岷江百合诱导型启动子及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种岷江百合诱导型启动子LrP1及其应用，LrP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本发明通过分子生物学和基因工程相关技术研究证实岷江百合启动子LrP1响应几种植物激素、生物和非生物胁迫；将本发明岷江百合启动子LrP1与β?葡萄糖苷酸酶基因连接构建成的表达框转入烟草中表达，通过荧光法定量检测转基因烟草的葡萄糖苷酸酶活性，结果表明转基因烟草在赤霉素、乙烯、脱落酸、NaCl、受伤、尖孢镰刀菌、核盘菌、灰葡萄孢处理后葡萄糖苷酸酶活性明显增强；可见岷江百合启动子LrP1受几种激素、生物和非生物胁迫因子的诱导，能用于植物抗逆境基因工程。
【专利说明】
山民江百合诱导型启动子及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及分子生物学W及基因工程相关研究领域，具体设及一种诱导型启动子 LrPl及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是位于结构基因5 '端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准 确的结合并具有转录起始的特异性。植物中常见的启动子有组成型启动子、组织特异型启 动子和诱导型启动子。组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下， 结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。组织特 异启动子（tissue-specific promoter)又称器官特异性启动子，分为根特异启动子、茎特 异启动子等。在运类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现 出发育调节的特性。利用基因工程的方法将水稻（化Tza 薦糖合酶基因启动子 和7?掛巧专入水稻，结果表明化W和化化？都可W驱动β-葡萄糖巧酸酶（β-glucuronidase， GUS)基因在根、茎、叶及颖壳中高效特异表达，但在胚和胚乳中不表达(李永春，张宪银，薛 庆中.薦糖合酶基因启动子克隆及其转基因水稻植物中特异性表达.作物学报，2002， 28(5):586-590)〇
[0003] 诱导型启动子（indue化le promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激 下，该种类型的启动子可W大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子可W在植物受到 外界物理或化学胁迫时提高基因的表达量，在去除胁迫后停止对基因的调控。诱导型启动 子的运个特性可保证在植物受到外界胁迫时起到保护植物、抵抗外界刺激的效果，并且在 适宜的环境中保证植物能量不浪费。在基因工程中，转入植物的外源基因如不加 W控制，会 在植物体内大量表达，导致蛋白大量积累且浪费能量。在载体上加入诱导型启动子可W在 外界刺激时调控目的基因的表达，很好的解决了外源基因无限制表达的问题。
[0004] 诱导型启动子包括非生物诱导型启动子和生物因素诱导型启动子。非生物因素诱 导型启动子包括干旱、盐刺激、溫度等诱导型启动子;生物因素诱导型启动子即指病虫害诱 导的启动子。利用基因组末端随机扩增技术，从斑茅(份'iaoiAt/s art/nc/inacet/s)的PR10基 因末端扩增出592bp的启动子，并连接与GUS报告基因转入烟草、水稻和甘薦中，结果表明斑 茅PR10启动子可W很快响应伤害、莱莉酸甲醋和脱落酸的处理（Chakravarthi M， Syamaladevi DP, Harunipriya P, Augustine SM, Subramonian N. A novel PRIO promoter from Erianthus arundinaceus directs high constitutive transgene expression and is enhanced upon wounding in heterologous plant systems. Mol Biol R巧，2016，43(l):17-30)。从西部白松(fint/smoniico如）中克隆得到/?户W口-J.W 的启动子和Ξ个5'缺失端，连接报告基因 GUS后转入拟南芥。结果显示GUS最早出现在2-3天 幼苗的胚轴和子叶，后在植株的顶端大量表达。但在成年植株中，启动子响应 病原体侵染和伤口胁迫，表明/? J 0 - J W启动子响应生物或非生物胁迫（L i U J J， Ekramoddoullah AK，Piggott N, Zamani A. Molecular cloning of a pathogen/wound- inducible PRIO promoter from Pinus monticola and characterization in transgenic Arabidopsis plants. Planta, 2005, 221 (2): 159-169)。