利用异柠檬酸裂合酶活性被改变的微生物制备核黄素的制作方法

专利名称：利用异柠檬酸裂合酶活性被改变的微生物制备核黄素的制作方法
技术领域：
本发明涉及核黄素的一种微生物制备方法，其中该微生物含活性被改变的异柠檬酸裂合酶。
维生素B2，亦称核黄素，是人和动物体的必需成分。维生素B2缺乏会导致口腔和咽部黏膜炎症、口角裂口、皮肤皱褶处发痒和炎症及类似的皮肤损伤、结膜炎、视敏度下降和角膜浑浊。婴幼儿中可能发生生长停滞和体重下降。因此维生素B2作为一种用于维生素缺乏和食品添加剂的维生素制剂具有特别的经济价值。另外，它亦用做食品染色剂，例如蛋黄酱，冰激凌，餐末点心如牛奶冻中等等。
核黄素可以化学制备或微生物制备。在化学制备方法中，核黄素常作为一种纯净的终产物经多步程序得到，其中需要使用相对昂贵的起始化合物，例如D-核糖。
应用微生物制备核黄素提供了化学制备这种化合物的一种替代途径。可再生的原材料，如植物油类，可以用做微生物合成的起始化合物。
通过发酵真菌如棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或阿舒假囊酵母(Eremothecium ashybii)制备核黄素已有公开报道(默克索引(The MerckIndex)，Windholz等编，Merck & Co.，1183页，1983)；然而酵母，如念珠菌属和酵母属，和细菌，如梭状芽胞杆菌亦适合制造核黄素。过量产生核黄素的菌株已被描述过，如在EP 405370中就谈到可以通过转化来自枯草芽孢杆菌的核黄素生物合成基因而得到它们。然而，这些原核基因不适合于用真核生物如酿酒酵母或棉阿舒囊霉制备核黄素的重组方法。
WO 93/03183描述的是从真核生物如酿酒酵母克隆核黄素生物合成特异性基因。这些基因可用来构建重组真核微生物使其有效地生成核黄素。
然而常常是因为起始化合物和核黄素生物合成酶的底物在微生物体内数量有限，导致尽管核黄素生物合成活性增加，核黄素产量并不高。
因此本发明的目的即提供一种改良的制备核黄素的微生物方法，这种方法应用那些无底物限制或仅有轻微底物限制的微生物，从而使核黄素以更高的速率生产出来。
依据本发明，通过改变所用微生物体内的内源性异柠檬酸裂合酶活性，已经达到以上目的。这种活性改变可以与未改变活性的起始株比较得到测定。有很大范围的选择自由来得到ICL活性改变的微生物。
一种选择是改变内原性ICL基因，使其编码的酶与起始酶相比ICL活性增加。增加酶活性可以通过，如改变催化中心而增加底物转化，消除酶抑制剂影响，而达到目的。也可以增加酶本身的合成来增加酶活性，例如通过基因扩增或通过消除抑制酶生物合成的因素。内源性ICL活性增加优选通过促使内源性ICL基因突变而完成。这种性质的突变可以是采用标准方法，如紫外线照射或致突变的化学物质引起的随机突变；也可以是采用基因工程方法，如缺失，插入，或取代引起的特异性突变。
ICL基因表达的增强可以通过增加ICL基因的拷贝数和/或增强对ICL基因表达起正性调节的调控因子。这样，调控因子优选可在转录水平通过使用强转录信号如启动子和增强子来增强。然而，也可例如通过提高mRNA的稳定性来增强翻译。为了增加基因拷贝数，ICL基因可以掺入一个基因组建物或载体中，此基因组建物或载体优选含一个可作用于ICL基因的调控基因序列，特别用来增强基因表达。然后，用此含ICL基因的基因组建物转化产生核黄素的微生物。
优选从微生物中分离ICL基因，尤其是从真菌棉阿舒囊霉。然而其他生物，若其细胞内含有乙醛酸循环的回补序列，因而含异柠檬酸裂合酶，植物也一样，都适合从中分离ICL基因。分离ICL基因可以通过与ICL基因中的缺损突变体同源或异源互补，或异源探针，或用异源引物进行PCR而完成。关于亚克隆，互补质粒中插入子的大小可以通过适宜的限制酶酶切而减到最小。此推定基因经测序和确认后，通过融合PCR的方法，以精确的装配方式被亚克隆。所得片段以插入子形式插入质粒中。携带该片段的质粒导入ICL基因缺陷突变体，然后检测该突变体中ICL基因发挥功能的能力。最后，功能性组建物被用来转化核黄素生产菌。
分离和测序后，可以得到异柠檬酸裂合酶基因。此基因含有编码SEQ IDNO2给出的氨基酸序列或其等位变体的核苷酸序列。等位变体特别包括功能性衍生物，它们可由缺失、插入、取代SEQ ID NO1所示序列中的核苷酸而得到，不过仍然保留ICL活性。
