专利名称：基因表达的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用于细菌宿主的基因工程领域。更具体而言，本发明涉及在细菌宿主中生产蛋白的表达系统。
背景技术：
重组DNA技术的发展使不同的天然存在和合成的蛋白可以在生物体内产生，如细菌，真菌，酵母及哺乳动物细胞。总的来说，这一过程包括将编码目的蛋白的基因插入宿主生物体，及利用宿主的细胞机制来表达基因。
重组DNA技术仍在继续发展以达到蛋白以商业上可接受的产率进行。重组蛋白产生的一个限制因素就是编码目的蛋白的基因的表达速率。已发现，启动子区域在基因表达的转录过程中是相当重要的。有效的启动子，如在大肠杆菌中发现的trp启动子，与DNA指导的RNA聚合酶紧密结合，从而启动产生mRNA的基因转录过程。不太有效的启动子，如lac启动子，与RNA聚合酶的结合不够紧密，导致mRNA较低速率的产生。
trp启动子因其能有效地启动转录而被广泛用于异种蛋白生产。尽管trp启动子具有很好的效率，其固有的一个缺点就是不易控制。特别是该启动子不能被完全阻遏，也就是说，宿主在培养液中生长至适于蛋白产生的生长期之前，它就能促使转录进行。另一个被广泛应用的启动子是不如trp有效的lac启动子，它更易控制。
为发展更有效的启动子，将不同启动子的功能元件结合起来，如美国专利US5,362,646中所述。在其中的一例中，噬菌体T7启动子A1(PA1)的部分与两个lac操纵子结合起来。特别是将噬菌体T7启动子的位于所谓-35和-10区之间的间隔区以修饰的lac操纵子的序列替代，为控制所得的启动子杂合体，在下游引入第二个lac操纵子。发现所得的启动子/操纵基因系统插入商业化的pUHE质粒中后，经诱导后可有效地启动转录，而在诱导前则被高度阻遏。
另一个由Tsung等描述的启动子(美国国家科学院会议录，1990，875940)包括从高效的IppP-5启动子(Ipp启动子的变种)得到的trp-35区，-10区及从lac启动子得到的间隔区。这个启动子显示了极高的启动转录的效率，而导致了细胞的死亡。
尽管不同的启动子均使微生物宿主内的蛋白产率有所提高，仍有必要寻找能更有效促进有商业价值的蛋白产生的启动子。
发明概述根据本发明的一个方面，提供了用于细菌宿主体内蛋白表达的新的重组DNA构建物。该构建物包括蛋白的编码区而且有含启动子的控制区与此可行的相连，启动子的DNA序列选自5’-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3’；和5’-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3’。
附图简述
图1描述了核苷酸序列和系统描述包括插入按照本发明的重组DNA构建物的表达盒。
图2和3阐述了本发明中含启动子和操纵基因区的DNA构建物的核苷酸序列。
发明详述本发明提供了能在细菌宿主如大肠杆菌中高效地促进DNA表达的DNA序列。使用包含这些序列的表达载体是提高可表达的，内源性的和异种蛋白产率的有效方法。本发明的一个方面提供了在细菌宿主内表达蛋白的一种新的重组DNA构建物。该构建物包括与控制区可操作地相连的编码区，控制区含可使所述蛋白在宿主体内表达的启动子，其中启动子包含的DNA序列选自5’-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3’；和5’-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3’。
这些启动子在-35区都有TTGACA共有序列，在-10区都有TATACT序列。根据本发明，间隔序列，即插入的18个碱基序列可以是ACATAAAAAACTTTGTGT或CTTTATGCTTCCGGCT，优选序列ACATAAAAAACTTTGTGT。因而，在优选的实施方案中，本发明提供了DNA构建物，其中编码所需蛋白质的DNA在表达控制下，与序列为5’-TTGACAACATAAAAAACTTTGTTATACT-3’的启动子可行地相连。
