组成型启动子及其用途

组成型启动子及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种组成型启动子及其用途，组成型启动子的核苷酸序列包括如下（a）或（b）的序列：（a）具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明组成型启动子几乎在植物的大多数组织和许多类型细胞中普遍存在活性且显著地提高目的异源核苷酸序列在植物组织中的表达量，特别是在叶片和茎中。
【专利说明】组成型启动子及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种组成型启动子及其用途，特别是涉及一种组成型的油菜Tsfl基因启动子及其用途。
【背景技术】
[0002]植物遗传工程的最新进展为改善植物性状的工程打开了新的大门，如植物抗病性、昆虫抗性、除草剂耐受性、提高产量、改善植物可食用部分的营养质量和增强从植物中获得的终端消费产品的保质期或稳定性。因此，具有分子功能的目的基因可以被适当的整合入植物的基因组以传递不同或者改善性状或质量。新整合基因的编码序列在植物细胞中表达以显示目标新性状。重要的是适当的调控信号必须以合适的结构存在才能在植物细胞中获得新插入基因的编码序列的表达。这些调控信号典型地包括启动子区域、5’非翻译引导序列和3’转录终止子/聚腺苷酸化序列。
[0003]某些启动子能够在植物所有组织中以相对近似的水平指导RNA合成，这些启动子被称为“组成型启动子”。组成型启动子根据其指导RNA合成的效果可以被划分为强、中和弱启动子。大量普通的组成型启动子被用于在转基因植物中驱动外源基因的表达。花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子被广泛地用于双子叶和单子叶植物中，但是它在单子叶植物中的效率显著低于其在双子叶植物中的效率。
[0004]真核延伸因子(eukaryoticelongation factor,简称 EFl α 或 Tsfl)基因启动子作为组成型启动子在植物的大多数组织和许多类型细胞中都显示出明显较高的基因表达水平，如分离自拟南芥T sfl基因的启动子Ubil在拟南芥细胞中可以获得2倍于CaMV35S启动子的表达量。由于在许多情况下需要同时在植物的不同组织中表达嵌合基因(或基因)以获得所需的基因功能，而组成型启动子在上述情况下特别有利。尽管目前已获得来源于拟南芥和大豆的Tsf I基因启动子，但是分离更多新颖的Tsf I基因启动子仍然倍受关注，这些启动子能够控制嵌合基因(或基因)以不同水平进行表达，以及为基因叠加在相同转基因植物中多基因的表达。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种组成型启动子及其用途，即新的分离自油菜(Brassicacampestris L.)的Tsfl基因启动子,使异源核苷酸序列能够在植物组织中高效表达。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种组成型启动子，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列:
[0007]Ca)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0008](b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
[0009]上述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠)、0.5%SDS (十二烷基硫酸钠)溶液中，在温度65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜I次。
[0010]为实现上述目的，本发明还提供了一种包含与目的异源核苷酸序列可操作地连接的所述组成型启动子的嵌合基因。
[0011]进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
[0012]为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述嵌合基因的表达盒。
[0013]为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述表达盒的重组载体。
[0014]为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，包括:将与所述组成型启动子可操作地连接的目的异源核苷酸序列稳定的整合进植物细胞中。
[0015]进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
[0016]优选地，所述目的异源核苷酸序列在植物组织中组成型的表达。
[0017]进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
[0018]优选地，所述目的异源核苷酸序列编码除草剂耐性蛋白质。
[0019]所述目的异源核苷酸序列编码昆虫抗性蛋白质。
[0020]为实现上述目的，本发明还提供了一种所述组成型启动子用于在植物组织中组成型的表达目的异源核苷酸序列的用途。
[0021 ] 优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
[0022]进一步地，所 述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
[0023]本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，通常含有能够引导RNA聚合酶II在特定编码序列的适合转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可另外含有其它的识别序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，称作上游启动子元件，它们影响转录起始速率。公认地，由于本发明启动子区域核苷酸序列己经确定，从本发明具体启动子区域上游的5’非翻译区内进一步分离和鉴定调节元件属于现有技术。因此，本发明启动子区域进一步包括上游调节元件，它赋予与本发明启动子序列可操作地连接的任何异源核苷酸序列组成型的表达，即在植物的大体上所有组织和所有生长发育阶段都能够表达。
[0024]本发明中术语“基因”是指在适宜的调控区域(例如植物可表达性启动子区域)控制下在细胞内含有被转录成RNA分子(例如mRNA)的DNA区域(“转录的DNA区域”)的任何DNA片段。因此，基因可能含有几种可操作性连接的DNA片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸化位点的3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。嵌合基因是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与部分或全部转录的DNA区域或者与该基因的至少另一调控区域无关的任何基因。
