无机盐和维生素，30g/l蔗糖，1mg/l萘乙酸、2mg/l苄基腺嘌呤，8g/l琼脂，5mM MES(pH5.8)，25mg/l卡那霉素，以及300mg/l头孢氨噻将叶片转移到200μl反应液(100mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)、1mM EDTA、0.1％TritonX-100，1mM二硫苏糖醇(DTT))中来确定酶活性，冰冻条件下将其完全粉碎。将得到的悬浮液离心收集上清液，收集到的上清液可作为粗酶液。依照已出版的报道来确定Gus活性(植物分子生物学手册，C2(1994)1-32，前文有描述)。也即，以5μl粗酶液和50ul浓度为2.8mg/ml的4-四甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖醛酸酐为底物，添加到145ul反应液中，测定产生的荧光进行。利用Bio-Rad实验室的蛋白测定试剂盒II来对蛋白质定量，并确定单位蛋白的Gus活性。下表1展示了分别用pKT11、pKT81和pKT83转化的愈伤组织的Gus活性。由于pKT81和pKT83转化的愈伤组织表现了比pKT11转化的愈伤组织约高4-5倍的Gus活性，所以可以确定无甲基化的启动子MF-48和MF-18具有高表达能力。
表1利用多种启动子来表达菊花愈伤组织的β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因
对于MF-48-2和MF-48-4来讲，这些载体是通过替代pBI121的35S启动子来制备的。以与上文相同的方式，利用菊花叶子作为材料，进行转化，从而得到Km抗性愈伤组织。利用这些愈伤组织，依照植物分子生物学手册，C2(1994)1-32(前面有描述)中描述的方法，对Gus活性进行组织染色。在pBI121转化过的组织中未发现颜色产生，但相反，在MF-48-2和MF-48-4转化的组织中观察到相当强的蓝色。换句话说，对于定量表达强度来讲，pBI121是负(-)，但MF-48-2和MF48-4正相反，分别是(+)到(++)。
表达Gus基因的菊科植物的制备在植物转化中，我们经常观察到，即使启动子在未分化细胞，如愈伤组织中能高度表达，也仅仅在成年植物的部分细胞中能高度表达。我们认为，原因之一是在植物细胞分化的时候刺激了基因甲基化来抑制不必要的基因表达。鉴于前述现象，我们认为本发明所公开的无甲基化启动子也能在成年植物中高度表达，从而我们也可对它们进行检验。
依照实施例3中的方法，对分别含有pKT81、pKT83和pMF-28的根瘤土壤杆菌LBA 4404菌株进行转化，得到Km抗性愈伤组织。在含有Km的MS培养基上(再生培养基其组成与实施例3中的选择培养基相同)，从获得的愈伤组织来再生植物。进一步，为了促进生根，在促生根培养基上培养再生植物，而再生培养基中已经去除了植物生长调节物质(萘乙酸，苄基腺嘌呤)。
利用PCR，从成年植物中检测到含有外源基因NPTII基因的植物，所以可以确定这样获得的重分化植物是转化株。此处，TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQID NO5)和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO6)序列用做NPTII基因特异性序列特异性扩增的引物。PCR的反应条件是在94℃下加热5分钟，然后在72℃下反应10分钟。在这个反应中，选用的酶是ExTaq多聚酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)。
每种植物取3片叶子，每个基因取10种植物，依照与实施例3相同的方法进行活性确定，已确定活性的平均值如图4所示。按照实施例3中的转化方法，将pBI121导入菊花和烟草(品种Xanthi)中作为对照。此外，检查每片含有导入的pKT81(MF-48)、pKT83(MF-18)及pMF-28(MF-28)的菊花转化株叶片来确定植物对Gus基因表达的水平，其结果在图5中用一个直方图来展示。
按照这个结果，可以发现，每株含有导入的pKT81(MF-48)、pKT83(MF-18)或pMF-28(MF-28)的菊花比含有导入的pBI121的菊花表现出更高的Gus基因表达。然而，众所周知的高表达启动子范例pMF-28的表达水平没有达到其在烟草中的表达水平。然而，令人惊讶的是pKT81和pKT83在烟草中表现出比pBI121(35S)高的多的表达水平。那么，在pKT81(MF48)和pKT83(MF-18)进行比较时，pKT83植物往往表现出较高的Gus基因表达(图4)。此外，利用菊花进行了表达水平研究。例如，表现出3倍Gus基因表达水平的植物局限于MF48和MF-18。整体上来讲，相对于MF48，含有MF-18且表现高表达的植物的数目可能要更大一些(图5)。
转化株菊花中外源基因甲基化分析为了了解导入基因在体内是如何被甲基化的，就要对导入基因序列中甲基化胞嘧啶的位置进行确定。选用的方法是Meyer等的胞嘧啶脱氨基作用PCR法(EMBOJoumal，13(1994)2084-2088)。这个方法大体包括，首先利用CTAB从实施例4中制得的转化株菊花中提取DNA，利用限制性酶EcoRI进行切割，悬浮于转化缓冲液(3M Na-bissulfate，0.5mM氢醌，pH5.3)中，50℃下在氮气中反应20小时。透析除盐，利用0.3N NaOH对DNA进行碱饱和，然后在乙醇中收集沉淀。然后，利用设计来从侧面连接到位点待确定的核苷酸序列上的DNA引物进行PCR反应。此处选用的PCR引物如下所示。