一个具有SEQ ID NO1176-550核苷酸之核苷酸序列的启动子或一个具有基本同样效应的DNA序列被刻意放在异柠檬酸裂合酶基因上游。这样，位于该基因上游的启动子能够通过一个或多个核苷酸取代，或(一个)多个插入和/或缺失与含指定核苷酸序列的启动子有所区别，但是此启动子的功能和效用不受损伤。而且，此启动子的效用可通过改变序列得到加强，或完全被更有效的启动子取代。
进一步讲，多个特别增加ICL基因活性的调节性基因序列或调控基因可被指定给ICL基因。因此，增强子可被指定给ICL基因，其通过增加RNA聚合酶和DNA的相互作用增强ICL基因的表达。
一个或多个DNA序列可被置于异柠檬酸裂合酶基因上游和/或下游，可伴有或不伴有上游启动子和/或调节基因，而使异柠檬酸裂合酶基因包含在一个基因结构中。
通过克隆ICL基因，有可能得到含ICL基因且如上文提到适于转化核黄素生产菌的质粒或载体。那些通过转化得到的细胞，优选棉阿舒囊霉中，含有可复制基因，也就是说在染色体中有额外的相同拷贝。这些基因拷贝可通过同源重组整合在基因组任何想要的位点，和/或在质粒或载体中。
产生ICL活性改变的生产微生物的另一选择是制造那些耐受抑制ICL活性物质的微生物，并把它们选择出来。异柠檬酸裂合酶(ICL)抑制剂已为技术人员所知，并列举在如《酶抑制剂手册》(Handbook of EngymeInbibitors)第291页，编者Hellmut Zollner，Verlag Chemie，Weinheim，1993.特别合适的抑制剂是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，6-磷酸-葡萄糖酸和马来酸，尤其是衣康酸和草酸。
如果生产核黄素的微生物株在以上抑制剂存在的情况下培养，会令人吃惊地出现核黄素合成抑制。在培养板上，这可以通过形成不变黄色而仍保持白色的菌落得到显示。所以应用此系统，那些耐受异柠檬酸裂合酶抑制菌株可以迅速被辨认出来。因为这些菌株在抑制剂存在的情况下也能生产核黄素，从而形成黄色的菌落。这种性质的菌株可以通过自发突变形成，也可以通过常规方法如化学方法或紫外线照射诱导出的合适突变形成。如此就有可能得到向培养基分泌更多量核黄素的微生物株。具体得到的核黄素合成增加的抗性株是棉阿舒囊霉菌株，该菌株以保藏号10067保藏在DSM[德国微生物保藏中心]。
这种新颖方法优选选用真菌作为微生物。合适的真菌例子列举在《印度化学工程》(Indian Chem.Engr.)，B部，37卷，第1，2号(1995)第15页表6中。
那些属于皮契茄属、假囊酵母属和阿舒囊霉属，尤其是棉阿舒囊霉的微生物是特别合适的。
然而，除真菌以外的微生物，例如细菌，尤其是在《印度化学工程》，B部，137卷，1，2号(1995)第16页表6中列出的细菌，也可以使用。
实施例1棉阿舒囊霉基因组文库的构建用Wright和Philippsen方法(1991，基因(Gene)10999-105)分离染色体DNA用来构建基因组DNA文库。DNA先用Sau 3A不完全消化，再用蔗糖密度梯度分级分离。最长的片段(图4)与Bam HI切割的大肠杆菌/酿酒酵母菌穿梭质粒YEp352(J.E.Hill等，1993，酵母(Yeast)2；163-167)连接。用连接混合物转化大肠杆菌DH5a。在含氨苄青霉素和X-Gal的平板上，3600个可辨认的白色克隆被分离出来。它们被认为是因为含有携带插入片段的质粒而呈白色的。当随机挑选其中30个克隆来研究时，发现它们的确都含有质粒。这些质粒含有7-8Kb的插入片段，并且这些插入片段并不相同。这些情况从限制性酶切图谱上看一目了然。基于棉阿舒囊霉基因组有7X103Kb大小，因此每一个基因都存在于此基因文库中的几率是97％-99.99％。每100个克隆在琼脂平板上大量划线培养，所含质粒随后制备成库。结果该基因文库包含了36个质粒库。
