作为细胞增殖拮抗剂和细胞分化诱导剂的逆转录酶非核苷抑制剂的制作方法

专利名称：作为细胞增殖拮抗剂和细胞分化诱导剂的逆转录酶非核苷抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为细胞增殖拮抗剂和细胞分化诱导剂的逆转录酶(RT)非核苷抑制剂在治疗和/或预防增殖和分化疾病如癌症中的治疗用途。
背景技术：
内源的、非端粒逆转录酶(RT)是一种由在所有真核生物基因组中的两类高丰度重复元件逆转录转座子和内源的逆转录病毒所编码的酶(di Marzo Veronese F，Copeland TD，DeVico AL，Rahman R，Oroszlah S，Gallo RC，Sarngadharan MG Science(1986)231，1289-91Characterization of highly immunogenic p66/p51 as the reversetranscriptase of HTLV-III/LAV；Grob PM，Wu JC，Cohen KA，Ingraham RH，Shih CK，Hargrave KD，McTague TL，Merluzzi VJAIDS Res Hum Retroviruses(1992)8，145-52 Nonnucleoside inhibitorsof HIV-1 reverse transcriptasenevirapine as a prototype drug)。RT-编码基因的表达通常在终末分化的非病态组织中被抑制，其仅在基础水平上可被检测到，然而在哺乳动物生殖系、胚胎组织和肿瘤细胞中其是高活性的。RT在如细胞生长和分化的基本过程中所起的作用尚须被阐明。已知商品名分别为VIRAMUNE、SUSTIVA和RESCRIPTOR的奈伟拉平(Nevirapine)、依法韦仑(Efavirenz)和Rescriptor可作为RT的非核苷抑制剂并被作为抗逆转录病毒药剂广泛地应用于治疗AIDS。特别是具有式C15H14N4O的奈伟拉平，在纯状态中，其是一种结晶固体，分子量为266.302，熔点为247-249℃，在水中溶解度为0.1mg/ml及在乙醇中溶解度为5.5mg/ml，并能根据在专利EP429.987中所述的方法被制备。奈伟拉平(5，11-二氢-11-环丙基-4-甲基-6H-二吡啶并-[3，2-b2’，3’-e][1，4]二氮杂-6-酮)是5，11-二氢-6H-二吡啶并[3，2-b2’，3’-e][1，4]二氮杂类化合物，已知作为RT的非核苷抑制剂并被用于预防和治疗HIV感染，如在EP429.987中所述。
依法韦仑(分子量315.68)(-)-6-氯-4-环丙基乙炔基-4-三氟甲基-1，4，-二氢-2H-3，1-苯并嗪-酮[于此的参考文献一并作为参考1.YOUNG，S.D.；BRITCHER，S.F.；TRAN，L.O.；PAYNE，L.S.；LUMMA，W.C.；LYLE，T.A.；HUFF，J.R.；ANDERSON，P.S.；OLSEN，D.B.；CARROLL，S.S.；PETTIBONE，D.J.；O’BRIEN，J.A.；BALL，R.G.；BALANI，S.K.；LIN，J.H.；LONG，W.J.；BYRNES，V.W.；EMINI，E.A.；等，L-743，726(DMP-266)A NOVEL，HIGHLYPOTENT NONNUCLEOSIDE INHIBITOR OF THE HUMANIMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1 REVERSETRANSCRIPTASE.ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER 39(12)2602-2605(1995)]。
Rescriptor(分子量552.68)[1-5(-甲砜氨基)-1H-吲哚-2-基-羰基)-4-[3-(异丙基氨基)-2-嘧啶基]哌嗪](于此的参考文献一并作为参考1.ROMERO，D.L.；MORGE，R.A.；GENIN，M.J.；BILES，C.；BUSSO，M.；RESNICK，L.；ALTHAUS，I.W.；REUSSER，F.；THOMAS，R.C.；TARPLEY，W.G.BIS(HETEROARYL)PIPERZINE(BHAP)RT INHIBITORSSTRUCTURE-ACTIVITYRELATIONSHIPS OF NOVEL SUBSTITUTED INDOLEANALOGUES AND THE IDENTIFICATION OFMONOMETHANESULFONATE(U-90152S).J MED CHEM 36(10)1505-1508(1993)。2.ROMERO，D.L.；OLMSTED，R.A.；POEL，T.J.；MORGE，R.A.；BILES，C.；KEISER，B.J.；KOPTA，L.A.；FRIIS，J.M.；HOSLEY，J.D.；STEFANSKI，K.J.；WISHKA，D.G.；EVANS，D.B.；MORRIS，J.；STEHLE，R.G.；SHARMA，S.K.；YAGI，Y.；VOORM AN，R.L.；ADAMS，W.J.；TARPLEY，W.G.TARGETINGDELAVIRDINE/ATEVIRDINE RESISTANT HIV-1IDENTIFICATION OF(ALKYLAMINO)PIPERIDINE-CONTAINING BIS(HETEROARYL)PIPERAZINESAS BROAD SPECTRUM HIV-1 REVERSE TRANSCRIPTASEINHIBITORS.J MED CHEM 39(19)3769-3789(1996).