[0025]本发明中术语“组成型启动子”是指在该类启动子的控制下，目的异源核苷酸序列的表达大体恒定在一定水平上，在植物的不同组织和/或不同生长发育阶段表达水平没有明显差异。所述组织为植物体中由来源相同和执行同一功能的一种或多种类型细胞集合而成的结构单位，例如保护组织、输导组织、营养组织、机械组织、分生组织，几种不同的组织有机配合、紧密联系，形成不同的器官(organ)，不同的器官之间互相配合，更有效地完成有机体的整个生命活动过程。所述生长发育阶段可根据植物形态、机能的差异划分为胚胎阶段、幼苗阶段、成熟阶段和衰老阶段。本发明中术语“组成型的表达”是指目的异源核苷酸序列在植物的不同组织和/或不同生长发育阶段都以大体上一致的水平进行表达。
[0026]本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用功能上等价的启动子。具有本质上与含有本发明SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列、或具有启动子活性部分的核苷酸序列的油菜Tsfl基因启动子相似的启动子活性的DNA序列，是这些启动子的功能等价物。这些功能等价启动子能在严格条件下与含有上述核苷酸序列的油菜Tsfl基因启动子区域杂交。
[0027]在杂交技术中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，与来自被选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段(如基因组文库或cDNA文库)群体中存在的其它对应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探测的基团如32P或其它任何可探测标记物标记。因此，例如，通过标记根据本发明序列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法为本领域己知并公开于SambiOOk等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
[0028]序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。
[0029]典型地，严格条件是在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10至50个核苷酸)至少大约30°C，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60°C。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低度严格条件，例如，包括在30-35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37°C杂交，在IX至2 X SSC (20XSSC=3.0M NaCl/Ο.3M柠檬酸三钠)中50-55°C洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、l%SDS的缓冲溶液中37°C杂交，在0.5X至1父55(:中55-601:洗涤。高度严格条件，例如，包括在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS的缓冲溶液中37°C杂交，在0.1XSSC中60_65°C洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1%至1%的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。
`[0030]特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于 DNA-DNA 杂交体,T111 可以从 Meinkoth 和 Wahl (1984)Anal.Biochem.138:267-284 的方程估算:1=81.5°C+16.6 (1gM) +0.41 (%GC) -0.61 (%form)-500/L ;其中 M 是单价阳离子的摩尔浓度，%GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50%互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1%的错配需Tm降低大约广匕因此，、杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有> 90%的同一性，^可以降低10°C。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5°C，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm) 1、2、3或4°C的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm) 6、7、8、9或I (TC的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)IU 12、13、14、15或20°C的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格程度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen (1993)生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier, New York);和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2 章(Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York)。见 Sambrook 等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NewYork)。
[0031]因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40%-50%、大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同一性。
[0032]其它功能等价启动子含有这样的核苷酸序列，即能用含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的至少约25、优选至少约50、特别是至少约100个连续核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶链式反应中扩增的核苷酸序列。
[0033]还可以构建人工启动子，其包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的5’调控区域的决定启动子的组成型的表达的内部序列。所述人工启动子可能包含能在植物中表达的另一启动子的“核心启动子”或“TATA盒区域”，例如W093/19188中所述的CaMV35S “TATA盒区域”。含有所述人工启动子的启动子区域的适用性可以通过它们与目的异源核苷酸序列的适当融合以及目的异源核苷酸序列在适宜组织、适当发育阶段的表达的检测进行鉴定。
