一种植物淀粉合成酶基因启动子及其应用的制作方法

专利名称：一种植物淀粉合成酶基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到植物分子生物学与基因工程领域，具体涉及到一种从玉米基因 组中分离出来的淀粉合成酶基因的启动子，以及该启动子驱动目的基因表达的时 空特异性及其在植物淀粉改良和植物生物反应器中的应用。
背景技术：
淀粉不仅是食品和词料的主要来源，而且还广泛应用于医药、化工、纺织、 造纸、建筑和塑料工业等多个领域，对于经济发展具有举足轻重的作用。
高等植物中，淀粉合成的主要场所是淀粉体和叶绿体。叶绿体中的淀粉一般 是白天合成作为临时的储备碳源，而晚上则降解供其它代谢使用，所以称之为临 时淀粉；淀粉体中合成的淀粉则是种子的贮藏物质，以作为种子发芽时的营养物 质。人们日常所用的一般是贮藏淀粉。
淀粉是在一系列酶的参与下共同合成的。在叶绿体中，卡尔文循环固定C02，
并形成3-磷酸甘油酸(3-PGA)，然后转化为磷酸丙糖(TP)。 TP可以通过丙糖-磷酸易位体，转运至胞液中，或在叶绿体中转变成6-磷酸果糖(F-6-P)，先后转变 成6-磷酸葡萄糖(G-6-P)和l-磷酸葡萄糖(G-l-P)。 G-l-P在ADP-葡萄糖焦磷酸化 酶(AGPase)作用下形成ADPG;贮藏器官中合成淀粉的原料来自叶片中合成的或 临时淀粉降解产生的蔗糖，它通过韧皮部长距离运输至贮藏器官。蔗糖在胞液中 蔗糖合成酶的作用下分解为果糖和UDPG，继而形成G-6-P或G-l-P,再形成 ADPG。 ADPG是淀粉合成的直接前体，淀粉合成酶(SS)将ADPG分子上的葡 萄糖残基转移到葡聚糖引物的非还原端，延长葡聚糖链。淀粉合成酶根据其存在 状态，又可以分为可溶性淀粉合成酶(SSS)和颗粒结合性淀粉合成酶(GBSS)， 两种形式的淀粉合成酶都有多种同形体存在。当淀粉合成酶以a-l， 4糖苷键将 葡聚糖链延长到DP〉12时，淀粉分支酶(SBE)就能够切开a-l， 4糖苷键并 重新形成a-l， 6糖苷键来形成葡聚糖链中的分支，从而形成支链淀粉，淀粉分 支酶也存在多种同形体。SBE对葡聚糖链的分支是没有规律的，支链淀粉有规律的簇的结构还必需依靠去分支酶(DBE)的修剪来实现。
淀粉因其在人类生活中的重要地位，所以对于淀粉的研究一直没有中断过。 随着淀粉合成过程中相关酶基因的克隆，人们越来越多地利用基因工程改良淀粉 含量和品质， 一方面，期望通过基因工程手段进一步阐明淀粉的生物合成过程， 另一方面，希望利用基因工程来调节淀粉合成过程中特定酶的含量和活性，从而 达到增加淀粉含量或改造淀粉品质的目的。现有的研究中对淀粉合成途径进行改 良主要有利用反义RNA技术或RNA干扰技术抑制特定淀粉合成关键基因的表 达，从而达到改变淀粉结构的目的。植物的GBSS主要负责合成直链淀粉和支链 淀粉的长链，如抑制GBSS基因的表达将可以提高支链淀粉的含量。Visser等 (1991， Mol.Gen.Gent， 225, 289-296)利用反义RNA技术使马铃薯块茎中的 直链淀粉含量减少70%-100%,李加瑞等(2005， Acta Genetica Sinica， 32， 846-854) 和苗红梅等(2005，河南农业大学学报，39， 243-248)分别通过反义RNA技术 抑制了小麦GBSSI的表达，获得了高支链淀粉的小麦。在提高直链淀粉含量方 面，顾铭洪等(专利申请号03158351.2， 2003.9.25)通过抑制水稻We7基因 的表达培育出了高直链淀粉含量的水稻，柴晓杰等(2005，植物生理与分子生物 学学报，31， 625-630)通过抑制玉米de26的表达，提高了籽粒直链淀粉的含 量。其次就是通过过量表达淀粉合成关键酶基因，从而提高淀粉含量的研究，这 方面的研究主要集中在转入编码AGPase的基因方面。在基因工程改良淀粉生物 合成中，都必须选择合适的启动子来驱动外源基因的适当表达才能实现，曾有研 究显示，组成型启动子过量表达外源AGPase对植物是有害的，而贮藏器官特异 性启动子则没有影响(Stark， et.al， 1992， Science, 258， 287-292)。以往基因 工程调控淀粉生物合成的研究中多选用谷类贮藏蛋白基因等胚乳特异性启动子， 与组成型启动子相比，虽然这些启动子能正确驱动外源基因在淀粉合成的特定组 织和器官中表达，但表达的强度和时期并不理想。对淀粉生物合成途径的改良最 好用植物自身的淀粉合成关键酶基因启动子，这样不仅可以保证外源基因在植物 体内合适部位正确表达，而且能够保证外源基因表达强度和表达时期与植物自身 淀粉合成关键酶基因一致，这样才能更好的调控淀粉的生物合成。