我们组的初步研究已经证实了奈伟拉平和依法韦仑加到体外授精实验(IVF)中制备的胚胎的培养物中时，在早期小鼠胚胎中都能引起早期和有效地发育停止。该结果第一次证实了这两种药物能潜在地抑制细胞增殖并提示我们去测试它们对肿瘤细胞的影响。
发明简述本发明是基于非核苷RT抑制剂促使细胞分化并伴随细胞增殖的减少的发现。本文中所用的术语“抑制剂”指能通过直接与RT分子结合而干扰其酶活性的化合物。更特别地，奈伟拉平和依法韦仑都能结合RT亚基p66上的疏水口袋，该疏水口袋的位置接近催化位点—该酶的功能因此被损害。根据此定义，和在本发明的保护范围内，如上提及的从商业可获得的化合物，即VIRAMUNE(奈伟拉平)、SUSTIVA(依法韦仑)和RESCRIPTOR(地拉韦啶)，和其它能干扰RT活性的化合物，能被用于治疗和/或预防通过细胞分化的丧失和无法控制的细胞生长而表现出的病症。因此，本发明的目的是根据如上机制能显示RT抑制活性的非核苷化合物的用途，该化合物能被用于预防性和/或治疗性的治疗以抵抗去分化病症中的分化丧失和在肿瘤治疗中作为抗增殖药物。特别地，拮抗细胞增殖和去分化过程的RT抑制剂能被用于治疗人肿瘤，特别是上皮肿瘤、间充质肿瘤和神经系统肿瘤，包括白血病和实体瘤如畸胎癌、纤维和骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤和肝细胞瘤。
在非核苷RT抑制剂中，本发明明确地包括商业可获得的目前用于治疗AIDS的化合物的用途，这些化合物包括它们相关的药物剂型具有作为非核苷RT抑制剂的活性。在那些化合物中，特别优选地是VIRAMUNE(奈伟拉平)(Boehringer)、SUSTIVA(依法韦仑)(Bristol-Myers Squibb)和RESCRIPTOR(地拉韦啶)(AgouronPharmaceuticals)。
上述所提到的化合物和作为特例的奈伟拉平，其常规使用和商业可获得的药物剂型，被建议作为用于制备以用于细胞分化和/或增殖要被控制的病例中的药物组合物的化合物的例子，因此具有分化和抗肿瘤的活性。这些分子的治疗作用被认为与它们的RT抑制能力相关。
本发明的进一步目的是预防性或治疗性的治疗哺乳动物中的细胞增殖，特别在人中，具有分化和抗肿瘤的作用。
进一步目的可在本发明的详述中被证实。
附图的简要描述

图1在鼠和人细胞系中的逆转录酶。图1A.在MS2 RNA和来自如下人(1-9行)和鼠(10-22行)细胞裂解物温育后的RT活性功能分析；第1行，NB4白血病；第2行，R4白血病；第3行，Kasumi-1白血病；第4行，HL60白血病；第5行，Saos-2骨肉瘤；第6行，MDA-231乳腺癌；第7行，MCF7乳腺癌；第8行，UA43 Mg神经胶质瘤；第9行，HT-29结肠癌；第10行，NIH/3T3胚胎成纤维细胞；第11行，C2C7成肌细胞；第12行，F9畸胎癌；第13行，L929纤维肉瘤；第14行，用F9裂解物但没有MS2 RNA的对照反应；第15行，只有缓冲液；第16行，没有哺乳动物细胞裂解物；第17行，没有MS2 RNA也没有细胞裂解物；第18行，含有商品化的RT的阳性对照反应；第19行，没有MS2特异的寡聚物；第20-22行F9裂解物与1(第20行)、10(第21行)和100(第22行)μM奈伟拉平预温育的完全反应。M行，DNA分子量标记；第23行，含有商品化的Rt的阳性对照反应。图1B.在WCE和细胞核中RT蛋白(顶行)和α-微管蛋白(底行)的Western印迹分析。WCE来自F9(第1行)、NIH/3T3(第2行)、MCF7(第3行)、MDA-231(第4行)、NB4(第5行)、HL60(第6行)和ML2未成熟细胞(blast)(第7行)。核提取物来自F9(第1行)、MCF7(第2行)、MDA-231(第3行)、NIH 3T3(第4行)、HL60(第5行)和NB4(第6行)。