实施例2基因文库中携带ICL1片段的挑选基因文库中的质粒制品被用来转化酿酒酵母ICL1dura3(fs)(E.Fernandez等，1992，欧洲生化期刊(Eur.J.Biochem.)，204983-990)。该突变株本身的ICL1基因遭到破坏，ura3基因在本身的阅读框架上也存在突变。由于这样的基因型，此株不能以乙醇作为碳源生长从而表现尿嘧啶营养缺陷。第一步，被基因文库转化的酵母细胞在葡萄糖为其唯一碳源的基本培养基上筛选。由于ura3基因存在于质粒中，仅有那些吸收了质粒的细胞能够生长。这是因为基本培养基内不含任何尿嘧啶。这一步得到了1900个克隆。这些克隆通过复制铺板转移到含乙醇作为唯一碳源的基本培养基上。由于异柠檬酸裂合酶(一种回补酶)是在菌株靠乙醇生长时无条件需要的，因此仅那些所含质粒携带了ICL基因的克隆能够生长。这样分离到能够靠乙醇生长的两个克隆。
实施例3基因文库分离片段行使功能的能力检测为了检测染色体ICL缺陷互补是否由质粒编码完成的，所选酵母克隆在含尿嘧啶的完全培养基上培养两次。所得细胞在培养板上呈单菌落生长。在随机挑选的16和13个克隆中，分别有7和5个克隆不再能够在含葡萄糖的基本培养基上生长，同是这些克隆也不再能在含乙醇的基本培养基上生长。因此质粒消除就与ICL1d互补丧失联系起来。
质粒从两克隆之一被重新分离。它含大约8Kb长的插入子。酵母突变株的重新转化导致发现的所有克隆都有互补现象。可以利用SphI把8Kb的片段缩短到具有全部功能的2.9Kb大小。
在依赖乙醇生长的转化体的粗提取物中，发现了0.3U/mg蛋白质的特异性异柠檬酸裂合酶活性。另外，应用抗阿舒囊霉ICL多克隆抗体，蛋白质印迹法可显示出清楚的信号。
应用根据ICL胰蛋白酶分解肽推出的引物，PCR显示了所期望大小片段的强信号。用双向凝胶电泳分离蛋白质。此蛋白质用胰蛋白酶分解成多肽。用Edman降解法对这些多肽行末端测序。把这些肽的序列与数据库中的相比发现，它们与酿酒酵母异柠檬酸裂合酶有70％以上的一致性。根据这些序列设计的引物被用来进行PCR。大约8Kb互补基因文库片段的3.3Kb被测序(Sanger等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74(1977)5463-5467)。经与数据库比较，在已确定序列中发现了两个编码区。一个含1680个碱基的阅读框架(SEQ ID NO；1)与酿酒酵母ICL1基因有65％的一致性；ICL基因处于一个与酿酒酵母Ser-tRNA序列有84％一致性的序列上游375个碱基部位(SEQ ID No1)。
实施例4
亚克隆的ICL在大肠杆菌/酵母/阿舒囊霉穿梭质粒中发挥功能的能力两个经限制性酶切得到的片段和一个分离的基因文库片段的PCR产物(图5)被克隆进pAG100质粒(图6)。此质粒由Steiner和Philippsen构建(1994，Mol.Gen.Genet 242263-271)。这两个片段是2.9Kb的SphI片段(pAG100icl.4)和2.2Kb的Bg1 I/Eco RV片段(pAG 100 icl.6).这两个片段都含Ser-tRNA。因此，还进行了推定基因和融合的Bam HI切割位点(pAG100 icl.8)的PCR扩增。这三个DNA均被克隆进pAG100质粒的Bam HI位点。此质粒再用来转化酵母突变株酿酒酵母ICL1d ura3(fs)。这三个构建物完全互补了ICL1d的缺陷。也就是说，它们携带功能基因。
实施例5携带ICL的质粒对棉阿舒囊霉形成核黄素的影响以上所述质粒对棉阿舒囊霉的转化(方法Wright和Philippsen，1991，基因10999-105)导致了核黄素形成显著增加。这些菌株在装有两个隔板的500ml摇瓶中培养。每瓶盛50ml含10g/L大豆油，10g/L酵母提取物和200μg/ml遗传霉素的培养基。对照株棉阿舒囊霉pAG100胞内质粒无任何插入子，两天后产生18.7±0.1mg/l核黄素。棉阿舒囊霉pAG100.4和棉阿舒囊霉pAG100.6株则分别产生31.2±6.1mg/l和31.0±2.0mg/l的核黄素(图7)。由于其高度变异性，不可能去测量异柠檬酸裂合酶比活性的显著变化。在补充了3g/l甘氨酸的培养基中，棉阿舒囊霉pAG100.8株三天内产生了65±5.6mg/l核黄素。与此对照，通过直接对比，棉阿舒囊霉pAG100对照株仅形成了29.9±1.8mg/l核黄素(图8)不可能去测量异柠檬酸裂合酶比活性和菌丝体干重的显著性差异。