<用于35S区域甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-8GAATGTTAATTTATAGATGGTTAGAGAGGTTTATGTAGTAGG(SEQ ID NO7)35S-8CCATATTCTCTCCAAATAAAATAAAC(SEQ ID NO8)第二次PCR35S-9AGTAATAATTTTAGGAAATTAAATATTTTTTTAAGAAGG(SEQ IDNO9)35S-14TATTCTCTCCAAATAAAATAAACTTC(SEQ ID NO10)<用于35S互补链甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-C-1CTATTCCAATATAAACAATTCAAAACTTAC(SEQ ID NO11)35S-C-4TGAAATGAATTTTTTTATATAGAGGAAGGGTTTTGTG(SEQ IDNO12)第二次PCR35S-C-2CAACATAATAAAACACAACACACTTATCTAC(SEQ ID NO13)35S-C-3ATGAATTTTTTTATATAGAGAAGGGTTTTGTGAAG(SEQ IDNO14)<用于GUS基因甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-16GAAGAAATTTTTGTTAATATGGTGGAGTATGATATG(SEQ IDNO15)TO-100CCAATCAACAAACACATAATTACAATCTTACACAACATACATC(SEQ ID NO16)第二次PCR35S-17GGGATGATGTATAATTTTATTATTTTTTGTAAGA(SEQ ID NO17)TO-101CATAACATCAACTTCAAATAACATATAACCACCCTAATAC(SEQ ID NO18)<用于Pacl基因甲基化分析的引物>
第一次PCR35S-16GAAGAAATTTTTTGTTAATATGGTGGAGTATGATATG(SEQ IDNO15)pacl-7CTTCAATAACAAATTCATTTTAACAATCATACC(SEQ ID NO19)第二次PCR35S-17GGGATGATGTATAATTTTATTATTTTTTGTAAGA(SEQ ID NO17)pacl-8ACAAATTCATTTTAACAATCATACCTTAACT(SEQ ID NO20)
<用于MF甲基化分析的引物>
第一次PCRTO-103GAGGATTTAAAAGGAAGGTGGTTTTTATAAATGTTATTATTG(SEQ ID NO21)TO-105CCACAATTTTCACAATCCAAACTAAATACCCACAAACC(SEQID NO22)GUS基因的5′区域第二次PCRTO-104GGATTTAAAAGGAAGGTGGTTTTTATAAATGTTATTATTGTG(SEQ ID NO23)TO-106CAATTTTCACAATCCAAACTAAATACCCACAAACCATC(SEQID NO24)GUS基因的5′区域上述所有PCR的反应条件是开始在94℃下加热5分钟，在94℃下30秒，在65℃下加热1分钟，在72℃下加热1分钟，共30个循环，然后在72℃下反应10分钟。然后，选用最先获得的PCR产物，在94℃下加热5分钟后，重复在94℃下30秒、在65℃下加热1分钟、在72℃下加热1分钟这样的操作30次。最后进行在72℃下反应10分钟这一步。
在这个PCR反应中，选用的酶是ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，并将PCR合成产物克隆到pT7blue中。对于起始DNA来讲，对大约5个克隆中的DNA序列进行了确定。在这一系列的转化反应之后，胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶本身被读做胞密定，从而就检测到了甲基基团的存在。利用DNASIS-Macv3.7来分析核苷酸序列内的差异。
对实施例4中制备的大约10种菊花转化株植物进行了分析。结果是在表现Gus基因高表达的菊花转化株的35S启动子中有相对较少的甲基化胞嘧啶，并且在5个克隆中的甲基化比率也低。相反，在没有检测到有Gus基因表达的植物中，35S启动子中包括CG和CNG在内的所有胞嘧啶都以高比率进行了甲基化。在此，以导入相同基因的烟草(品种Xanthi)作比较，对其表现高Gus基因表达的植株进行调查，但没有检测到甲基化的胞嘧啶。同时，对菊花35S启动子的互补DNA链中胞嘧啶的甲基化程度进行了检测。虽然其中有零星的甲基化胞嘧啶，但特定的胞嘧啶并没有遭受甲基化修饰，并且这些零星的甲基化胞嘧啶与Gus基因表达也没有任何关系。另一方面，也对结构基因的甲基化进行了调查，不管表达强度如何，至少在从翻译起始位点(ATG)到大约第600位核苷酸之间的核苷酸中几乎没有发现胞嘧啶修饰作用。上述胞嘧啶甲基化作用和表达水平之间的关系不仅在Gus基因，而且在含有导入的结构基因的菊花中可观察到，而此结构基因中的一个双链RNA特异性RNA酶基因(Nature Biotechnoloty，15，1290-1297前文有描述)是结合到35S启动子的下游部分的。
随后，以相同的方式对含有导入的pKT81并表现高Gus基因表达的菊花的甲基化作用进行了调查。结果是许多植物在转化后根本不再遭受甲基化作用，并且，在其他植物中，在回文结构外，从启动子到Gus基因这段核苷酸序列中的位点上的胞嘧啶遭受了很强的甲基化作用。然而，所有植株都强烈表达Gus基因，鉴于此，我们认为回文结构(CG和CNG)外的胞嘧啶残基甲基化对基因表达的影响很小。
因此，作为一种提高结构基因表达的方法，我们认为重要的是去转化导入基因启动子位点上含有CG和CNG回文结构的核苷酸序列。顺便提一下，按照实施例3的结果，对pKT83来讲，在所有的回文序列中，虽然不能对一个称为ocs序列的短序列中的CG序列(SEQ ID NO2中第185和197位胞嘧啶核苷酸)进行转化，但这一位点却表现出比pKT81更高的表达活性的作用趋势。因此，在对此ocs序列的回文结构不进行转化的条件下制备高表达启动子就意味着在体内能够取得更高的表达。
转化康乃馨为了利用无甲基化启动子来提高NPTII基因的表达水平，并利用标记来提高选择效率，我们将NPTII表达箱的Nos启动子转换为无甲基化启动子。为了简便操作，用HindIII和XbaI之间的DNA片段来取代Nos启动子和MF-48启动子，从而制备得到包含MF-48启动子、NPTII和Nos终止子的箱。利用制得的箱取代pKT-11中的NPTII表达箱(从HindIII位点到KpnI位点)，这样就制得连接到Gus表达箱上并可用做二元载体的pKT74。