图2在鼠和人细胞系中奈伟拉平抑制增殖。细胞用(虚线)和不用(DMSO，实线)奈伟拉平培养。增殖速率表示为所计数的细胞在指定时间与最初接种细胞数目之比，起始为1。点和条分别代表来自所有细胞型至少3次独立实验的平均值和标准偏差。
图3A.在对照和奈伟拉平处理的细胞中细胞周期的分析。通过FACS在从奈伟拉平处理开始的72小时后测定细胞周期的分布。在U343神经胶质瘤细胞系中，细胞周期在二倍体细胞部分(代表大约所有细胞的2/3)中和在处于非整倍体生长的其余部分(大约1/3)中被分别分析。图3B.在用(+，第2，4和6行)或不用(-，第1，3和5行)奈伟拉平培养72小时的指定的细胞型的提取物中细胞周期蛋白D1的Western印迹分析(顶行)。滤膜用抗肌动蛋白抗体重检测(reprobed)来控制上样量相等(底行)。
图4C2C7生肌细胞(myogenic cell)在奈伟拉平处理后的分化。在分化培养基中培养前用DMSO(A，C)或奈伟拉平(B，D，E)预处理的C2C7成肌细胞用抗-MHC(FITC，绿色)和Hoechst 33258染色使细胞核显qc(呈蓝色)；合并的图像被显示。在20x的放大倍率下，在对照培养基中的肌管细胞(图4A)比经过奈伟拉平处理后(图4B)更细和更稀少。图4C.在A中肌管细胞的60x放大。图4D.在B中肌管细胞的60x放大。图4E.在B中MHC-阳性的成肌细胞的60x放大。
图5RA和奈伟拉平处理的F9细胞的形态分化。暴露于DMSO(对照，图5a、图5b、图5c、图5d)、奈伟拉平(图5e、图5f、图5g、图5h)或RA(图5i、图5j、图5k、图5l)的F9培养物在在培养72小时后首先体内检验以记录形态重建(图5a、图5e、图5i行，60x物镜)。在96小时后，样品被固定并进行IV型胶原(α1)链的IF(图5 c、图5g、图5k)和DAPI染色细胞核(图5b、图5f、图5j)；图像合并为图5d、图5h、和图5i(100x物镜)。
图6奈伟拉平处理减轻了AML未成熟细胞(blast)中分化阻断。在用400μM奈伟拉平(Nev)处理5天后的早幼粒细胞系NB4；HL60细胞和来自两个AML患者(AML#1和AML#2)的未成熟细胞中通过Wright-Giemsa染色显示的形态分化。NB4细胞也用1μM RA处理，诱导粒细胞分化。图示的未处理的细胞作为对照。
图7奈伟拉平诱导F9细胞基因表达的变化。来自用DMSO(对照)、奈伟拉平或RA培养的F9细胞的总RNA用寡核苷酸对给定的基因进行RT-PCR扩增，用内源性寡核苷酸印记并杂交。典型的结果显示在图7A中。图7B基因表达的数量变异。用内源性寡核苷酸杂交的RT-PCR产物通过光密度分析法被定量。相对于在同样的实验中获自β-肌动蛋白的信号，奈伟拉平与对照培养物的信号比率被标准化。来自每个基因的至少三次实验，暗柱状图表示平均值，亮柱状图表示标准偏差。