芦算（心jOaragt/s o/ficinaJis)中克隆得到一个PRIO基因的的启动子，将巧?W启动子连接报告基因 G化转入拟南芥中并给与适当的逆境处理，G化基因会在受伤、病原体侵染W及出化处理部位 表达并积累，表明户化/口启动子受上述生物和非生物胁迫因子的诱导(Mur LA，Sturgess FJ,Farrell GG,Draper J. The AoPRlO promoter and certain endogenous PRIO genes respond to oxidative signals in Arabidopsis. Mol Plant Pathol, 2004, 5(5): 435-451)。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种诱导型启动子LrPl，来源于啦江百合，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0006] 本发明另一目的是将该启动子应用在基因工程中，即在逆境胁迫下作为诱导表达 启动子调控外源基因在转基因受体植物中的特异高效表达。
[0007] 本发明设及分离诱导型启动子片段并鉴定其表达活性，本发明从啦江百合中克隆 获得诱导型启动子，该启动子全长为1489bp;生物信息学分析表明诱导型启动子中包含一 系列不同的顺式作用元件，如组织特异性元件，多种激素(脱落酸、赤霉素、乙締、水杨酸、莱 莉酸甲醋）的响应元件，非生物胁迫(水分、高盐、伤害)响应元件，防卫基因响应病原菌诱导 转录的元件等。W服Y转录因子在植物抗病防卫反应中起重要的调控作用，该诱导型启动子 序列具有S个WRKY的顺式作用元件W box(C/TTGACC/T)。
[000引将本发明分离克隆的诱导型启动子片段置换PBI121载体上的化MV的35s启动子， 由诱导型启动子驱动报告基因(^^/公的表达框，通过根癌农杆菌ierit/m it/me/aciaos)介导将转入模式植物烟草(jVicoiiana iabact/m)中表达，并通过进一步实验 掲示诱导型启动子的表达特性，为后期利用该启动子调控外源基因在转基因植株中的高效 特异表达奠定基础。发明人将运个启动子命名为LrPl。
[0009] 将本发明中LrPl启动子驱动G化酌表达框转入烟草中，采用几种植物激素、生物和 非生物胁迫处理转基因烟草植株，并进行GUS活性的巧光定量分析，检测结果表明，L巧1启 动子响应几种非生物、生物胁迫及几种植物激素的处理，赤霉素、乙締、脱落酸、NaCl、伤害、 尖抱镶刀菌、灰葡萄抱(化? tirtis cinerea)、核盘菌（ScJero iinia SCJero?iort/m)能明显 诱导启动子LrP 1的活性。
[0010] 上述启动子LrPl可W在基因工程应用于外源基因的诱导表达，具体操作如下： (1) 采用扩增LrPl的特异引物，从啦江百合幼嫩组织中提取基因组DNA，通过聚合酶链 式反应(polymerase chain react ion, PCR)扩增出LrPl的全长序列，然后将其连接到pGEM- T载体上，经测序获得具有序列正确的克隆； (2) 用限制性内切酶酶切pGEM-T-LrPl载体，回收启动子片段；同时采用合适的限制性 内切酶酶切去除植物表达载体上的组成型表达启动子，通过胶回收得到载体大片段;再将 所获得LrPl片段与PCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物诱导表达载体;之后将所构建的 植物诱导表达载体与目的基因重组，并通过根癌农杆菌介导转入受体植物中，表达转基因 的植株在遭受化C1、伤害胁迫或尖抱镶刀菌、核盘菌、灰葡萄抱侵染时，启动子LrP巧E动的 目的基因会诱导并上调表达水平，此外体内体外的赤霉素、乙締、脱落酸也会诱导目的基因 高水平表达。
[0011] 本发明为植物基因工程应用中提供了一个新的诱导表达的启动子。基因工程中植 物超表达载体常用来自花挪菜花叶病毒的35S启动子，该启动子为组成型表达启动子，目的 基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异，所W转入植 物的外源基因其表达不受控制，导致蛋白大量积累且浪费能量。而诱导型启动子可W在植 物受到外界胁迫或化学因素影响时提高基因的表达量，在去除胁迫或化学处理后即下调目 的基因的表达，可保证在植物受到逆境胁迫时起到保护植物、抵抗外界刺激的效果，反之在 适宜的环境中不浪费植物的能量。基因工程应用中，在载体上加入诱导型启动子可W克服 目的基因无限制表达的问题。