[0034]本发明所述的启动子序列及其片段，当组装进DNA结构使启动子序列与目的异源核苷酸序列可操作地连接时，用于遗传性操控任何植物。所述“可操作地连接”是指本发明的启动子序列与第二个序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和调节对应于第二个序列的DNA序列的转录。一般地，可操作地连接是指被连接的核酸序列是连续的，必要时相邻地结合两个蛋白编码区，并在同一个阅读框内。以此方式，启动子核苷酸序列与目的异源核苷酸序列构成所述嵌合基因在表达盒中一起提供，以在目的植物中表达。这种表达盒提供了大量限制性位点以插入目的异源核苷酸序列，所述目的异源核苷酸序列将受到包含本发明启动子序列的调节区的转 录调节。表达盒可另外含有至少一个将共转化进生物体的附加基因。可选择地，附加基因可以在多个表达盒上被提供。
[0035]表达盒可另外含有可选择的标记基因。一般地，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因(如编码新霉素磷酸转移酶II (NPT))和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)。
[0036]表达盒包括沿5’_3’方向转录的本发明的启动子序列、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、和在植物中起作用的转录和翻译终止区。目的异源核苷酸序列可以是天然的或对植物宿主外源的或异源的。可选择地，目的异源核苷酸序列可以是天然序列或选择性合成序列。“外源”是指在导入转录起始区的天然植物中不存在所述的导入转录起始区。例如，嵌合基因包含本发明的启动子序列，本发明的启动子序列可操作地与不同于本发明的启动子序列的编码序列连接。
[0037]终止区可来源于本发明的启动子序列，也可来源于可操作连接的目的异源核苷酸序列，或可来源于另外的来源。传统的终止区可从土壤农杆菌的Ti质粒获得，如肉碱合成酶和胭脂碱合成酶(NOS)终止区。
[0038]在表达盒制备中，可以操控不同的DNA片段以提供适当方向的DNA序列，并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合DNA片段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，如转变和转换。
[0039]在适合的情况下，目的异源核苷酸序列可被优化以增加在转化植物中的表达量。即可用植物优选的密码子合成基因以改善表达。
[0040]本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的G-C含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中己知的基因表达水平进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mRNA 二级结构。
[0041]在表达盒或重组载体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)；马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒(TEV)前导序列、玉米矮小花叶病毒(MDMV)前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP);来自紫花苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA (AMV RNA4)的非翻译前导序列；烟草花叶病毒(TMV)前导序列； 和玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)前导序列。还可以使用其它己知的改进转录效率的元件，例如内含子等。
[0042]本发明的启动子序列可用来启动与目的异源核苷酸序列的信使RNA (mRNA)至少部分互补的反义结构的转录。构建反义核苷酸序列以与相应的mRNA杂交。只要反义序列长到可与相应的mRNA杂交并干扰其表达，就可进行反义序列的修饰。以此方式，可以使用与相应的反义序列具有70%,优选的80%,更优选的85%序列同一'丨生的反义结构。此外，反义核苷酸序列的一部分可被用来破坏祀基因的表达。一般，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。
[0043]本发明的启动子序列还可用于启动正义方向的核苷酸序列的转录以抑制植物中内源性基因的表达。应用正义方向的核苷酸序列在植物中抑制基因表达的方法为本领域己知。该方法通常涉及用含启动子的DNA结构转化植物，启动子可操作地连接至少一部分相当于内源性基因转录体的核苷酸序列，并驱动其在植物中表达。典型地，所述核苷酸序列与内源性基因转录体的序列具有实质上地序列同一性，优选地超过大约65%序列同一性，更优选地超过大约85%序列同一性，最优选地超过大约95%序列同一性。
[0044]本发明的启动子序列被用于目的异源核苷酸序列的组成型的表达。“异源核苷酸序列”是指非天然地与启动子序列一起存在的序列。虽然所述核苷酸序列与启动子序列是异源的，但对植物宿主可能是同源的或天然的或异源的或外源的。可操作地与本发明的启动子连接的异源核苷酸序列可编码目的蛋白质。这种异源核苷酸序列的实例包括但不限于，编码赋予以下抗性多肽的核苷酸序列:非生物应激如干旱、温度、盐度、臭氧和除草剂，或生物应激如病原体侵袭，包括昆虫、病毒、细菌、真菌和线虫类，并防止产生这些生物体伴随的疾病。[0045]本发明中除草剂耐性蛋白质可以表达对除草剂的抗性和/或耐受性。这些基因包括但不限于，乙酰乳酸合酶(ALS)基因、5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)基因、草胺磷乙酰转移酶(PAT)基因、草甘膦氧化还原酶(GOX)基因、GAT基因等。
[0046]本发明中“昆虫抗性”是指植物避免植物-昆虫相互作用所致的症状和损害。即阻止昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病，或可选择地，将由昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病减少到最小或减轻。所述昆虫可以属于鳞翅目(如玉米螟)、半翅目(如椿象)、鞘翅目(如甲虫)、直翅目(如飞蝗)、同翅目(如蚜虫)、双翅目(如蝇)等。本领域公知的，目的昆虫抗性蛋白质包括但不限于，芽孢杆菌毒性蛋白；凝集素类，其中凝集素包括雪花莲凝集素、豌豆凝集素、刀豆凝集素、麦芽凝集素、马铃薯凝集素、花生凝集素等；脂氧化酶类，其中脂氧化酶包括豌豆脂氧化酶I或大豆脂氧化酶；昆虫壳多糖酶等。
[0047]不同害虫将病毒从感染的植物传递给健康植物的方式不同。所述病毒包括但不限于，水稻东格鲁杆状病毒、烟草花叶病毒、甘薯萎黄矮小病毒和甘薯羽状斑点病毒等。因此，可以选择在植物组织中组成型的表达具有抗致病原体活性或使病毒病原体的影响最小化的异源核苷酸序列。