利用电穿孔技术将pKT74和作为对照的pKT11导入根瘤土壤杆菌LBA 4404菌株中，并对其接种3mlYEB-Km培养基。28℃下避光培养16小时，离心收集菌株细胞，将其悬浮在10ml下述的感染培养基中制备感染液。YEB-Km培养基和感染培养基的组成如下。
YEB-Km培养基5g/l牛肉浸膏，1g/l酵母浸膏，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖，2mM硫酸镁(pH7.2)，以及50mg/l卡那霉素感染培养基1/2 MS培养基(Murashige&Skoog，Physiol Plant.，15(1962)473-497)浓度的无机盐和维生素，15g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，以及10mM MES(pH5.4)。
将无菌康乃馨品种Scaria(Dianthus caryophyllus L)植株上的叶茎切掉，并将其浸泡于土壤杆菌感染液中10分钟，使载体pKT11和pKT74导入。用滤纸吸净多余的感染液，将叶片移植到下述的共培育培养基中，25℃下避光培养。培养3天后，将叶片转移到随后的选择培养基中培养3周，从而得到G418抗性愈伤组织。在选择培养基中的培养条件是25℃、16小时光照(光强32uE/m2s)/8小时无光照。
共培育培养基MS培养基浓度的无机盐和维生素，30g/l蔗糖，0.5mg/l吲哚乙酸，0.22mg/l thidiazuron，8g/l琼脂，5mM MES(pH5.8)，以及100mg/l乙酰丁香酮选择培养基MS培养基浓度的无机盐和维生素，30g/l蔗糖，0.5mg/l吲哚乙酸，0.22mg/l thidiazuron，8g/l琼脂，5mM MES(pH5.8)，25mg/l G418，以及300mg/l头孢氨噻[实施例7]康乃馨转化株的选择按照实施例6中的方法对分别含有pKT11和pKT74的根瘤土壤杆菌LBA4404菌株进行转化，利用制得的G418抗性幼苗在不含除G418之外的植物生长调节物质(吲哚乙酸，thidiazuron)的MS培养基上进行植株再生。
利用PCR，从成年植物中检测到含有外源基因NPTII基因的植株，所以可以确定获得的重分化植物是转化株。此处，TAAAGCACGAGGAAGCGGT(SEQ IDNO5)和GCACAACAGACAATCGGCT(SEQ ID NO6)序列用做NPTII基因特异性序列特异性扩增的引物。PCR的反应条件是开始在94℃下加热5分钟，在94℃下30秒，在55℃下加热1分钟，在72℃下加热1分钟，共30个循环，然后在72℃下反应10分中。在这个反应中，选用的酶是ExTaq多聚酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)。
利用PCR，从中检测到NPTII基因的植株作为转化株。对于每个pKT11和pKT74来讲，其转化效率比率是以选用的每片叶子中转化株的数目来计算的。pKT11的比率是不大于5％，相反，pKT74的比率是不小于25％。同时，利用与实施例3相同的方法来确定Gus活性，并进一步证实所有的重组体都表达Gus基因。
鉴于以上的实验结果，我们认为MF-48启动子可高效作用于选择性标记基因的表达。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请全部作为参考文献。
序列表序列表<110>麒麟麦酒株式会社(KTRIN BREWERY COMPANY，LIMITED)<120>改进的启动子及其应用<130> PH-1165-PCT<150>JP 2000-59276<151>2000-03-03<160>24<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>320<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明含有启动子序列的合成DNA<400>1aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcttccc tctatataag 240gaagttcatt tcatttggag aggacaaggt actctagact tctttcctca accttctttc 300ttcttatata tcataccatg 320<210>2<211>320<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明含有启动子序列的合成DNA<400>2aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgacgtcaa ggatgacgtc aaatcccact atccttgcca agatcttccc tctatataag 240gaagttcatt tcatttggag aggacaaggt actctagact tctttcctca accttctttc 300ttcttatata tcataccatg 320<210>3<211>370<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明含有启动子序列的合成DNA<400>3aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa 240ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcttccc tctatataag gaagttcatt 300tcatttggag aggacaaggt actctagact tctttcctca accttctttc ttcttatata 