一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子启动子PCb-RARE及其应用，该启动子来源于竹节树(Carallia brachiata)反转座子Cb-RARE-1的LTR区，其序列如SEQ ID NO:1所示。本发明用含有该启动子和GUS基因的重组表达载体转化拟南芥，验证了该启动子受NaCl和水杨酸的诱导，利用该特性，可以把该启动子应用在耐盐碱植物的筛选和分子育种中。本发明利用诱导型启动子诱导外源基因在植物体内表达，该启动子的功能在高盐或水杨酸刺激下可被激活或抑制，因此可在特定时间或生长时期利用高浓度氯化钠或水杨酸激活或抑制基因表达进而控制基因产物的合成，从而可以有目的地调节植物生长。
【专利说明】一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子 (也称反转录转座子、反转座子）启动子其应用，该启动子来源于竹节树（Carallia brachiata)反转座子 Cb-RARE-1 的 LTR 区。
【背景技术】
[0002] 反转录转座子（retrotransposon, RTN)是指以RNA为媒介进行增殖与转座的元 件。在反转录酶RT与RNaseH作用下，反转录转座子反转录成染色体外DNA，再在整合酶作 用下插入到染色体新的位置上。反转座子的插入能引起基因内或者基因附近的稳定突变。 因此反转座子跳跃的特性可以用于突变的引发并用于种质培育等。
[0003] 具有长片段末端重复（long terminal repeat, LTR)的反转录转座子两端各有一 正向排列的重复序列，包含有与转录相关的启动子（promoter)和终止子（terminator)。 启动子可启动反转座子内部基因的转录，其产物参与转座行为的控制。大部分转座行为是 有害的，机体发展了许多机制抑制其转座活性。通常情况下，反转录转座子是静止的。但 是，在受到各种生物和非生物胁迫时，部分反转座子能被激活，发生转座。例如，小麦中反转 录转座子TaR T-1受MeJA、SA或白粉病原菌（Powdery Mildew Fungus)胁迫时，表达上调 (Tang et al.，2005);燕麦基因0ARE-1在SA处理、UV照射、外伤以及病原菌胁迫下，表达 水平上调（Kimura et al.，2001) 〇
[0004] 植物基因工程和生物技术的发展为耐性作物的研宄以及植物生物反应器的研宄 做出了巨大的贡献。但是，如何控制外源基因定时定量地高效表达，是限制基因工程技术在 作物遗传改良方面有效应用的重要因素。解决办法之一是寻找有效的目的基因，而另一种 办法则是寻找可有效控制目的基因表达的启动子。
[0005] 启动子控制与其融合的目的基因在植物宿主中的时空表达，因此启动子类型的选 择决定基因的表达时间和部位。根据启动子驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型 启动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转 录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子。组织特异型启动子是指启 动目的基因只在某些特定的器官或组织中表达；诱导型启动子是指受到某些物理或化学信 号的刺激，可以大幅度地改变目的基因的表达水平一类启动子。
[0006] Kasuga等利用诱导型rd29A启动子代替组成型启动子CaMV35S转化拟南芥，提高 了转基因拟南芥的抗旱性，同时减少了组成型过表达造成的植株生长停滞或矮化现象的发 生（Narusaka等，2003, PlantJ 34, 137-148)。诱导型启动子只有在接受诱导信号后才促使 目的基因的表达模式发生变化，因此在植物分子育种中使用这类启动子可以有效控制植物 的基因表达和表型，不仅不会造成各种资源的浪费，还能减少对植物生长发育及其他代谢 途径的影响。因此，研宄和利用诱导型启动子，对于研宄植物响应各种胁迫的生理机理以及 通过基因工程培育农作物新型品种有重要的意义，在基础研宄和植物生物技术方面也有着 广阔的应用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的在于提供一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子启动子 Pcmme，该启动子来源于竹节树（Carallia brachiata)反转座子Cb-RARE-1的LTR区。
[0008] 本发明的另一目的在于提供含有上述启动子序列的表达盒。
[0009] 本发明的再一目的在于提供含有上述启动子序列的重组载体。
[0010] 本发明的第四个目的在于提供上述的启动子在耐盐碱植物的筛选和分子育种中 的应用。
[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0012] 一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子启动子Pcb_KAKE，其序列如SEQ ID NO:l所 示，序列长度974bp，该启动子来源于竹节树（Carallia brachiata)反转座子Cb-RARE-1的 LTR区。实验结果表明：该启动子序列可以启动下游基因的表达，其活性和特异性受到水杨 酸和氯化钠的调节。