实施例6异柠檬酸裂合酶(ICL)的纯化为鉴定对ICL有抑制效应的物质，棉阿舒囊霉ICL首先被纯化出来。此真菌菌丝体在植物油上长出后，分离纯化该酶。纯化的每一步骤都简要列于表1。从此表可看出，大约25g菌丝体经弗氏压碎器破坏细胞后得到的典型粗提取物有220单位的ICL活性。经40,000g离心后，回收到约78％的酶活性，并在上清液中呈溶解状态。随后用硫酸铵沉淀法分级分离使此酶富集为原来的三倍。通过SephacrylS-300柱凝胶过滤后，ICL被结合在阳离子交换剂Mono S-琼脂糖凝胶上，然后被氯化钠洗脱。所得制剂通过SDS聚丙稀酰铵凝胶电泳均质后具有18.4U/mg的比活性。
实施例7ICL抑制剂的鉴定通过比色实验(Dixon，H.和Kornberg，H.L.(1959)，生化杂志(Biochem.J.)72，3乙醛酸循环关键酶的检测法)，纯化的酶可以用来测定其它物质对其活性的影响。所测物质对纯化酶的影响总结和描绘在表2和

图1中。所研究物质包括那些真菌细胞中对酶可能有抑制效应的代谢物。其中，6-磷酸-葡萄糖酸和磷酸烯醇丙酮酸表现出最明显的抑制效应。在10mM浓度时，抑制大于50％。然而，被认为不参加真菌代谢的衣康酸和草酸基本上都表现出显著的更大的抑制效应。在浓度为1mM时，各自有78％和95％的抑制。
实施例8衣康酸选择性突变株的鉴定所分离真菌孢子中遗传物质的突变可通过紫外线照射孢子而产生。当照射剂量达到只有10-20％的孢子存活时，就能得到耐受衣康酸对核黄素形成抑制的突变株。当用此法分离得到的突变株在大豆油中生长时，它产生的核黄素比原株高25倍(图2)。ICL比活性在核黄素形成期升高了15％(图2)。利用抗体可证明蛋白质数量增加。就对衣康酸抑制的反应来说，来自突变株的ICL有与起始株一样的反应。
实施例9核黄素形成与ICL比活性的相关性观察发现，当葡萄糖作为底物存在时，真菌仅在葡萄糖消耗后才开始产生核黄素。这令人吃惊地表明ICL和核黄素形成之间有因果关系。简言之，当其在油中生长时先前被葡萄糖抑制的ICL在粗提取物中也变成可测量的了，并且其活性升高到如前所述的水平(图3)。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称BASF Aktiengesellschaft(B)街道Carl-Bosch-Strasse 38(C)城市Ludwigshafen(E)国家联邦德国(F)邮政编码D-67056(G)电话号码0621/6048526(H)传真0621/6043123(I)电传1762175170(A)名称Forschungszentrum Juelich GmbH(B)街道Leo-Brandt-Strasse(C)城市Juelich(E)国家德国(F)邮政编码D-52425(G)电话号码02461/613004(ii)申请名称利用异柠檬酸裂合酶活性被改变的微生物制备核黄素(iii)序列数2(iv)电脑可读形式(A)媒体类型软磁盘(B)电脑IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentin Release #1.0，#1.25版本(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特性(A)长度2364碱基对
(B)类型核酸(C)链型 双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA到mRNA(iii)假拟结构无(iii)反义无(ix)特性(A)名称/关键词5′UTR(B)位点1..550(ix)特性(A)名称/关键词CDS(B)位点551..2233(ix)特性(A)名称/关键词3′UTR(B)位点2234..2364(xi)序列描述SEQ ID NO1CGAAAGCGCC AAATACCGGA AACGGCACAG GCGCAGCTCT AATAGCCGTT CCACGATAAC 60TTTGGAAGTT ATGGCACTAT GGCCGAGTGG TTAAGGCGAC AGACTTGAAA TCTGTTGGGC 120TCTGCCCGCG CTGGTTCAAA TCCTGCTGGT GTCGTTATTT TTGCCGTTTC