目前玉米中已经发现了 10种淀粉合成酶基因，其中玉米淀粉合成酶I(zSSI) 是最关键的酶之一。有研究显示，玉米胚乳中SSS活性主要依赖于zSSI和玉米 淀粉合成酶III (zSSIII)， zSSI单独就占了胚乳SSS总活性的90%以上(Cao， etal.， 1999， Plantphysiol， 120， 205-215)，而且zSSI还可能起始淀粉的生物合成(Guan， et.al.， 1998， Trends in Glycosci Glycotech， 54， 307-319)，由此可见 zSSI的重要性。zSSI的编码基因z5W在玉米基因组中是一个单拷贝基因，检测 不同玉米组织中^SW基因转录的mRNA，发现在玉米的胚乳中大量存在，叶片、 叶脉、种皮中也有表达，而在根中不表达，表明该基因可能具有种子或胚乳特异 性表达和光调控表达两种机制，也即是说该基因的启动子中种子或胚乳特异表达 的元件和光调控元件同时存在。

发明内容
本发明的目的是提供一种淀粉合成酶基因的启动子，该启动子来源于玉米 (Zea wa,丄)，具有序列表中SEQ ID No:l所示的核苷酸序列，由1655个碱基 组成，是编码zSSI的基因z&7的启动子。
本发明人通过设计特异巢式引物，以玉米基因组为模板，利用SON-PCR法 从玉米中分离了 z&7基因启动子，并初步研究了其在玉米中的表达特性。 Real-Time PCR检测证明该启动子能启动基因在叶片、叶脉、种子中表达，而在 根中不表达。用该启动子替换pCAMBIA1301载体上的35S启动子与报告 基因连接后，通过粒子轰击法转入玉米胚乳发现该启动子能启动基因的高 效表达。本发明的技术方案为 一dW基因表达部位分析
首先提取玉米不同时期不同组织总RNA，用TOYOBO公司反转录试剂盒按
以下体系做反转录
总RNA 500-1000吗
5 xRT Buffer 4 jiL
dNTP Mixture (各10 mmol/L) 2 RNase Inhibitor (10 U/pL)1 |iL Oligo(dT)20 1 nL
ReverTraAce 1 jjL
用RNase-Free H20补至 20 |_iL
反应条件为42°C 20min 99 °C5 min
然后将反转录产物稀释10倍作为模板进行Real-Time PCR检测，内参基因 选用玉米A:^^7基因。标准曲线用反转录产物倍比稀释作模板制定。所用到的 引物序列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同)Pal: 5'—- GTTGGGCGTCCTCGTCA-— 3' Pa2: 5'—- TGGGTCATCTTCTCCCTGTT — 3，
Z5W引物
Psl: 5，--- TTCGTGGATGGGTTGGATTTAGTG --- 3， Ps2: 5'國-國CCCTGTACCCTGCTCTCCATTCTC —- 3'
Real-Time PCR采用天根生化科技有限公司RealMasterMix试剂盒，反应体系为:
2xRea馳sterMix 12.5 |iL
引物l 0.5 (iL
弓1物2 0.5 (iL
cDNA模板 1.0 |iL
H20 10.5 nL
总体积 25 pL
反应程序为:
95 °C 95 °C 58。C 68 °C 82 。C 68 °C
1 min 20 sec 20 sec 20 sec 7 sec 5min
40 cycles
读荧光
Real-Time PCR检测显示，z&J基因转录的mRNA可以在胚乳、种皮、叶片-叶脉中表达，在根部没有表达。
二、 z&J基因5'侧翼序列的克隆
提取玉米基因组DNA，根据GenBank中z&7基因的mRNA序列(Accession No: AF036891 )设计两个反向巢式引物，用玉米基因组DNA为模板，用SON-PCR 法克隆zSW基因5'侧翼未知序列，LATaq酶购自TaKaRa公司，引物序列如下
