一种烟草糖基转移酶诱导型启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种烟草糖基转移酶诱导型启动子Sm-NgtP，该启动子Sm-NgtP分离于烟草糖基转移酶基因中，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。采用引物对启动子Sm-NgtP进行扩增，扩增得到5个5’端缺失的启动子片断，分别为启动子片段GTPA、GTPB、GTPC、GTPD和GTPE，利用上述五个启动子片段构建植物表达载体，得到植物表达载体pGTPA、pGTPB、pGTPC、pGTPD和pGTPE，研究上述植物表达载体的活性发现，GTPC为受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的启动子，GTPD是组成型强表达启动子，GTPC启动子片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，GTPD启动子片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
【专利说明】一种烟草糖基转移酶诱导型启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种受茉莉酸和水杨酸双重诱导的烟草内源基因超强启动子的分离鉴定和应用，通过分离和鉴定该启动子，可以将其应用于植物的基因工程中，以达到植物某些基因的遗传改良的诱导表达和功能研究，属于植物基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着分子生物学的不断发展，转基因已经成为研究功能基因组学的有效手段，近年来通过转基因途径改良植物农艺性状正逐步得到可行性论证和普遍接受。启动子是基因5 ’端与RNA聚合酶及一些反式作用因子结合的DNA序列。真核生物中有三种RNA聚合酶，各与不同类型的启动子结合。RNA聚合酶I只转录rRNA，RNA聚合酶III负责转录tRNA和5S rRNA。RNA聚合酶II负责蛋白质基因和部分snRNA的转录，其启动子结构最为复杂。从功能上可将这类启动子的结构分为两部分:普遍存在的、转录必需的核心启动子(corepromoter)区和特异启动子区。启动子含有一系列与特异蛋白结合的位点，通常称这些位点为顺式作用元件(cis-element);这些特异蛋白则称为反式作用因子(trans-factor)。转录起始位点、TATA盒等属于核心启动子区；而调控基因表达活性的顺式作用元件则归为特异启动子区。
[0003]水杨酸(salicylic acid, SA)是植物体内含量较低的一种内源酹类小分子化合物。SA能诱导多种植物对病毒、真菌及细菌病害产生抗性。SA是诱发系统获得性抗性的信号分子之一，涉及并参与植物的过敏反应和SAR反应，在植物的SAR信号转导中起着关键作用。SA作为植物激素和信号分子，直接或间接调控植物体发育过程中相关基因的表达。目前已经分离出几个受SA间接调控的顺式作用元件。as-1 (Activation Sequence-1)类型水杨酸响应元件。SA诱导检测几个源自花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的调控元件，证实SA响应兀件为位于-90和-46两处的as_l兀件。用水杨酸处理烟草后，证实SA的诱导因子 ASF-1 (Activation Sequence Factor-1)与 as_l 兀件结合于两个 TGACG。LS7 兀件(TCTACGTCAC)和LS5元件(ACGTCATAGA)是从拟南芥PR-1 (病程相关基因I)基因启动子分离的SA诱导元件。SA通过激活路径中的NPR1，活化了的NPRl激活转录因子TGA2以促进TGA2转录因子与LS7、LS5元件结合，从而激活下游PR-1基因表达。W-box (TTGAC)发现于拟南芥NPRl基因启动子，是WRKY DNA结合蛋白的特异识别位点，WRKY基因的表达受SA的正调控。W-box突变会阻断WRKY DNA结合蛋白的特异识别，致使启动子无法激活下游NPRl基因的表达，从而影响SA通过NPRl诱导的防卫基因的表达。TCA-1 (tobacco nuclearproteinl)结合位点是一个由水杨酸诱导TCA-1结合的IObp序列(TCATCTTCTT)。该元件在大麦β -1-3-葡聚糖酶基因5’端非编码区重复数次，现已知有超过30个受各种胁迫诱导基因的启动子含有这一元件。