几种激素(赤霉素、乙締、脱落酸）、非生物胁迫(化C1、伤害）、 生物胁迫(尖抱镶刀菌、核盘菌、灰葡萄抱）明显诱导本发明中诱导型启动子LrPl的表达活 性，因此本发明在抗生物或非生物胁迫的基因工程中具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明中启动子LrPl (A图）和地1-121载体(B图）的胶回收产物检测结果； 图2是本发明中PBI121- L巧1-G化转化大肠杆菌的阳性克隆检测结果，其中阳性对照 是WpGEM-T-LrPl质粒为模板的PCR反应，空白对照是W无菌水为模板的PCR反应； 图3是本发明中部分地1121-LrPl-G化转基因烟草的PCR筛选结果，其中阳性对照是W 质粒pBI 121-LrPl-GW为模板的PCR反应;WT:非转基因烟草(野生型）总DNA为模板进行的 PCR； 图4是本发明中GUS酶活的标准曲线； 图5是本发明中PBI121-L巧1-G化转基因烟草在赤霉素、乙締、脱落酸处理后的GUS活 性，其中CK为正常生长的地I121-LrPl-G化转基因烟草的GUS活性； 图6是本发明中地I121-LrPl-GW转基因烟草在NaCl、受害处理后的GUS活性，其中CK为 正常生长的地I121-LrPl-G化转基因烟草的GUS活性； 图7是本发明中PBI121-L巧1-G化转基因烟草在尖抱镶刀菌、灰葡萄抱、核盘菌接种后 的GUS活性，其中CK为正常生长的地I121-LrPl-G化转基因烟草的GUS活性。
【具体实施方式】
[0013] 下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内 容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常 规试剂或按常规方法配置的试剂。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内 容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常 规试剂或按常规方法配置的试剂。
[0015] 实施例1:啦江百合诱导型启动子LrPl的克隆W及序列分析 W提取的啦江百合根基因组DNA为模板，用扩增启动子LrPl的特异引物(上游引物为： 5'1^6461'口'66了6刊4口'6刊47^63''，下游引物为：5乂4了6了6口76464466466了6了3'）为上下游 引物，通过PCR克隆启动子LrPl的序列。反应体系（20化)为啦江百合基因组DNA 0.5 yg、2 化 lOXAdvantage 2 PCR Buffer、1.8 化 dNTP Mix (lOmM each)、0.2 化上游引物（10 μΜ)、0.2 化下游引物（10 μΜ)、0.2 化 Advan化ge 2 PCR Polymerase Mix、14.6 化 PCR- Grade 水。PCR反应条件：94°C 5 min;94°C 30 s，65°C 30 s，72°C 2 111111，32个循环；721： 5 miruPCR结束后，取8化进行琼脂糖凝胶电泳，用W检测扩增产物的特异性W及大小。
[0016]所得至化CR产物只有一条DNA带，因此直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为 pGEM-T vector system (Promega)，反应体系和操作过程为：取1.5化PCR产物，依次加入 1 化 pGEM-T vector (50 ng/yL)和2.5 化 2XLigation solutioni，混匀后置于 16°C过 夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5a感受态中。用含有氨节青霉素 (ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrPl 的特异引物检测多克隆位点插入LrPl的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的启 动子LrPl长1489 bp。采用PLANTCARE对启动子的顺式作用元件进行预测，预测启动子序列 中与逆境胁迫相关的顺式作用元件(表1)。启动子中包含一系列不同的顺式作用元件，如组 织特异性元件，多种激素(脱落酸、赤霉素、乙締、水杨酸、莱莉酸甲醋）的响应元件，非生物 胁迫(水分、高盐、伤害）响应元件，防卫基因响应病原菌诱导转录的元件等;WRKY转录因子 在植物抗病防卫反应中起重要的调控作用，启动子序列具有Ξ个WRKY的顺式作用元件W box(C/TTGACC/T)〇
[0017]表1:启动子序列中的顺式作用元件预测结果