Psonl: 5，- CACGGCCGAGGGCGTCGCCATTG-3，
Pson2: 5 ， - CATTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAGGAG墨3'
第一轮PCR反应体系如下
10xLAPCR buffer 5 |iL dNTP(10mmol/L) 5 (iL MgCl2 5 nL
gDNA(100ng/|iL) 0.5 Psonl(10mmol/L) 2 |iLLA Taq酶(5U/pL)0.5 fiL ddH20 32 总体积 50 |iL
PCR反应条件如下:
94 。C 3 min
94 °C 30 sec ，
60 °C 1 min 卜5 Cycles
72 。C 2.5 mirr^
94 °C 30 sec
29 °C 3 min
29 °C Ramp 3 min to 72 °C
72 °C 2.5 min
94。C 10 sec ，
60 °C 1 min 卜 60 Cycles
72 。C 2.5 mkr^
72 °C 7,5 min
第二轮PCR反应体系如下:
lOxLA PCR buffer5 (iL
dNTP(10mmol/L)
MgCl25 &
第一轮PCR产物0.5 (iL
Pson2(10 mmol/L)2 ^
LA Taq酶(5U/nL)0.5 (A
ddH2032 (A
总体积50
PCR反应条件如下:
94 °C 3 min 94 。C 30 sec -|
60 °C 1 min 卜 5 Cycles
72 °C 2.5 mi」
94 °C 30 sec
29 °C 3 min
29 °C Ramp 3 min to 72 °C 72 °C 2.5 min
94。C 10 sec ，
60 °C 1 min卜30 Cycles
72 °C 2.5 mi」
72 °C 7.5 minPCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，切取含最大长度的PCR产物胶块， 用DNA凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收，连接进pMD18-T 载体后进行测序，测序结果如SEQ ID No:l所示。
三、淀粉合成酶基因启动子在植物生物反应器中的应用
首先构建含"W基因启动子与报告基因融合的植物表达载体。根据SEQ ID No:l序列，设计合成含有限制性酶切位点的启动子引物，以连结在测序载体 pMD18-T上的1.6 Kb的序列为模板通过PCR扩增法克隆1.6 Kb的z&7基因启
动子序列。
Psel: 5' — CCAAGCTTTTGATGTTCTTTTTGTGTCTG —3' Pse2: 5， —- CGCCATGGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG —3' Psel划线部分为添加的州'^f/酶切位点，Pse2划线部分为添加的iVco/酶切位
将扩增出的1648 bp的启动子序列命名为z&IP，连接到pMD18-T测序载 体上，经Invitrogen公司测序，表明扩增没有出现错配。根据引物Psel和Pse2 两段设计的限制性酶切位点，用i/z'"必和Mro/将z&LP片段从pMD18-T载体上 切下，回收后与经历^/和iVco/双酶切的pCAMBIA1301载体片段连接。连接
反应体系如下 10xLA PCR buffer dNTP(10 mmol/L) MgCl2
Psel(10mmol/L;) Pse2(10 mmol/L) 模扳(10ng/pL) LA Taq酶(5U尔L) ddH20 总体积
5 (iL 5 |jL 5 (iL 2 fit 2 nL 0.5 pL 0.5 pL 30 |iL 50 nL
PCR反应条件如下
94 °C 94 °C 60'C 72 °C 72 °C产物转化DH5a菌株中，挑选阳性克隆送Invitrogen公司测序，证明连接正确。 将阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基上繁殖后用质粒小提试剂盒(天根生化科 技有限公司)提取质粒。