[0004]茉莉酸(JasmonicAcid, JA)及茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)是亚麻酸衍生的具有环戊酮基团的化合物。随着20世纪80年代分子生物学的兴起，人们对它们的生物合成和代谢的分子调控机理作了详尽的研究，发现茉莉酸调控许多基因的表达。归纳起来有两方面:一部分基因与植物发育有关；另一部分基因与自身防御系统有关，表现在对真菌感染、病虫害、干旱、机械损伤以及渗透胁迫等逆境的应激(吴劲松，种康.茉莉酸作用的分子生物学研究.植物学通报，2002，19 (2): 164-170)。目前通过对茉莉酸诱导基因启动子的分析，已经发现了不少茉莉酸诱导的响应元件，但这些研究多集中在与植物自身防御系统有关的基因启动子上。T/G-box (AACGTG)，是一个bHLH-亮氨酸拉链JAMYC2和JAMYCIO蛋白的结合位点，JAMYC2和JAMYCIO的表达受JAs的诱导。JAMYC超表达能增强马铃薯中JAs诱导的防卫基因的表达，但并不导致这类基因转录产物的累积。JERE(jasmonate-and elicitor-responsive element),是一类最早在长春花属植物负责次级代谢产物合成的一个基因Str(strictosidine synthase)启动子中证实的MeJA和乙烯响应的元件。JERE跟别的MeJA响应元件不同的是包含一个GCC-box_like元件。JASEl (CGTCAATGAA)和 JASE2 (CATACGTCGTCAA)，发现于拟南芥 12_0_ 植物二 烯酸-10，11-还原酶(OPRl)基因的启动子的-179和-170间。启动子连接⑶S报告基因的研究和RNA杂交分析表明，OPRl基因受衰老和JA的上调控。启动子缺失和衔接扫描突变分析表明JASEl和JASE2是衰老和SA应答的顺式作用元件。胁迫响应元件(Stress responsiveelement, SRE)是一个长13bp的顺式作用元件。Takeda等证实烟草长末端重复序列反转录转座子Ttol启动子中的SRE是响应组织培养、损伤和MeJA诱导的顺式调控元件。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种来源于烟草糖基转移酶中具有诱导型和超强活性的启动子，该启动子能够受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导，本发明中还利用该启动子构建表达载体，利用甲基茉莉酸和水杨酸浓度控制，进而通过遗传转化方法达到诱导各类目的基因表达的目的。
[0006]实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
[0007]一种烟草糖基转移酶诱导型启动子Sm-NgtP，该启动子Sm-NgtP分离于烟草糖基转移酶基因中，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]对上述启动子Sm-NgtP的基因序列进行分析，发现启动子元件集中在-800~-50bp间。采用引物对启动子Sm-NgtP进行扩增，扩增得到5个5’端缺失的启动子片断，分别为启动子片段GTPA、GTPB, GTPC、GTPD和GTPE，利用上述五个启动子片段构建植物表达载体，得到植物表达载体pGTPA、pGTPB、pGTPC、pGTH)和pGTPE，研究上述植物表达载体的活性发现，启动子片段GTPC为受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的启动子，GTH)是组成型强表达启动子，GTPC启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的GTro启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]本发明中还提供了一种利用植物细胞表达目的基因的方法，包括以下步骤:用真核表达载体PGTPC或真核表达载体PGTro转化植物细胞并培养，然后采用甲基茉莉酸和水杨酸诱导植物细胞表达目的基因；所述的植物为谷类植物，或者为棉花、烟草、油菜以及茄类植物中的任一种。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1为本发明提供的启动子Sm-NgtP的核苷酸序列图；[0011]图2为本发明构建的表达载体pCAMBIA1301-Sm-NgtP表达载体；
[0012]图3为五种启动子片段控制下的GUS基因在茉莉酸和水杨酸处理下的表达活性图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