图8依法韦仑抑制鼠细胞系的增殖(图8A 3T3细胞系；图8B F9细胞)。用(虚线)和不用(DMSO，实线)依法韦仑培养细胞。增殖速率表示为所计数的细胞在指定时间与最初接种细胞数目之比，起始为1。点代表来自至少3次独立实验的平均值。
图9依法韦仑抑制人细胞系的增殖(图9A HeLa 1st周期；图9BHela 2nd周期，图9C SAOS 1st周期，图9D SAOS 2nd周期)。细胞用(虚线)和不用(DMSO，实线)依法韦仑培养。增殖速率表示为所计数的细胞在指定时间与最初接种细胞数目之比，起始为1。点代表来自至少3次独立实验的平均值。
图10对照(实线)和奈伟拉平处理的大鼠(虚线)的Morris肝细胞瘤生长。肿瘤生长速率表示为体积(cm3)与时间(天)(从接种的时间起算)关系。
图11来自奈伟拉平处理(NEV列)的和未处理的(CTR列)大鼠组织样本。在顶行(10x物镜)，NEV列中的转化区(图11B)与未处理(CTR)的组织(图11A)相比有非常明显地减少。在底行(40x物镜)中，在NEV中(图11D)经受凋亡的细胞是清楚可见的，但是在CTR样品中没有(图11C)。
图12对照(实线)和两种依法韦仑处理的大鼠(虚线，EFV1和EFV2)中Morris肝细胞瘤生长。肿瘤生长速率表示为体积(cm3)与时间(天)(从接种的时间起算)关系。
发明详述在不同类型的鼠和人肿瘤系提取物中用基于PCR的RT分析方法，我们最初检测了抑制剂针对的酶内源性RT活性。
接着，在鼠祖细胞(即，C2C7生肌前体细胞；NIH/3T3胚胎成纤维细胞)和鼠和人生瘤细胞系(F9畸胎癌；L929纤维肉瘤；HT-29结肠癌；表达雌激素受体(ER+)的MCF-7乳腺癌；雌激素受体表达阴性(ER-)的MDA-231乳腺癌；U343 Mg神经胶质瘤和Saos-2骨肉瘤)中加入350-400μM奈伟拉平或10-20μM依法韦仑持续几天。结果表明RT抑制剂诱导细胞增殖速率的降低并促进细胞分化。在急性髓细胞样白血病(AML)细胞系(NB4，HL60，Kasumi-1)和来自两位AML患者的初级未成熟细胞中也观察到了分化，通过形态学、功能和免疫表型实验所示。
提取自奈伟拉平处理前和处理后的F9细胞的mRNA的RT-PCR分析描述了在决定性地调节细胞周期的一组基因中基因表达的基本变化细胞周期蛋白D1和D3被下调；相反地，它们的拮抗剂p16被上调；p27激酶抑制剂及Rb-1和Rb-2成视网膜细胞瘤相关的基因也较低程度地被下调。
这些结果支持了下述观点a)内源性RT活性与肿瘤发生是相关的和b)RT抑制剂促进肿瘤表型转化为正常表型。在多能F9和生肌C2C7细胞系中，通过研究在祖细胞中不表达的特定分化标记(即分别是F9细胞中的IV型胶原α链和在C2C7细胞中的肌球蛋白)的出现详细地研究了奈伟拉平诱导的分化。此外，形态学(细胞核/细胞质比率和减少的嗜碱粒细胞)、功能(NBT分析)和免疫表型(谱系特异的表面抗原的表达)水平的研究表明了奈伟拉平处理能解除存在于AML患者的人AML细胞系初级转化的未成熟细胞的分化阻断。
基于这些发现，我们认为根据上述机制显示RT抑制活性的非核苷化合物可被用于在预防性的和/或治疗性的治疗中作为药物来抵抗在去分化的病症如横纹肌肉瘤中分化的丧失，和在肿瘤治疗中作为抗增殖药物，特别是在上皮肿瘤、间充质肿瘤和神经系统肿瘤，包括白血病和实体瘤如畸胎癌、纤维和骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤和肝细胞瘤治疗中。