[0048]本发明的启动子序列和方法可用于任何目的异源核苷酸序列在植物宿主中的表达调节，以改变植物的表现型。各种目的表现型改变包括但不限于，改变植物的脂肪酸成分、改变植物的氨基酸含量、改变植物病原体防御机制等。上述改变可以通过提供异源产物的表达或增加植物内源性产物的表达而得到。可选择地,上述改变可以通过减少植物中一个或多个内源性产物的表达而得到，特别是酶或辅助因子。上述改变将导致转化植物的表现型改变。
[0049]转化方案以及将核苷酸序列导入植物的方案依定向转化的植物或植物细胞类型而异，即单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列导入植物细胞并随后插入植物基因组中的适合方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0050]已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获可保证得到所需表现型特征表达的种子。
[0051]本发明提供了一种组成型启动子及其用途，具有以下优点:
[0052]1、普遍存在活性。本发明组成型启动子几乎在植物的大多数组织和许多类型细胞中都显示出活性，特别是在双子叶植物的根、茎、叶和花中。
[0053]2、活性高。与拟南芥Tsfl启动子相比，本发明组成型启动子几乎在植物的大多数组织和许多类型细胞中都显示出明显较高的基因表达水平，特别是在双子叶植物中具有强大的、普遍存在的活性，例如根、茎、叶和花。
[0054]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。`【专利附图】

【附图说明】
[0055]图1为本发明组成型启动子及其用途的重组表达载体DBN100040示意图；[0056]图2为本发明组成型启动子及其用途的重组表达载体DBN100036示意图；
[0057]图3为本发明组成型启动子及其用途的转基因大豆植株除草剂抗性效果图。
【具体实施方式】
[0058]下面通过具体实施例进一步说明本发明组成型启动子及其用途的技术方案。
[0059]第一实施例、prBrTsfl启动子序列的合成
[0060]获得本发明组成型启动子prBrTsfl,如序列表中SEQ ID N0:1所示；所述PrBrTsfl启动子序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0061]第二实施例、含有prBrTsfl启动子序列的重组表达载体DBN100040的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0062]1、构建含有prBrTsfl启动子序列的重组克隆载体pT-prBrTsfl
[0063]将prBrTsfl 启动子序列连入克隆载体 pGEM-T (Promega, Madison, USA, CAT:A3600 )上，操作步骤按Promega公司产品pGEM_T载体说明书进行，得到重组克隆载体pT-prBrTsflo
[0064]然后将重组克隆载体pT-prBrTsfl用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501)，其热激条件为:50 μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA ( 重组克隆载体pT-prBrTsf I )，42 V水浴30秒；37 °C振荡培养I小时(200rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X_gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨IOg/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒:将菌液在12000rpm转速下离心lmin，去上清液，沉淀菌体用100μ1冰预冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmMEDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150 μ I新配制的溶液11(0.2MNa0H,1%SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸钾，2Μ醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min ;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min ;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70%的乙醇洗涤后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37°C下水浴30min，消化RNA ;于温度_20°C保存备用。
[0065]提取的质粒经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pT-prBrTsfl中插入的油菜prBrTsfl启动子序列为序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
[0066]2、构建含有prBrTsfl启动子序列的重组表达载体DBN100040
[0067]利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，重组表达载体DBN100040 (载体骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供))如图1所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右边界；eFMV:玄参花叶病毒的34S增强子；prBrTsfl:油菜真核延长因子基因I α(Tsfl)启动子(SEQ ID NO:1 ；eFMV:prBrTsfl (SEQ ID NO: 2));CTP2:拟南芥属 EPSPS 的叶绿体转运肽(SEQID N0:5);EPSPS:5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID N0:6)；E9:豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID NO:7) ;prCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQID N0:8) ；PAT:草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID N0:9) ；tCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQ ID NO: 10) ；LB:左边界)。