[0013] 一种表达盒，包含上述的启动子序列和目的基因序列。
[0014] -种重组表达载体，包含上述的启动子序列，或者包含上述的表达盒。
[0015] 基于上述启动子受高盐和水杨酸诱导的特性，可以将该启动子应用于耐盐碱植物 的筛选和分子育种。
[0016] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0017] 本发明利用诱导型启动子诱导外源基因在植物体内表达，该启动子的功能在高盐 或水杨酸刺激下可被激活或抑制，因此可在特定时间或生长时期利用高浓度氯化钠或水杨 酸激活或抑制基因表达进而控制基因产物的合成，从而可以有目的地调节植物生长。迄今 为止，尚未发现关于该启动子核苷酸序列的报道，亦未发现利用该启动子有条件地启动基 因表达特性的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是Pa_KAKE::⑶S转基因拟南芥对不同浓度NaCl的响应实验结果图。
[0019] 图2是Pa_KAKE::⑶S转基因拟南芥在100mMNaCl处理不同时间的响应实验结果图。
[0020] 图3是Pcb_KAKE: :GUS转基因拟南芥的胚轴和根尖部位对不同浓度水杨酸的响应实 验结果图。
[0021] 图4是Peb_KAKE::⑶S转基因拟南芥对10mM水杨酸处理不同时间的响应实验结果 图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0023] 实施例1
[0024] 竹节树DNA提取及反转座子Cb-RARE-1假定LTR序列Peb_KAKE的克隆：
[0025]采用改进的CTAB法（Doyle and Doyle, 1990)提取竹节树叶片总DNA。利用TaKaRa 公司试剂盒LA PCR? Kit，按照其说明书的反应体系扩增Cb-RARE-1的LTR序列Pa_KAKE。
[0026] 所用引物对为：
[0027] Cb-promoter-F:5,-GAATTCAGAGTGTCTATTGAGCATATT-3,(SEQIDNO:2)
[0028]Cb-promoter-R2:5'-GGTACCCACATCTATAAGCATAAT-3'（SEQIDN0:3)〇
[0029] 引物的 5'端添加了限制性内切酶EcoR I(5'-GAATTC-3'）或KpnI(5'-GGTACC-3'） 的识别序列。
[0030] PCR 反应程序为：94°C预变性 2min ;94°C变性 45sec，58°C复性 45sec，72°C延伸 3min，35个循环；最后72°C延伸lOmin。将扩增产物回收（Axygen Biosciences),并连接 于PMDTM18-T载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆测序。所得序列即为 SEQ ID N0:1。
[0031] 实施例2
[0032] 含Pa_KAKE::⑶S表达盒的重组表达载体pBI-pCb-RARE的构建：
[0033] 扩大培养实施例1中获得的阳性克隆（该克隆含有Pa_KAKE序列的重组质粒）。利 用质粒提取试剂盒（AXYGENAXYPr印?PlasmidMinpr印Kit)提取质粒DNA，以该质粒为 模板，下面序列为引物，通过实施例1中的PCR反应程序扩增Pcb__序列。
[0034] Pcb-EAEE-F：5,-AAGCTTAGAGTGTCTATTGAGCATATT-3 , (SEQ IDN0:4)〇
[0035] Pcb-EAEE-R：5,-GTCGACCACATCTATAAGCATAAT-3?(SEQIDN0:5)〇
[0036] 所得的PCR反应产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（AXYGEN AXYPrep? P1 asmi d Minprep Kit，上海申能博彩）回收。将该回收片段与T_载体（Takara，T_easy vector) 连接，并转化大肠杆菌JM109菌株，获得含有Peb_KAKE序列的重组JM109株系（称为 JMIOQ-P^^gg) 〇
[0037] 扩大培养JM109-Peb_KAKE，利用质粒提取试剂盒（AXYGEN AXYPr印? Plasmid Minpr印Kit)提取质粒DNA。用限制性内切酶Hindlll和Sail进行双酶切，并用琼脂糖凝 胶回收试剂盒（AXYGEN AXYPr印? Plasmid Minpr印Kit，上海申能博彩）回收长度为986bp 的P〇ri?E片段（SEQIDNO: 1加上两端共12bp的酶切位点）。
[0038]用同样的限制性内切酶HindllI和SalI切割植物双元表达载体质粒pBI 101，并 胶回收大片段。将双元载体质粒PBI101的大片段与片段用T4DNA连接酶连接，得到 PBI-Po^^: :GUS重组载体质粒，将该质粒直接转化大肠杆菌JM109。利用Peb_KAKE的特异引 物，通过PCR鉴定阳性转化子并保存菌种。阳性转化子中含有P eb_KAKE融合GUS报告基因的 重组载体（pBI-Pcb_ KAKE::⑶S)。
[0039] 实施例3