取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(无菌处理)作为基因枪 转化的受体，在含有高渗培养基(MS盐+0.4mol/L蔗糖)的培养皿(直径9cm) 中央2-3cm处渗透处理4h，然后用基因枪进行轰击，将构建的融合表达载体转 入玉米胚乳。28'C暗培养2天后，进行组织化学染色分析，结果表明，该启动子 能驱动基因的高效表达。
本发明的启动子的意义及应用价值在于 1.本发明通过Genomic walking法首次克隆了玉米淀粉合成关键酶基因 ZJSW的启动子序列，为确定淀粉合成酶基因启动子中的关键顺式作用元件，从而 揭示植物淀粉合成代谢的调控途径奠定了基础。
2. 本发明的淀粉合成酶基因启动子用于基因工程技术调控淀粉合成能在表 达部位和表达强度上与植物本身淀粉合成酶基因完全一致，能最大效果的起到调 控作用。
3. 本发明的启动子具有时空特异表达特性，能驱动目的基因在植物叶片和 种子中高效表达，而在根部不表达，在植物生物反应器研究中将有广泛的用途。


图1为Real-Time PCR检测z&7基因在不同组织中的表达情况
图2为SON-PCR扩增玉米z&7基因5，侧翼序列的电泳图谱
图3为z&LP片断构建到真核表达载体pCAMBIA1301上的图谱示意图
图4为基因启动子驱动报告基因的组织化学染色结果
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡 依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例l:玉米Z&7基因表达部位分析
1. 玉米不同时期不同组织总RNA的提取
取50-100mg新鲜或-7(TC液氮中保存的组织，用液氮研磨，置1.5mL离心管 中，加入l mLTrizol(购自Invitrogen公司)充分震荡，室温静置5 min。加入0.2 mL 氯仿，振荡15sec，静置2min。 4 °C 12000 r/min离心15 min,取上清。加入等体 积乙二醇丁醚，将管中液体轻轻混匀，冰浴静置l h。 4 °C 10000 r/min离心10min， 弃上清。加入l mL75。/。乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 °C 7500 r/min离心5 min，弃上清。 加入lmL100。/。乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 °C 7500 r/min离心5 min，弃上清，晾干， 加入适量的DEPC H20溶解。然后用核酸蛋白检测仪(BIO-RAD公司)测定浓度及 纯度，并用变性琼脂糖胶电泳检测RNA完整性。
2. RT-PCR
所有检测合格的RNA用TOYOBO公司反转录试剂盒按以下体系做反转录 总RNA 500-1000 pg
5 xRT Buffer 4 dNTP Mixture (各10 mmol/L) 2 pL RNase Inhibitor (10 U/(aL) 1 01igo(dT)2。 1 pL
ReverTraAce 1 |iL
用RNase-Free H20补至 20 pL
反应条件为42°C 20min
99 °C5 min
3. Real-Time PCR检测z5W基因在不同组织中的表达情况
将反转录产物稀释10倍作为模板进行Real-TimePCR检测，内参基因选用玉 米^^'W7基因。标准曲线用反转录产物倍比稀释作模板制定。所用到的引物序 列如下(所有引物均由Invitrogen公司合成，下同)
Pal: 5，--- GTTGGGCGTCCTCGTCA --- 3' Pa2: 5，--- TGGGTCATCTTCTCCCTGTT —- 3'
Z5W引物
Psl: 5，--- TTCGTGGATGGGTTGGATTTAGTG — 3' Ps2: 5，--- CCCTGTACCCTGCTCTCCATTCTC — 3'
Real-Time PCR采用天根生化科技有限公司RealMasterMix试剂盒，反应体系为 2xRealMaste鏡x 12.5 fiL引物l 引物2 cDNA模板 H20 总体积
反应程序为95'C 95 °C 58°C 68 °C 82'C 68 °C
0.5 &
0.5
1.0
10.5 |iL 25 |aL
1 min 20 sec 20 sec 20 sec