优选的化合物是可从商业渠道购买到的和用于治疗AIDS的具有非核苷RT抑制剂活性的化合物。特别优选的是VIRAMUNE(奈伟拉平)(Boehringer)、SUSTIVA(依法韦仑)(Bristol-Myers Squibb)和RESCRIPTOR(地拉韦啶)(Agouron Pharmaceuticals)。
上述所提到的化合物和作为特例的奈伟拉平，它们常规使用和从商业渠道可购买到药物剂型，被认为可作为用于制备以用于细胞分化要被控制同时可消除细胞增殖的病例中的药物组合物的化合物的例子，因此具有分化和抗肿瘤的作用。这些分子的治疗作用被认为与它们的RT抑制能力相关。
根据本发明的细胞增殖的预防性的或治疗性的治疗可以在哺乳动物中，特别在人中进行。
有此需要的受试者能用具有治疗有效量的显示作为非核苷RT抑制剂活性并向受试者提供治疗效果的至少一种化合物来治疗。
根据本发明的非核苷化合物能被用在药物组合物中来制备具有分化和抗肿瘤作用的药物。用于本发明中所述用途的组合物可通过混合有效量的至少一种活性成分和能有利于将活性化合物加工成可药用制剂(如丸剂、溶液、悬浮液)的一种或多种生理学上可接受的载体和/或稀释剂和/或溶剂和/或赋形剂和辅料而获得。这些药物组合物可用已知的方法来制造，如，通过常规混合、溶解、粒化、包糖衣、研磨、乳化、胶囊化、截留(entrapping)或冻干的方法。适合的制剂是基于所选择的给药途径。该药物组合物可以口服或通过静脉或肌肉或皮下注射给药。
根据在专利EP 429.987中所描述的内容确定给药用途剂量和方式。
根据病症的类型和严重性给药剂量和形式不同。
下面描述一些使用上述分子的实验实施例。然而，重点强调的是由于根据本发明内容优选的化合物的不同的化学结构，可理解本发明不限于这些分子，且其它能显示作为RT抑制剂活性的化合物也能同样被应用。
如下的实施例被认为是例证性的而不限制本发明的保护范围。
实施例1-肿瘤细胞中的内源性RT活性本文中所述的抑制剂的靶标-RT酶活性已经在鼠源和人源的所有的细胞系中被检测到，其在使用基于PCR的分析方法的本发明中已经被测试。结果总结在图1中，显示了来自所有细胞系的裂解物具有RT活性，能在体外逆转录内源性RNA(MS2期RNA)，产生具有期望大小的扩增产物，即112bp(1-13行)；如果MS2 RNA(14行)或细胞裂解物(16行)在温育混合物中不存在，cDNA将不被合成。此外，当细胞裂解物与奈伟拉平预温育时，RT活性以剂量依赖的方式被抑制在与100μM(22行)温育后112bp的产物消失，但是在与1μM(20行)或10μM(22行)温育后产物不消失。在肿瘤细胞中存在的RT酶通过Western印迹分析被进一步地证实了。图1B显示了蛋白分子在全细胞(WCE)和细胞核裂解物中都被特异的抗-RT多克隆抗体识别。
这些结果证实了RT存在于肿瘤细胞中，具有蛋白和酶的活性，并被奈伟拉平抑制。