360tcataccatg370<210>4<211>470<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明含有启动子序列的合成DNA<400>4aagcttaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg tgataaagga aaggctatca 60ttgaagatgc ctctacctat agtggtccca aagatggacc cccacccatg aggagcatgg 120tagaaaaaga agatgttcca accatgtctt caaagcaagt ggattgatgt ggatcctcca 180atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa 240ggatgatgtc aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa ggatgatgtc 300aaatcccact atccttgcca agatcctcca atgatgtcaa ggatgatgtc aaatcccact 360atccttgcca agatcttccc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacaaggt 420actctagact tctttcctca accttctttc ttcttatata tcataccatg470<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>5taaagcacga ggaagcggt 19<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>6gcacaacaga caatcggct 19<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>7gaatgttaat ttatagatgg ttagagaggt ttatgtagta gg 42<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>8ccatattctc tccaaataaa ataaac 26<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>9agtaataatt ttaggaaatt aaatattttt ttaagaagg 39<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>10tattctctcc aaataaaata aacttc 26<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>11ctattccaat ataaacaatt caaaacttac 30<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>12tgaaatgaa tttttttatat agaggaaggg ttttgtg 37<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>13caacataata aaacacaaca cacttatcta c 31<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>14atgaattttt ttatatagag gaagggtttt gtgaag36<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>15gaagaaattt ttgttaatat ggtggagtat gatatg36<210>16<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>16ccaatcaaca aacacataat tacaatctta cacaacatac atc43<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>17gggatgatgt ataattttat tattttttgt aaga 34<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>18cataacatca acttcaaata acatataacc accctaatac40<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>19cttcaataac aaattcattt taacaatcat acc 33<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>20acaaattcat tttaacaatc ataccttaac t 31<210>21<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>21gaggatttaa aaggaaggtg gtttttataa atgttattat tg 42<210>22<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>22ccacaatttt cacaatccaa actaaatacc cacaaacc 38<210>23<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>23ggatttaaaa ggaaggtggt ttttataaat gttattattg tg 42<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物<400>24caattttcac aatccaaact aaatacccac aaaccatc 38
权利要求