TTTTTAGATG 180AAACTCAGGG GCCTTTAGTC CGCCCTTTTG CCCGCTGATT CATCGCCCGC CAGCAACACC 240GGTTGAGCCG ATCAGCGCAA GAACGCGCAA AGTCACGTAT GGCCCCTAAG AGTTGAGCTC 300TCCCCCTCGG CTCCTTCCGG GCGCGGAAAA GCCTGCGTCA CCCCATTAAG TCCGAAACCG 360CGTTCAAGTG TACTTGGTCC GGGCCAATGT GGTTGCCTCA TCCGAGTCAC CGATACGCAG 420GTGCGCCCGT CGAGTCACCA TTAGGAGTAG AGCATCTGAT TATATATAGG CCTAGTTACA 480GCGGTAACAT AGACTGATAG CTCCAGCTCC AGCACTAGCT TGTAGGACAT CTGCGCGACA 540CCCAGTGAAC ATG TCC CCT TCC GTC AGA GAC GCC CGC AAC GAC CTT GCC589Met Ser Pro Ser Val Arg Asp Ala Arg Asn Asp Leu Ala1 5 10AGC CTG CAA CAG CAG GCA GCC GCC GAA GCC GAG GAT ATT AGG AGA TGG 637Ser Leu Gln Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Glu Asp Ile Arg Arg Trp15 20 25TGG AGC CAG CCA CGG TGG GCG GGC ACC AAG CGC GTG TAC ACG GCC GAG 685Trp Ser Gln Pro Arg Trp Ala Gly Thr Lys Arg Val Tyr Thr Ala Glu30 35 40 45GAC ATC GTC AAG CGC CGC GGC ACG TTC CCT GTC GTC GAA TAC CCA TCT 733Asp Ile Val Lys Arg Arg Gly Thr Phe Pro Val Val Glu Tyr Pro Ser50 55 60TCC GTA ATG GCG GAC AAG CTC GTG GAG ACA TTG GCG CGG CAC TCG CGC 781Ser Val Met Ala Asp Lys Leu Val Glu Thr Leu Ala Arg His Ser Arg65 70 75AAC GGC ACG GTT TCA CAG ACG TTC GGA GTG CTC GAC CCA GTG CAA ATG 829Asn Gly Thr Val Ser Gln Thr Phe Gly Val Leu Asp Pro Val Gln Met80 85 90ACG CAA ATG GTG AAG TAT CTG GAC ACG ATT TAC GTG TCT GGC TGG CAA 877Thr Gln Met Val Lys Tyr Leu Asp Thr Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln95 100 105TGC AGC GCC ACG GCT TCG ACC TCG AAC GAG CCT GGG CCC GAT CTC GCG 925Cys Ser Ala Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Gly Pro Asp Leu Ala110 115 120 125GAC TAT CCG ATG GAC ACC GTG CCA AAC AAG GTC GAG CAC CTG TTC ATG 973Asp Tyr Pro Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Phe Met