本领域的技术人员了解，本发明中的启动子构成了位于功能控制区中启动表达所需组分的一个基本元件，而且这些启动子能够用标准方法插入到任何能在革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌中复制的合适的表达载体中。更独特的，为构成基因表达控制区，本启动子要和典型表达所需的一些其它控制元件合并，这些元件包括核蛋白体结合位点及本发明方案中所述的控制启动子功能的操纵基因。
根据深入理解的基因表达原理，这些元件需按表达发生的要求安放在各自的位置。
在本发明的方案中构建物的调控区和一个操纵基因合并。可用的操纵子包括可被化学诱导剂直接诱导的操纵子和可脱阻遏的操纵子如lac。适合的操纵子例子包括大肠杆菌乳糖，半乳糖，色氨酸，四环素操纵子(参见Miller等“The Operon”，冷泉港实验室，1980和Hillen等，分子生物学杂志，1984，172185)优选的启动子是高度可阻遏的，这样编码的DNA的表达就可以控制。在具体的方案中，调控区包括lac操纵子(图1)，在缺乏合成诱导物异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG)和天然诱导物乳糖时可抑制启动子的表达。
调控区还包括一个核蛋白体结合位点(RBS)以利于mRNA转录本和核蛋白体的结合来启动RNA编码区的翻译以产生蛋白。适宜的核蛋白体结合位点包括lac和细菌噬菌体T5。优选方案中RBS是衍生自T5细菌噬菌体RBS，其序列为5’-ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3’。
本发明中构建物的调控区和内源蛋白或异源蛋白的编码区可行地相连。术语“异源蛋白”是指虽然细菌宿主不能天然产生，用适当的编码此蛋白的DNA转化后能够产生的蛋白或多肽；基因组DNA，cDNA，合成DNA都可用于转化宿主。利用这里描述的系统可产生的蛋白包括，但并不局限于此，激素如甲状旁腺素(PTH)，胰高血糖素或其片断和相关肽如GLP-1和GLP-2；生长因子如上皮生长因子(EGF)；淋巴因子如白细胞介素-6和-8(IL-6，IL-8)。为利于分离得到真正的蛋白形式，即没有添加的氨基端蛋氨酸残基，通过在表达融合蛋白之后剪切而产生。例如，编码目的蛋白的DNA可以编码信号肽的DNA为先导，如大肠杆菌外膜蛋ompA。此例中表达基因产生一种融合蛋白，包含氨基端有蛋氨酸的opmA信号肽，其后接目的蛋白。信号肽载运融合蛋白穿过细菌内膜，在此信号肽被剪切。可用的其他信号肽包括碱性磷酸酶，大肠杆菌热稳定肠毒素II和由链球菌得来的蛋白A。或者，融合蛋白可通过独立的过程合成及剪切，从而得到目的蛋白。例如可以通过凝血酶或X10(GST)从目的蛋白切除下谷胱甘肽-S-转移酶。
在本发明的特定方案中，编码区包含人类PTH的DNA，其氨基酸序列由Hendy等(美国国家科学院会议录，1981，787365)描述。此例中所描述的编码PTH的DNA序列直接和编码ompA信号肽的DNA相连，并符合读码框架。
DNA构建物的优选方案由图1显示，用亚磷酰胺的方法由单链寡核苷酸合成，具有lpp或lacUV5间隔区。凝胶纯化的链包括XhoI和EcorI限制性内切酶之间的序列，作为PCR反应的起始靶物，用能和起始寡核苷酸序列或其互补链末端特异杂交的互补单链寡核苷酸DNA扩增成双链DNA片断。这样，用标准的基因合成方法，如Maniatis等(“分子克隆”冷泉港实验室，1982)和Lnnis等(PCR原理，方法和应用手册)所述，制备构建物。
本发明另一方面提供了能用于产生细菌宿主细胞转化体的表达载体，它包括本发明所述的重组DNA构建物。用现有技术，可将本发明的DNA构建物象一个“盒子”包括于载体内，优选质粒载体。一般在和盒子任一末端限制性内切酶切点相应的限制性内切酶位点消化质粒。然后通过连接其末端至载体上的互补性切开位点而导入盒。