[0018] 实施例2:LrPl^化表达载体构建 地1121多克隆位点有化'ndm和公amHI酶切位点，因此在扩增启动子的特异引物分别添 加化nd虹和姑細I的识别位点。采用SanPr邱柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工）提取 插入LrPl的大肠杆菌质粒pGEM-T-L巧及植物表达载体PBI121质粒，取1化用于琼脂糖 凝胶电泳W检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶姑mHI和化nd虹分别对 质粒pGEM-T-LrPl和PBI121进行双酶切（100化体系），反应体系和操作过程为:分别取20 μ L pGEM-T-L巧1和ΡΒΙ121质粒、依次加入10化10ΧΗ buffer、5化姑細1、5化化nd虹、 60 μL dd也0,混匀后短时离屯、，置于37°C过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 然后使用SanPr邱柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工)对启动子片段和PBI121载体大片段分 别进行胶回收，取1化回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小W及浓度，结果 如图1所示。
[0019] 利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的启动子DNA片段和pBim载体片段连接 起来，反应体系(20化)和操作过程为:取10化LrPl DNA片段依次加入2化PBI121载体 DNA、2 化 10 XT4 DNA Ligase Buffer、！化 T4 DNA Ligase、化L d地2〇,混匀后短时离 屯、，然后16Γ水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌D册α中，用含有 50 mg/L卡那霉素化anamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，W菌液为 模板用扩增启动子LrPl的特异引物进行PCR，挑选出LrPl与地1121成功连接的克隆，在得到 的阳性菌株中加入甘油并置于-80°C保存备用。
[0020] 采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌DH5a中的PBI121- LrPl -饼质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体地1121-L巧1 -饼/5转入所制 备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为:取0.2 yg pBI121-LrPl-G化损粒加入 含有200化感受态细胞的离屯、管中，轻轻混匀后冰浴5 min,随后转入液氮中冷冻1 min,然 后迅速置于37°C水浴5 min,再冰浴2 min,之后加入500化LB液体培养基于28°C振荡培养 4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28Γ倒置培养。挑选单菌 落摇菌，再用扩增LrPl的特异性引物进行PCR反应，检测PBI121-L巧l-G￡/5是否转入农杆菌 中。对于图帥所示的阳性克隆，加入甘油后置于-80°C保存备用。
[0021] 实施例3:农杆菌介导的植物遗传转化W及转基因植物筛选 本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30 S，无菌水洗涂后用0.1% 的化Cl2浸泡8 min,然后再用无菌水洗涂若干次，播种于1/2 MS培养基上，28°C暗培养5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25°C，1化/d光照），W后每月用MS培养基继代一次。
[0022] 将-80°C冰箱中保存的含有PBI121-L巧质粒的农杆菌LBA4404菌液取出，取 10化菌液接种于1 mL含有20 mg/L利福平和50 mg/L Km的LB液体培养基中，28 °C 200 巧m振荡培养至浑浊。吸取500化菌液均匀涂布于含有20 mg/L利福平和50 mg/L Km的LB固 体培养基上，28°C倒置培养至长出菌苔。用接种环刮取3-5环菌苔接种于40 mL含25 mg/mL 乙酷下香酬的Μ化培养基中，28°C 220 rpm振荡培养直至0〇6日日约为0.6。将无菌烟草组培苗 叶片剪成约1 cm2大小的叶盘，浸泡于含有悬浮农杆菌的Μ化培养基中，25Γ震荡培养15 min。用无菌滤纸将叶盘表面的菌液吸干后转入烟草共培养培养基(MS+0.02 mg/L 6-ΒΑ+ 2.1 mg/L NAA+30 g/L薦糖+6 g/L琼脂）中，22 °C暗培养2天。将共培养后的叶盘转接到烟 草筛选培养基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L薦糖+6 g/L琼脂巧0 mg/L Km+ 200 mg/L头抱霉素)上，培养于光照培养箱(25 °C，16 h/d光照）。培养约3周，将分化出来 的烟草幼苗切下并继代于含有50 mg/L Km和300 mg/L头抱霉素的生根培养基(MS+30 g/L 薦糖+6 g/L琼脂巧0 mg/L Km+300 mg/L头抱霉素)上进行生根培养。