"7 S6C 5min
40 cycles
读荧光'
Real-Time PCR检测显示，z&7基因转录的mRNA可以在胚乳、种皮、叶片、
叶脉中表达，在根部没有表达。结果见图l。图l中，E:胚乳；P:种皮；R:根; L:叶片；LS:叶脉。数字为授粉后天数，根、叶片、叶脉取于授粉前14天。
实施例2、 z&7基因5'侧翼序列的克隆
1、 玉米基因组DNA的提取。
称取1.0g新鲜玉米叶片，剪成lcm的小段，放在预冷的研钵中，用液氮迅速 研成均匀的粉末，在组织没有溶解之前，将粉末全部装入5mL的离心管中，迅 速向离心管中加入2mL， 65'C温育的CTAB提取缓冲液，轻轻摇晃混匀后65 °C 水浴30min-lh，加入等体积的氯仿:异戊醇(24: 1)，混匀，轻微震荡15 min。室 温下，10000 r/min离心8min。吸取上清到一个干净的5 mL的离心管中。加入等 体积预冷的异丙醇(4°C)，室温下10000r/min离心5min 。弃上清，用75%乙醇 清洗沉淀两次，无水乙醇清洗一次。在真空干燥器中干燥10min，用适量的TE Buffer(10mMTris， lmMEDTA， pH8.0)溶解DNA，在每管中加入3 10 mg/mL RNaseA4 'C过夜降解基因组DNA中RNA。
2、 S0N-PCR扩增z&J基因5'侧翼序列
根据GenBank中z5W基因的mRNA序列(AccessionNo: AF036891)设计两个 反向巢式引物，用玉米基因组DNA为模板，用SON-PCR法克隆z&7基因5，侧翼未 知序列，LATaq酶购自TaKaRa公司，引物序列如下 Psonl: 5，- CACGGCCGAGGGCGTCGCCATTG-3， Pson2: 5' - CATTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAGGAG墨3'
第一轮PCR反应体系如下lOxLAPCR buffer 5
dNTP(10mmol/L) 5 (iL
MgCl2 5 )iL
gDNA(100ng/jxL) 0.5 (iL
Psonl(10mmol/L) 2 (iL
LATaq酶(5U/nL) 0.5 |iL
ddH20 32
总体积 50
PCR反应条件如下:
94 °C 3 min
94 °C 30 sec ，
60 °C 1 min 卜5 Cycles
72 °C 2.5 miir*
94 °C 30 sec
29 °C 3 min
29 °C Ramp 3 min to 72 °C
72 °C 2,5 min
94°C 10 sec 〕
60 °C 1 min 卜60 Cycles
72 °C 2.5 miJ
72 °C 7.5 min
第二轮PCR反应体系如下:
lOxLAPCR buffer 5
dNTP(10mmol/L) 5
MgCl2 5
第一轮PCR产物 0.5 (iL
Pson2(10 mmol/L) 2 |_iL
LATaq酶(5U/fxL) 0.5 (iL
ddH20 32 |iL
总体积 50
PCR反应条件如下
94 °C3 min
94 °C30 sec -|
60 。C1 min 卜
72 °C2.5 miir1
94 °C30 sec
29 。C3 min
29 °CRamp 3 min to 72
Cycles
72 °C
2.5 min94°C 10 sec ，
60 °C lmin卜30 Cycles
72 °C 2,5 mi」
72 °C 7.5 min
Hold 4。C
3、 PCR产物的电泳和回收 用1.0。/。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳结束，用凝胶成相系统
(BIO-RAD公司)照相分析(见图2)，切取含最大长度的PCR产物胶块，用DNA 凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收。
4、 DNA连接反应
在无菌Eppendor滑中加入1 10xT4 DNAligase Buffer, 4 pL回收的PCR 产物，1 inLpMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，1)aLT4 DNA连接酶(购自TaKaRa 公司)，3pL无菌ddH20，总体积为10^L。将各组分混匀，16。C中连接过夜。