1.下面(a)或(b)表示的DNA(a)包含有由SEQ ID NO1中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(b)包含有由SEQ ID NO1中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
2.下面(c)或(d)表示的DNA(c)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(d)包含有由SEQ ID NO1所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
3.下面(e)或(f)表示的DNA(e)包含有由SEQ ID NO2中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(f)包含有由SEQ ID NO2中第7到272个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列(此处核苷酸NO.185到186和197到198是单个CG)。
4.下面(g)或(h)表示的DNA(g)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(h)包含有由SEQ ID NO2所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、183到188、195到200及217到218位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列(此处核苷酸NO.185到186和197到198是单个CG)。
5.下面(i)或(j)表示的DNA(i)包含有由SEQ ID NO3中第7到322个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(j)包含有由SEQ ID NO3中第7到322个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
6.下面(k)或(1)表示的DNA(k)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(1)包含有由SEQ ID NO3所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248及267到268位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
7.下面(m)或(n)表示的DNA(m)包含有由SEQ ID NO4中第7到422个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(n)包含有由SEQ ID NO4中第7到422个核苷酸所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
8下面(o)或(p)表示的DNA(o)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列的DNA；或(p)包含有由SEQ ID NO4所展示的核苷酸序列组成的核苷酸序列并具有启动子活性的DNA，其中，在除NO.41到42、59到60、73到75、77到78、80到82、109到110、119到120、134到135、145到146、181到183、185到186、197到198、217到218、231到233、235到236、247到248、267到268、281到283、285到286、297到298、317到318、331到333、335到336、347到348及367到368位点外的位点有一到多个核苷酸缺失、添加或插入，并且这些缺失、添加或插入序列不含CG、CAG、CTG、CCG或CGG表示的任何连续序列。
9.包含权利要求1-8中任一DNA的DNA链。
10.权利要求9中的DNA链，其含有一个结构基因DNA和权利要求1-8中以利于表达的方式结合到结构基因DNA 5′端的任一DNA。
11.利用权利要求9或10中的DNA链转化过的宿主
12.权利要求11中的宿主，其中的宿主是植物细胞
13.在植物中表达结构基因的方法，其中对权利要求11中的宿主进行培育或培养来保正结构基因的表达。
14.权利要求13中的方法，其中的结构基因是外源基因。
15.生产蛋白的方法，包括利用权利要求11中的宿主生产蛋白的步骤，而这种蛋白是结构基因的表达产物，而具有启动子活性的DNA可活化此结构基因的转录或促进其表达。
16.通过对权利要求12中的宿主进行再生获得的转化株植株。
17.权利要求9中的DNA链，其包含选择性标记基因DNA和权利要求1-8中以利于表达选择性标记基因的方式结合到选择性标记基因DNA 5′端的任一DNA。
18.用于选择转化株宿主的方法，其中该方法包括下列步骤利用权利要求17中的DNA链转化宿主；以及在选择性标记基因可进行表达的条件下培养制得的宿主，并确定该宿主是否表达选择性标记基因。
19.权利要求18中的方法，其中的宿主是植物细胞。
全文摘要
对启动子进行改进以便在转化株构建过程中不进行甲基化作用。上述启动子是如(1)和(2)中所定义的DNA(1)含有SEQ ID NO1－4所表示的碱基序列的DNA以及(2)含有衍生自SEQ ID NO1－4所表示的碱基序列并具有启动子活性的DNA，这些碱基序列是通过对SEQ ID NO1－4所表示的碱基序列缺失、添加或插入一到多个碱基的方式得到的，但缺失、添加或插入的碱基序列中不含有CG、CAG、CTG、CCG和CGG表示的连续序列。这些启动子可提高那些弱表达植物的结构基因的表达效率(例如菊花)，而这些弱表达植物即使是利用被认为是植物高表达启动子的花椰菜花叶病毒35S启动子也表现弱表达。
文档编号C12N15/82GK1427890SQ01809011
公开日2003年7月2日 申请日期2001年2月23日 优先权日2000年3月3日
发明者藤井敏雄, 小川俊也, 吉冈正阳, 间宫千士, 户栗敏博 申请人:麒麟麦酒株式会社