[0023] 采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1化基因组DNA进行琼脂糖 凝胶电泳检测其完整性和浓度。W转基因植株的基因组DNA为模板用扩增启动子LrPl的特 异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8化产物用于琼脂糖凝胶电泳W检测阳性转基因植株。 部分转基因烟草植株的扩增结果如图3所示，啦江百合诱导型启动子LrPl转基因烟草共筛 选到22株阳性转基因植株。
[0024] 实施例4:转基因烟草的GUS巧光定量检测 对转基因烟草根部GUS活性的巧光定量分析参考Jefferson等（Jefferson R. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Mol Biol 民ep. 1987,5(4): 387-405)的方法，其反应机理是:GUS可与底物4-MUG反应，催化产生4- MU，4-MU在激发波长为365皿、发射波长为455 nm条件下产生巧光，产生的巧光值可W通过 巧光分光光度计进行定量测定。
[0025] 将预先处理好的烟草根置于装有液氮的研鉢中研磨成粉末，加入400 μL GUS提取 缓冲液，将匀浆转移至1.5 mL离屯、管中，于4°C、12000 g离屯、10 min。离屯、结束后，收集上清 于新的离屯、管中。预先取1 mL的4-MUG溶液（1 mmol/L)于2.0血离屯、管中37°C预热10 min。 取50化上清液加入至预热的GUS反应缓冲液中，迅速摇匀，并立即取200化反应混合液置 于1.8 mL的终止缓冲液中（操作时间少于30 S)，作为酶促反应0点样(巧光测定时W此为空 白对照），剩余液体继续37 °C反应并开始计时。在反应15 min、30 min、45 min时分别取200 化反应混合液，加入至1.8 mL终止缓冲液中，用于巧光测定。使用巧光分光光度计在激发波 长为365 nm，发射波长为455 nm的条件下测定各样品的巧光值。制作4-MU标准曲线:将1 mM 4-MU母液用反应终止液分别稀释成50 nM、100nM、200 nM，400 nM，500 nM和1000 nM的不同 梯度液，在激发波长为365 nm，发射波长为455 nm的条件下测定各梯度液的巧光值，W反应 终止液为空白对照，用测得的巧光值和4-MU的浓度绘制标准曲线（如图4所示）。取10化上 清液，采用改良的考马斯亮蓝法测定样品的蛋白含量。W-分钟催化4-MUG生成1 nmol 4- MU的酶量为一个活力单位，GUS酶活W每mg总蛋白的酶活力计算，即表示为4-MU nmol/min/ mg(蛋白）。通过标准曲线，计算出转基因烟草的GUS活性。
[0026]为了检测啦江百合启动子对植物激素、生物与非生物胁迫的响应，分别用几种植 物激素、生物胁迫和非生物胁迫因子处理转基因烟草的根部，并通过上述方法测定处理前 后的GUS活性，W正常生长未处理的转基因烟草根部GUS活性作为对照(CK)。如图5,在赤霉 素、脱落酸和乙締处理后，啦江百合启动子LrPl转基因烟草根中的GUS活性明显上调，对启 动子活性的诱导程度来看，赤霉素〉脱落酸〉乙締。NaCl、受害处理后转基因烟草的GUS活性 如图6所示，伤害和化C1运两种非生物胁迫因子均显著上调启动子LrPl的活性，与化C1胁迫 相比，启动子LrPl对伤害胁迫的响应度更强，受伤处理后，LrP巧区动的GUS活性远高于化C1 胁迫及对照。用Ξ种病原菌尖抱镶刀菌、核盘菌和灰葡萄抱处理转基因烟草的根，也明显诱 导了启动子的活性，从诱导程度上来看，灰葡萄抱〉尖抱镶刀菌〉核盘菌（图7)。上述实验结 果表明，啦江百合启动子LrPl响应几种植物激素、非生物胁迫及生物胁迫的处理，赤霉素、 脱落酸、乙締、化C1、受伤、灰葡萄抱、尖抱镶刀菌、核盘菌能明显上调LrP巧E动的GUS活性。 显然，啦江百合启动子LrPl是一种植物激素、生物胁迫和非生物胁迫因子诱导型启动子，可 应用于植物抗逆基因工程。
【主权项】
1. 一种诱导型启动子LrPl，来源于岷江百合，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 权利要求1所述的诱导型启动子LrPl在植物抗逆境胁迫基因工程中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:在逆境胁迫下调控外源基因在转基因受体 植物中的特异高效表达。
【文档编号】C12N15/113GK106011141SQ201610517000
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】刘迪秋, 关瑞攀, 曲媛, 杨野, 葛锋, 何华
【申请人】昆明理工大学