5、 大肠杆菌感受态细胞的制备
挑取大肠杆菌DH5a单菌落到含有50mLLB培养基的三角瓶中，于37 。C振 荡培养过夜；取10^L到含有50mLLB培养基的三角瓶中，37 。C振荡培养到OD 600值为0.4-0.6;将培养好的的菌液转移到50mL的离心管中，冰浴10min;在4 °C， 5000r/min条件下离心5 min，去上清，收集细胞；用20mL冰预冷的0.1 mol/LCaCl2轻轻悬浮沉淀，在冰上放置10min;在4。C， 5000 r/min离心10 min， 用2 mL 0.1 mol/L CaCl2悬浮沉淀，按每管200 ^L分装细胞悬浮液于无菌的 Eppenfor滑中，用液氮快速冷冻，储存于-70'C。
6、 大肠杆菌的转化
在200 pL大肠杆菌感受态细胞中加入lO pLDNA连接产物，手指轻弹管壁， 混匀混合物，置于冰上30min; 42'C水浴热激处理卯sec，迅速放回冰上，冰浴 2-3min;加入800 LB培养液，混匀，37 。C振荡培养l h;将混合液涂布在氨苄 选择性培养基上，37'C过夜培养。
7、 阳性克隆的筛选和目的片断测序
从选择性培养基上挑取单个菌落，接种于3 mL含50ng/mL的氨苄LB液体培 养基中，振荡培养过夜(37。C， 200r/min)，用引物2做PCR检测后，送Invitrogen 公司测序，测序结果如SEQIDNo:l。
实施例3、淀粉合成酶基因启动子在植物生物反应器中的应用1、植物表达载体的构建
根据SEQIDNo:l序列，设计合成含有限制性酶切位点的启动子引物，以连 结在测序载体pMD18-T上的1.6 Kb的序列为模板通过PCR扩增法克隆1.6 Kb的 dW基因启动子序列。
Psel: 5' — CCAAGCTTTTGATGTTCTTTTTGTGTCTG —3' Pse2: 5' —- CGCCATGGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG —3' Psel划线部分为添加的所^Z/酶切位点，Pse2划线部分为添加的7Vco/酶切位点。
反应体系如下
10xLAPCR buffer 5 pL
dNTP(10 mmol/L) 5
MgCl2 5 (^L
Psel(lO mmol/L) 2 pL
Pse2(10 mmol/L) 2 ^tL
模扳(lOng/pL) 0.5 nL
LA Taq酶(5U/nL) 0.5 |iL
ddH20 30 pL
总体积 50
PCR反应条件如下
将扩增出的1648bp的启动子序列命名为z&LP，连接至UpMD18-T测序载体 上，经Iiwitrogen公司测序，表明扩增没有出现错配。根据引物Psel和Pse2两段设 计的限制性酶切位点，用历力W和iVco/将z&7P片段从pMD18-T载体上切下，回收 后与经历'/7必和iVco风酶切的pCAMBIA1301载体片段连接，构建过程见图3。连 接产物转化DH5a菌株中，挑选阳性克隆送Invitrogen公司测序，证明连接正确。 将阳性克隆在含卡那霉素的LB培养基上繁殖后用质粒小提试剂盒(天根生化科 技有限公司)提取质粒。 2、转化受体的准备
取玉米骨干自交系18-599授粉后8-12天的胚乳(无菌处理)作为基因枪转化 的受体，在含有高渗培养基(MS盐+0.4mol/L蔗糖)的培养皿(直径9cm)中央
94 。C 94 °C 60°C 72 °C 72 °C
8min 4°C2-3 cm处渗透处理4h，然后用基因枪进行轰击。
(1) 金粉的制备
称60 mg金粉(直径L6 pm， Bio-Rad)于1.5 mL的Eppendor惰(Thermo公司) 中，加入新鲜制备的lmL70。/。的乙醇(HPLC级)，置镟涡混合器上震荡3-5 min, 静置15min， 1000r/min离心3min，使金粉沉淀，弃上清液。重复下列步骤3次。 再加入lmL消毒蒸馏水，漩涡震荡lmin，静置lmin; 1000 r/min离心3 sec，使金 粉沉淀，弃上清液。加入灭菌的50%甘油，使金粉浓度达到60mg/mL。