[0040] 含有Pa__::⑶S表达盒的转基因拟南芥的构建：
[0041] 扩大培养含重组载体（pBI-Pa_KAKE::⑶S)的大肠杆菌转化子，收集菌体后提取 PBI-Po^g: :GUS重组载体质粒。取纯化的:GUS重组载体质粒转化农杆菌 EHA105,挑选能在含有60mg/L利福平与50mg/L卡那霉素的LB培养板上生长的菌落并进行 PCR鉴定，挑选可扩增到P a__片段的阳性转化子并保存农杆菌菌种。
[0042] 取上述农杆菌菌种活化培养一天后，以1%的接种比例接种进行扩大培养12小时 以上，至〇D6(i(i= 0. 6?0. 8。4000rpm室温离心10min，弃上清液，收集菌体。用新鲜配制的 5%蔗糖转化液悬浮菌体，使0D6QQ= 0.6?0.8。加入0.03% Silwet (购自美国GE公司） 混匀。
[0043] 选择健康的、有较多花苞的拟南芥哥伦比亚生态型的野生型植株，通过花序浸泡 法转化拟南芥植株。收集转化植株果实，即为T1代种子。将T1代种子播撒在含30mg/L潮 霉素的MS培养板上进行筛选，选取能正常生长的植株，即为T1代植株。收集T1代植株果 实，即为T2代种子。在30mg/L潮霉素的MS培养板上播下T2代种子，选择健康生长幼苗转 入营养土继续培养，并进行单株收种，即为T3代种子。将每个单株获得的T3代种子播撒在 30mg/L潮霉素的MS培养板上进行单拷贝插入的纯合植株筛选。统计全体样本在30mg/L潮 霉素的MS培养板上培养时的抗性：非抗性幼苗的分离比，分离比接近或等于3:1的株系即 为单拷贝插入株系。在单拷贝插入株系中选择能在30mg/L潮霉素的MS培养板上100%健 康成长的单株为纯合植株。该纯合植株（其基因型记为：Pt^^iGUS/Col)被用于后续的 工作。
[0044] 实施例4
[0045] 转基因拟南芥:⑶S/Col在高盐下的⑶S基因表达活性分析：
[0046] 取表面消毒后的转基因拟南芥Peb__: :GUS/Col、野生型（Col)的种子播于MS培 养基平板上，4°C低温处理3天后，转移到长日照（16小时光照，8小时黑暗）下培养10天。 取拟南芥幼苗，转移到润湿了 l〇〇mM或150mM NaCl溶液的滤纸上进行高盐胁迫处理。每种 盐浓度下处理0.5、1、2小时。胁迫处理结束后，马上取出幼苗，放入有500 yL⑶S组织化 学检测液的离心管中，使幼苗被完全浸泡。将上述离心管置于37°C 6小时或以上。取出幼 苗，用75%乙醇溶液和无水乙醇漂洗、脱色。在脱色过程中，不定时更换乙醇，直至脱色完 全。将幼苗放置在体视显微镜或普通光学显微镜下观察。
[0047] 结果表明高盐胁迫下⑶S基因的表达水平和组织特异性发生了变化：如图1所示， 与处理前相比，100mM NaCl处理后转基因植株的胚轴、幼嫩真叶、根的⑶S染色变浅，表明 ⑶S基因表达下调，而在根尖部位染色加深，即⑶S基因表达上调，表明在以上组织或器官 中Pdrf? E启动子启动转录的活性可被高盐调控。
[0048] 此外，lOOmM NaCl处理不同时间时，胚轴的⑶S组织化学染色均随着时间延长而 逐渐减弱，2小时处理时颜色最浅（图2)，表明启动子的活性随着高盐处理时间的延 长逐渐被抑制。
[0049] 实施例5
[0050] 转基因拟南芥:⑶S/Col在水杨酸处理下⑶S基因表达的检测：
[0051] 取表面消毒后的转基因拟南芥:⑶S/Col、野生型（Col)的种子分别将其浸 泡在200 y 1的蒸馏水、0. ImM SA、lmM SA溶液中，4°C低温处理3天后，再将其播在MS培养 基中，在22±2°C和长日照环境中培养7?10天，转移到营养土中继续培养。3个星期后， 选取整齐一致的植株用10mM水杨酸喷洒处理〇. 5h、lh、2h，同时用蒸馏水喷洒作阴性对照。 剪取植株不同部位进行⑶S组织化学检测。
[0052] 结果如图3所示，不同浓度的水杨酸处理使胚轴上部染色变浅，而靠近根尖部位 染色有一定程度的加深。
[0053] 当使用10mMSA处理时，随着处理时间延长叶片染色先变浅后恢复，处理1小时后 染色最浅，2小时处理则恢复非处理时染色（图4)，表明启动子的活性受到水杨酸的 调节。
[0054] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一个受高盐和水杨酸诱导的逆转录转座子启动子P a^AKE，其序列如SEQ ID NO: 1所 不〇
2. -种表达盒，其特征在于：包含权利要求1所述的启动子。
3. 根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：还包含目的基因序列。
4. 一种重组表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述的启动子序列，或者包含权利 要求2或3所述的表达盒。
5. 权利要求1所述的启动子在耐盐碱植物的筛选和分子育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104450708SQ201410834918
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】唐恬, 梁山, 林星钦, 刘小如, 区佩如, 潘婷 申请人:中山大学, 华南师范大学