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560GCCAGACTTC TGGAATATAT ATAACATCGG GTACCCCGAC ATCCCTGCCT TCCGCAACGT2330GCGAAGCAGC TGATACGTAT ACTTTAAACG CACA2364(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度560个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Pro Ser Val Arg Asp Ala Arg Asn Asp Leu Ala Ser Leu Gln1 5 10 15Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Glu Asp Ile Arg Arg Trp Trp Ser Gln20 25 30Pro Arg Trp Ala Gly Thr Lys Arg Val Tyr Thr Ala Glu Asp Ile Val35 40 45Lys Arg Arg Gly Thr Phe Pro Val Val Glu Tyr Pro Ser Ser Val Met50 55 60Ala Asp Lys Leu Val Glu Thr Leu Ala Arg His Ser Arg Asn Gly Thr65 70 75 80Val Ser Gln Thr Phe Gly Val Leu Asp Pro Val Gln Met Thr Gln Met85 90 95Val Lys Tyr Leu Asp Thr Ile Tyr Val Ser Gly Trp Gln Cys Ser Ala100 105 110Thr Ala Ser Thr Ser Asn Glu Pro Gly Pro Asp Leu Ala Asp Tyr Pro115 120 125Met Asp Thr Val Pro Asn Lys Val Glu His Leu Phe Met Ala Gln Leu130 135 140Phe His Asp Arg Lys Gln Arg Glu Ala Arg Leu Ser Cys Thr Thr Gln145 150 155 160Arg Glu Leu Asp Gln Leu Gly Pro Glu Ile Asp Tyr Leu Arg Pro Ile165 170 175Val Ala Asp Ala Asp Thr Gly His Gly Gly Leu Thr Ala Val Phe Lys180 185 190Leu Thr Lys Met Phe Ile Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile His Met Glu195 200 205Asp Gln Ser Ser Ser Asn Lys Lys Cys Gly His Met Ala Gly Arg Cys210 215 220Val Ile Pro Val Gln Glu His Ile Ser Arg Leu Val Thr Val Arg Met225230 235 240Cys Ala Asp Val Met His Ser Asn Leu Val Leu Val Ala Arg Thr Asp245 250 255Ser Glu Ala Ala Thr Leu Leu Ser Ser Asn Ile Asp Ala Arg Asp His260 265 270Tyr Tyr Ile Val Gly Ala Ser Asn Pro Glu Val Thr Val Pro Leu Ile275 280 285Glu Val Leu Asp Ala Ala Gln Gln Ala Gly Ala Ser Gly Asp Arg Leu290 295 300Ala Gln Leu Glu Glu Asp Trp Cys Lys Lys Ala Lys Leu Arg Leu Phe305 310 315 320His Glu Ala Phe Ala Asp Gln Val Asn Ala Ser Pro Ser Ile Lys Asp325 330 335Lys Ala Gly