漩涡震荡50%甘油中的金粉，沉淀5min,使之成为悬浮液，去掉粗堆集， 取50 ^L悬浮混合液于1.5 mL的管中，同时震荡，依次加入5 pLDNA(l pg/^L). 50 (jLCaCl2(2.5mol/L)， 20 pL亚精胺(0.1 mol/L，新鲜配置)，继续震荡2-3 min， 静置3 min(混匀后置于冰上5-10 min，使载体DNA分子充分沉降在微粒载体表面， 3000-5000 r/min离心2 sec，沉淀金粉DNA，弃上清液;加入150 70%乙醇，不 破坏沉淀块，弃上清液；加入150pL100。/。乙醇，不破坏沉淀块，弃上清液；加 入50pL100。/。乙醇，指弹管壁几次，使之重新悬浮，然后低速漩涡2-3 sec，就成 为可用的微弹了。每次取6^L微弹涂在载体膜中央，每次要尽量取出等量的微粒 子，并尽力作到均匀铺在载体膜(70。/。乙醇灭菌)中央3cm直径之内，自然条件下 干燥。
(2) 基因枪轰击
使用BIO-RAD公司生产的PDS-1000/He型基因枪进行转化，按照产品说明书 提供的方法操作。真空度为25mmHg，气压为1100psi，每皿轰击两枪。将轰击 后的胚乳转入琥珀酸钠培养液(20 mmol/L琥珀酸钠，20 mmol/L CaCl2， 10 pmol/L 氯霉素，PH=5.0) 25。C黑暗培养24h。
(3) 组织化学染色分析
取培养后的材料置于X-Gluc染色液[O.l mmol/LNaP04， (pH=7.0)， 0.5 讓ol/LK[Fe(CN)， 2 mmol/LX-Gluc、 1% Triton X-100， 1%DMS0， 10腿ol/L mmol/LEDTA]中，抽真空半小时后37'C保温过夜，在解剖镜下观察照相，结果 见图4。SEQUENCE LISTING
<110〉 四川农业大学
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<130〉 090106
<160> 9
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<210> 1
<211> 1655
<212> 腿
<213> 玉米属玉米(Zea mays. L)
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<223>人工序列<400〉 8
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<212>DNA
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<220>
<223〉人工序列
<400>9
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权利要求
1、一种淀粉合成酶基因的启动子序列，其特征在于，所述基因序列为序列表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 一种含有淀粉合成酶基因启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载 体是含有权利要求1所述的淀粉合成酶基因启动子的载体。
3、 一种含有淀粉合成酶基因启动子的细胞系，其特征在于，所述细胞系是 含有权利要求1所述的淀粉合成酶基因启动子的细胞系。
4、 一种含有淀粉合成酶基因启动子的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌是 含有权利要求1所述的淀粉合成酶基因启动子的宿主菌。
全文摘要
本发明公开了一种植物淀粉合成酶基因启动子及其应用。该启动子分离自玉米基因组DNA，其核苷酸序列是表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列，长度为1655bp。本发明的淀粉合成酶基因启动子能启动基因在叶片和种子中高效表达，而在根中不表达。该启动子能驱动gusA基因的表达。该启动子在植物淀粉品质改良和植物生物反应器中具有重要作用。
文档编号C12N1/21GK101555480SQ200910058058
公开日2009年10月14日 申请日期2009年1月7日 优先权日2009年1月7日
发明者刘汉梅, 张军杰, 李晓兵, 田孟良, 胡育峰, 荣廷昭, 黄玉碧 申请人:四川农业大学