尽管源自细菌噬菌体的载体也可用，质粒载体如pBR322和pUC系列更优选。一旦参入合适的载体，可以在宿主中扩增此载体，为下一步亚克隆提供足量原料。应当理解编码选定的蛋白的DNA用标准的克隆/连接方法可以方便地利用质粒所提供的多克隆位点参入质粒。质粒还需参入一个复制起点，最好能参入适当的标记如氨苄或四环素抗性基因，以利于转化细胞的筛选。应当理解，三种读码框架的翻译终止子和正确定位转录终止区是满意地表达目的蛋白所必需的。合适的转录终止子包括大肠杆菌trpA，thr，his和phe基因的转录终止子。
一旦编码目的蛋白的DNA插入载体，可用标准的氯化钙转化法转化选择的细菌宿主。适合的细菌宿主包括革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和沙门氏菌。优选商业化的大肠杆菌，最优选JM101和其衍生菌株。
当DNA构建物的调控区包含下文详述的lac操纵子，转化的宿主菌株可表达、有时过量生产lacI产物，这样启动子的功能，因此蛋白表达可被调节。根据本发明的一个方案，利用已有lacIq基因使lacI产物过表达的宿主可满足某些转化株需lacI过表达的要求。可用作宿主的LacI过表达的大肠杆菌包括购自Clontech Laboratories Inc.，California，USA.的JM系列菌株。适用的具体菌株包括JM101，JM105和JM107。
或者可用本发明中参入lacIq基因的载体来满足转化株过表达lacI的需要。这种情况下LacI的过表达是由载体调节的，因此任一商业化的宿主菌株都可用，包括大肠杆菌DH1，RR1，C600，CMK603和EB505菌株。参入于载体的lacIq基因可作为1.2kb的质粒pMMB22的HindIII片断(Bagdasrian等，基因，1983，26273)然后非破坏性地插入质粒载体的任一位点。
在某些特殊质粒中，为增强载体从初始转化菌到其后代的遗传稳定性，在大肠杆菌中起作用的分裂元件(par)也被接入载体。这样的par元件可作为一个来自pSc101的380bp HincII/AvaI片断，然后克隆到载体的合适位点。
将转化后带有表达载体的宿主细菌在最合适的培养基中生长。对大肠杆菌而言，LB或2YT培养基(酵母抽提物/胰蛋白胨)可用来培养此处优选的菌株。通过给以细胞毒性药物杀死未转化的宿主株维持对质粒转化的选择压力。例如，有四环素抗性基因质粒的转化株可在含四环素的培养基中生长。培养基中四环素浓度大约5-15微克/毫升比较合适。
可通过一个阻遏物分子结合到调控区中紧接启动子的操纵子上，优选调节构建物中的启动子。在优选方案中lacI基因产物结合在紧接启动子的lac操纵子上。本例中lacI产物的结合阻遏启动子，降低它所控制的编码DNA的表达。化学药品IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)可结合lacI，对启动子的脱阻遏。为提高表达水平，IPTG可加入培养基以对启动子脱阻遏且诱导表达，在细胞达到对数生长中期时加入IPTG较合适。
要决定能提供目的蛋白最大产量的培养物最优密度，需尝试进行蛋白浓度的时间曲线实验测定。一般地，一旦细胞达到对数中期时可回收相当多的蛋白产量，其后的4-5小时可期望更大量的蛋白累积。
目的蛋白可用本领域已建立的适合此蛋白的技术进行纯化。在本发明的具体方案中，表达的PTH可以从胞间质分泌进入培养基，在培养基中直接回收。蛋白分泌后，用过的培养基可用生化技术分离，利用蛋白的性质如分子量，净电荷，等电点，等。例如培养基可用冷冻干燥加以浓缩。进而如可以得到抗体或蛋白的天然配体，则可用亲合层析。本发明的特殊方案在此用图示举例说明。
实施例1PTH的成熟形式为84氨基酸的多肽，作用于人类升高血钙，调节骨形成。编码PTH的DNA按照Hendy等见上文发表的氨基酸序列用现有技术合成。包含于下面描述的构建物中，如图1所示。