[0068]将重组表达载体DBN100040用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条件为:50μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA (重组表达载体DBN100040)，42 °C水浴30秒；37°C振荡培养I小时(200rpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,琼脂15g/L,用NaOH调pH至7.5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L,卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒经酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100040含有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即油菜Tsfl基因启动子序列。
[0069]3、构建含有对照序列的重组表达载体DBN100036 (正对照)
[0070]按照本发明第二实施例中I所述的构建含有prBrTsfl启动子序列的重组克隆载体pT-prBrTsf I的方法,利用对照序列构建含有对照序列的重组克隆载体pT-prAtTsf I。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pT-prAtTsfl中插入的prAtTsfl启动子序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，即对照序列正确插入。
[0071]按照本发明第二实施例中2所述的构建含有prBrTsfl启动子序列的重组表达载体DBN100040的方法，利用对照序列构建含有对照序列的重组表达载体DBN100036 (载体骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供))如图2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右边界；eFMV:玄参花叶病毒的34S增强子；prAtTsfl:拟南芥真核延长因子基因I a (Tsfl)启动子(SEQ ID NO:3 ；eFMV:prAtTsfl (SEQ ID NO:4)) ;CTP2:拟南芥属 EPSPS 的叶绿体转运肽(SEQID NO: 5) ;EPSPS:5_烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(SEQ ID N0:6);E9:豌豆RbcS基因的终止子(SEQ ID N0:7);prCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子(SEQ ID N0:8)；PAT:草丁膦乙酰转移酶基因(SEQ ID N0:`9) ；tCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S终止子(SEQID N0:10) ;LB:左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN100036中插入的对照序列为序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，即对照序列正确插入。
[0072]4、重组表达载体转化农杆菌
[0073]对己经构建正确的重组表达载体DBN100040和DBN100036用液氮法转化到农杆菌EHAlOl中，其转化条件为:100 μ L农杆菌EHAlOl、3 μ L质粒DNA (重组表达载体);置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化后的农杆菌EHAlOl接种于LB试管中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，酶切验证结果表明重组表达载体DBN100040和DBN100036结构完全正确。
[0074]第三实施例、转入prBrTsfl启动子序列的大豆植株的获得
[0075]按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的大豆品种中黄13的子叶节组织与第二实施例中4所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2和3构建的重组表达载体DBN100040 和 DBN100036 中的 T-DNA (包括 eFMV:prfcTsf I 核苷酸序列、eFMV:prAtTsf I 核苷酸序列、CTP2核苷酸序列、EPSPS基因、E9终止子序列、prCaMV35S启动子序列、PAT基因和tCaMV35S终止子序列)转入到大豆染色体组中，获得了转入prBrTsfl启动子序列的大豆植株和转入PrAtTsfI启动子序列的大豆植株；同时以野生型大豆植株作为对照。
[0076]对于农杆菌介导的大豆转化,简要地,将成熟的大豆种子在大豆萌发培养基(B5盐3.lg/L，B5维他命，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，pH5.6)中进行萌发，将种子接种于萌发培养基上，按以下条件培养:温度25±1°C;光周期(光/暗)为16/8h。萌发4-6天后取鲜绿的子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4毫米处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、侧芽和种子根。用解剖刀的刀背在子叶节处进行创伤，用农杆菌悬浮液接触创伤过的子叶节组织，其中农杆菌能够将所述启动子序列传递至创伤过的子叶节组织(步骤1:侵染步骤)在此步骤中，子叶节组织优选地浸入农杆菌悬浮液(OD66tl=0.5-0.8，侵染培养基(MS盐2.15g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2-吗啉乙磺酸(MES) 4g/L、玉米素(ZT) 2mg/L, pH5.3)中以启动接种。子叶节组织与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2:共培养步骤)。优选地，子叶节组织在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-吗啉乙磺酸(MES) 4g/L、玉米素2mg/L、琼脂8g/L，PH5.6)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(B5盐3.lg/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES) lg/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT)2mg/L、琼脂8g/L,头孢霉素150mg/L,谷氨酸100mg/L,天冬氨酸100mg/L,pH5.6)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3:恢复步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，子叶节再生的组织块在含选择剂(草丁膦)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4:选择步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有选择剂的筛选固体培养基(B5盐3.lg/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP) lmg/L、琼脂8g/L,头孢霉素150mg/L,谷氨酸100mg/L,天冬氨酸100mg/L，草丁膦6mg/L，pH5.6)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，转化的细胞再生成植物(步骤5: 再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的子叶节再生的组织块在固体培养基(B5分化培养基和B5生根培养基)上培养以再生植物。