[0014]本实施例中选取GTs基因作为候选基因，GTs全序列基因约3kb，根据GT基因编码区上游的序列分析设计引物，分离出受茉莉酸和水杨酸双重诱导的候选基因的启动子，将该启动子命名为Sm-NgtP，该启动子的核苷酸序列如图1和SEQ ID N0.1所示，在图1中，下划线部分为扩增Sm-NgtP启动子所用的引物序列，阴影显示的是基本启动子元件序列，启动子元件核心序列用波浪线表示。
[0015]设计引物扩增得到五个启动子片段，分别为分别为启动子片段GTPA、GTPB、GTPC、GTro和GTPE，其中GTPC启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，GTTO启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。用限制性内切酶Hind II1、Nco I双酶切载体，回收纯化长片断，再用T4连接酶将载体pCAMBIA1301双酶切的长片断与启动子片断连接起来，转化、筛选、鉴定后得到植物表达载体pGTPA、pGTPB、pGTPC、pGTPD、pGTPE，如图2所示，本发明构建的表达载体pCAMBIA1301-Sm-NgtP表达载体。该载体含潮霉素抗性筛选基因(HRG)，启动子Sm-NgtP中的各片段被 融合到GUS基因5’端非翻译区。
[0016]该启动子扩增得到的五个不同长度的启动子片段代替pCAMBIA35S启动子与GUS融合构建五个表达载体，转化W38型烟草，获得转化植株。下面通过对转化植株进行GT启动子的诱导表达，以及花器官组织部位染色实验，研究该基因的组织表达特性以及受诱导的时空特性。
[0017]具体操作如下:
[0018]1、实验试剂
[0019]I) X-Gluc 染色液(IOmg.πιΤ1):20mg X-Gluc 溶于 2mL2, 2- 二甲讽基丙烷中。
[0020]2)磷酸缓冲溶液(2mol.1):称 31.6g K2HPO4, 2.5g KH2PO4 溶于 IOOmL 二次水中，调至PH7.8。
[0021]3)铁氰化钾(0.05mol.1):0.1646g铁氰化钾溶于IOmL 二次水中。
[0022]4)亚铁氰化钾(0.05mol.1):0.2112g亚铁氰化钾溶于IOmL 二次水中。
[0023]5)0.5mol.L^1DTT:以0.01mol.1醋酸钠为溶剂，配好后200 μ L/支分装至Ijeppendorf 管，_7(TC 保存。
[0024]6)⑶S 反应液(-20 °C 保存):蛋白提取液(no DTT) 25mL ；DTT (0.5M) 200 μ L ；MUG22mg。
[0025]7)⑶S 空白反应液:蛋白提取液(no DTT) 25mL ；DTT (0.5M) 200 μ L0
[0026]8)反应终止液:0.2mol.T1Na2CO3:10.6g Na2CO3 溶于 500mL 二次水中。
[0027]9)⑶S染液
[0028]
【权利要求】
1.一种烟草糖基转移酶诱导型启动子Sm-NgtP,其特征在于:该启动子Sm-NgtP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种从权利要求1所述启动子Sm-NgtP中分离出的启动子片段GTPC，其特征在于:该启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一种真核表达载体pGTPC，其特征在于:所述真核表达载体中的启动子为权利要求2中所述启动子片段GTPC。
4.一种从权利要求1所述启动子Sm-NgtP中分离出的启动子片段GTTO，其特征在于:该启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
5.一种真核表达载体pGTPD，其特征在于:所述真核表达载体中的启动子为权利要求2中所述启动子片段GTro。
6.一种利用植物细胞表达目的基因的方法，其特征在于包括以下步骤:用权利要求3中所述的真核表达载体PGTPC或权利要求5中所述的真核表达载体PGTro转化植物细胞并培养，然后采用甲基茉莉 酸和水杨酸诱导植物细胞表达目的基因；所述的植物为谷类植物，或者为棉花、烟草、油菜以及茄类植物中的任一种。
【文档编号】C12N15/82GK103952414SQ201410217346
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】王春台, 刘学群, 谭艳平, 徐鑫, 程钢, 刘新琼, 周杰 申请人:中南民族大学