优选方案的DNA构建物参入表1和图1中阐明的启动子#1和#2，同样包括启动子#3和#4，这些启动子是用亚磷酰胺法由寡核苷酸合成而来。凝胶纯化的链包括XhoI和EcorI限制性内切酶之间的序列，作为PCR反应的起始靶点，用能和起始寡核苷酸链或其互补链末端特异杂交的互补单链寡核苷酸DNA扩增成双链DNA片断。这样，用标准的基因合成方法，如Maniatis等(“分子克隆”冷泉港实验室，1982)和Lnnis等(PCR原理，方法和应用手册)所述，构建物制备完成。
然后构建物被克隆进四环素抗性取代氨苄抗性的pUC18衍生质粒。利用现有技术(参见Maniatus等“分子克隆”，冷泉港实验室，1982)转化JM101衍生的大肠杆菌宿主菌株。
实施例2 转化宿主的表达含有PTH载体的转化株先在30℃，含0.5％葡萄糖和四环素的2YT中过夜培养，然后转接至同样成份的培养基中30℃继续培养直到对数中期。培养物每隔一小时被诱导(1mM IPTG)，抽取等份培养物分段产生培养基样品，用标准Allegro法测定PTH产物的分泌。表1提供测定结果
表1
Allegro测定结果显示包含18bplppp和lacUV5序列的启动子利于高水平的外源蛋白PTH产生。启动子#3中间隔区为修改后的lac操纵子序列(lacO)取代，启动子#4中-35区和-10区源自细菌噬菌体T7，间隔区是lacO启动子，启动子#1和启动子#2比启动子#3和启动子#4更可取。用同样的启动子表达编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因获得相似结果，启动子#1和#2表达更强。同样，所研究的每一个启动子还表明和细菌噬菌体T5RBS结合都比和lac衍生的RBS结合显示更多蛋白产量。
权利要求
1.一种用来在细菌宿主中表达蛋白的重组DNA构建物，构建物包括可行地与调控区相连的蛋白编码区，调控区包括能使所述蛋白在宿主中表达的启动子，其中启动子区包括选自如下的DNA序列5’-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3’；和5’-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3’。
2.权利要求1的重组DNA构建物，其中所述启动子区包括DNA序列5’-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3’。
3.权利要求1的重组DNA构建物，其中所述细菌宿主是大肠杆菌。
4.权利要求3的重组DNA构建物，其中所述调控区还包括调节蛋白表达的操纵子。
5权利要求4的重组DNA构建物，其中操纵子是lac操纵子。
6.权利要求5的重组DNA构建物，其中蛋白是人PTH。
7.权利要求6的重组DNA构建物，还包括符合编码区读码框架的OmpA信号肽编码DNA，能使蛋白分泌到宿主周质。
8.权利要求3的重组DNA构建物，其中调控区包括T5核蛋白体结合位点，具有DNA序列ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC。
9.权利要求3的重组DNA构建物，具有图2定义的序列。
10.权利要求3的重组DNA构建物，具有图3定义的序列。
11.用于产生细菌宿主转化细胞的包含上述任一权利要求重组DNA构建物的载体。
全文摘要
本发明提供了一种用于在细菌宿主中产生蛋白的表达体系。该系统使用一种高效启动转录的新启动子,因而提高蛋白产率。该启动子包含大肠杆菌启动子共有序列的－35区,IppP－5启动子的－10区,以及来自Ipp－5或lacUV5启动子的、位于这两个区之间的间隔区。
文档编号C12N15/72GK1190993SQ96195518
公开日1998年8月19日 申请日期1996年5月16日 优先权日1995年5月19日
发明者P·A·拉勾斯基 申请人:阿斯特拉公司