[0077]筛选得到的抗性组织块转移到所述B5分化培养基(B5盐3.lg/L、B5维他命、2_吗啉乙磺酸(MES) lg/L、鹿糖30g/L、玉米素(ZT) lmg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素lmg/L、生长素lmg/L、草丁膦6mg/L, ρΗ5.6)上,25°C下培养分化。分化出来的小苗转移到所述B5生根培养基(B5盐3.lg/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES) lg/L、蔗糖 30g/L、琼脂 8g/L、头孢霉素 150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA) lmg/L)，在生根培养上，25°C下培养至约IOcm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于26°C下培养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0078]第四实施例、prBrTsfl启动子序列的活性测定
[0079]实验一、EPSPS基因拷贝数的鉴定
[0080]分别取转入prBrTsfl启动子序列的大豆植株和转入prAtTsfI启动子序列的大豆植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA,通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测EPSPS基因的拷贝数。同时以野生型大豆植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。[0081]检测EPSPS基因拷贝数的具体方法如下:
[0082]步骤11、分别取转入prBrTsfl启动子序列的大豆植株、转入prAtTsfl启动子序列的大豆植株和野生型大豆植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
[0083]步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA,具体方法参考其产品说明书；
[0084]步骤13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
[0085]步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80_100ng/μ I ；
[0086]步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型大豆植株的样品作为负对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是:
[0087]引物I (EF):TTGGTGCTAACCTTACCGTTGAG 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
[0088]引物2 (ER):GCTTACCACGACCTTCAAGACG 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
[0089]探针I (EP):CTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATC 如序列表中 SEQ IDNO: 13 所示；
[0090]PCR反应体系 为:
[0091]
【权利要求】
1.一种组成型启动子，其特征在于，其核苷酸序列包括如下(a)或(b)的序列: Ca)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或 (b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.一种包含与目的异源核苷酸序列可操作地连接的权利要求1所述组成型启动子的嵌合基因。
3.根据权利要求2所述嵌合基因，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
4.一种包含权利要求2或3所述嵌合基因的表达盒。
5.一种包含权利要求4所述表达盒的重组载体。
6.—种在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法,其特征在于,包括:将与权利要求1所述组成型启动子可操作地连接的目的异源核苷酸序列稳定的整合进植物细胞中。
7.根据权利要求6所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
8.根据权利要求6所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列在植物组织中组成型的表达。
9.根据权利要求6所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
10.根据权利要求9所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码除草剂耐性蛋白质。
11.根据权利要求9所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码昆虫抗性蛋白质。
12.—种权利要求1所述组成型启动子用于在植物组织中组成型的表达目的异源核苷酸序列的用途。
13.根据权利要求12所述组成型启动子用于在植物组织中组成型的表达目的异源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
14.根据权利要求 12所述组成型启动子用于在植物组织中组成型的表达目的异源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
【文档编号】C12N15/82GK103725679SQ201310728609
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】张成伟, 庞洁, 王登元, 刘海利, 康越景, 陶青 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心