Val Ile Ala Lys Phe Asn Ser Gln Ile Gly Pro Gln Thr340 345 350Gly Ala Ser Ile Arg Glu Met Arg Lys Leu Gly Arg Glu Leu Leu Gly355 360 365Gln Asp Val Tyr Phe Asp Trp Asp Leu Pro Arg Ala Arg Glu Gly Leu370 375 380Tyr Arg Tyr Lys Gly Gly Thr Gln Cys Ala Ile Met Arg Ala Arg Ala385 390 395 400Phe Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Phe Glu Ser Asn Phe Pro Asp405 410 415Phe Gln Gln Ala Lys Glu Phe Ala Gln Gly Val Arg Glu Lys Phe Pro420 425 430Asn Lys Trp Met Ala Tyr Asn Leu Ser Pro Ser Phe Asn Trp Pro Lys435 440 445Ala Met Pro Pro Lys Glu Gln Glu Asn Tyr Ile Gln Arg Leu Gly Glu450 455 460Ile Gly Tyr Val Trp Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Leu His Thr Asn465 470 475 480Ala Leu Ala Ile Asp Asn Phe Ser Arg Glu Phe Ser Arg Phe Gly Met485 490 495Arg Ala Tyr Ala Gln Gly Ile Gln Gln Arg Glu Met Asp Glu Gly Val500 505 510Asp Val Leu Lys His Gln Lys Trp Ala Gly Ala Glu Tyr Val Asp Ser515 520 525Ile Leu Lys Leu Ala Gln Gly Gly Val Ser Ser Thr Ala Ser Met Gly530 535 540Lys Gly Val Thr Glu Glu Gln Phe Gly Ser Ser Asn Gly Ala Lys Leu545 550 555 560
表1
表权利要求
1.核黄素的一种微生物制备方法，其中先把生产核黄素的微生物在营养培养基中培养，然后分离产生的核黄素，它包括应用内源性异柠檬酸裂合酶被改变的微生物。
2.根据权利要求1的方法，其中由于内源性ICL基因的突变，该微生物显示出一种有较高ICL活性的酶。
3.根据权利要求1的方法，其中由于ICL基因拷贝数的增加，该微生物有更高的ICL基因表达。
4.根据权利要求1的方法，其中ICL基因已与增强ICL基因表达的调节性DNA序列功能性连接。
5.根据权利要求1的方法，其中使用耐受ICL抑制性物质的微生物。
6.根据权利要求5的方法，其中微生物耐受衣康酸和草酸。
7.根据权利要求1到6任一项的方法，其中真菌被用作微生物。
8.根据权利要求7的方法，其中来自阿舒囊霉属的真菌被用作微生物。
9.一种ICL基因，其编码SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
10.一种包含根据权利要求9的ICL基因的基因组建物。
11.根据权利10的基因组建物，其中ICL基因已与一个或多个增强基因表达的调节信号功能性连接。
全文摘要
本发明公开了核黄素的一种微生物制备方法,其中先把生产核黄素的微生物在营养培养基中培养,然后分离产生的核黄素,它包括应用内源性异柠檬酸裂合酶(ICL)活性被改变的微生物。
文档编号C12N1/15GK1193356SQ96195479
公开日1998年9月16日 申请日期1996年7月10日 优先权日1995年7月13日
发明者B·卡斯尔, H·萨姆, K－P·斯塔曼, G·施密德, T·博德克尔, H·瑟尔伯格 申请人:巴斯福股份公司, 尤里西研究中心有限公司