实施例2-奈伟拉平和鼠及人细胞培养物温育减慢了细胞的细胞加倍速度鼠C2C7生肌前体、NIH/3T3胚胎成纤维细胞、F9畸胎癌和L929纤维肉瘤细胞和来自如下细胞系的人细胞Saos-2骨肉瘤、HT-29结肠癌、MDA-231乳腺癌(ER-)、MCF7乳腺癌(ER+)、U343神经胶质瘤在含有10-20％胎血清和从储存液(250mM)在100％的DMSO中稀释得到的350μM的奈伟拉平的DMEM中培养。细胞被放置于35mm的培养皿上，密度为2-5×104，并随后用奈伟拉平5-6小时。样品在特定的时间被取出并在奈伟拉平处理的或对照的(DMSO处理的)培养物中进行细胞计数。结果总结在图2中，显示了在所有的细胞系中奈伟拉平的处理(虚线)减少了增殖速率。在响应药物的抑制作用中观察一些细胞类型特异的差异F9畸胎癌细胞显示了最高的响应，处理120小时后在细胞增殖速率减少5倍。在HT-29结肠癌细胞中表现了相当的效力。Saos-2骨肉瘤细胞是最慢响应类型，与对照的培养物比较仅在处理了5天后生长速率才开始下降。
实施例3-奈伟拉平和细胞培养物温育退出细胞周期奈伟拉平处理的细胞培养物的FACS分析表现了在一些细胞型的细胞周期型的变化如图3A中所显示的，在奈伟拉平处理72小时后，具有G0/G1期DNA的细胞在NIH/3T3、HT-29、MCF-7和U343 Mg培养物中积聚，然而同时在这些对照的样品中则显示了增殖培养物的典型的细胞周期型。伴随着在用奈伟拉平处理的NIH/3T3、HT-29、MCF7(图3B)和U343 Mg神经胶质瘤(数据未显示)培养物与未处理的对照物比较细胞周期蛋白D1大量减少。
实施例4-奈伟拉平和细胞培养物温育诱导分化用具有很好鉴定形式的能经历体外分化的模型细胞系统来表示奈伟拉平影响细胞分化过程。能增殖为单核成肌细胞的鼠C2C7生肌卫星细胞去除生长因子能被诱导分化并形成表达肌特异性基因的多核肌管细胞。在我们的实验中，C2C7细胞用或不用奈伟拉平培养90小时(其间对照的培养物达到饱和密度)，接着转移到分化培养基中培养48小时。通过光学显微镜计数(在随机选择的视野中细胞数n＝300)，奈伟拉平处理样品中多核肌管细胞(即具有多于三个细胞核的细胞)和单/双核细胞之间的比率大约是1∶1，而在未处理的样品中比率为1∶2。细胞单层通过使用抗肌球蛋白重链(MHC)的多克隆抗体(一种新的肌分化标记)的免疫荧光法(IF)被进一步地分析。在分化培养基中保持48小时的对照培养物中，含有MHC的多核肌管细胞比在用奈伟拉平预处理的培养物中的细胞(图4D)更细和明显地更小(图4C)。在对照培养物中分离的成肌细胞大部分是MHC-阴性(图4A)，而经奈伟拉平处理的平板中的分离的成肌细胞中肌球蛋白的合成已经被激活(图4E)。
在畸胎癌F9细胞中奈伟拉平也引发细胞分化。未处理的F9细胞具有圆的外形并随着生长趋向于形成聚集(图5a)。当用一种众所周知的分化促进剂-视黄酸(RA)处理时，形态分化的特征标记在72小时后变明显(图5e)，包括减少的形成聚集趋势、增加的粘附性和具有分化形态外观的细胞表面的重组。类似的变化在奈伟拉平处理的培养物中被观察到(图5i)。形态的重组伴随IV型胶原(α1)链的合成增加(图5k)，其中IV型胶原(α1)链是响应RA诱导的分化标记(图5g)，其在对照培养物中低水平合成(图5c)。结合图4和5的结果表明了在两种不同细胞型中奈伟拉平引发或促进了分化的开始。
实施例5-奈伟拉平处理诱导人急性髓样白血病(AML)未成熟细胞的分化我们分析了在急性早幼粒细胞NB4(表达(15；17)肿瘤蛋白PML/RAR，导致这些未成熟细胞分化阻断)和在急性成髓细胞性白血病HL60细胞系中奈伟拉平的作用，与其已知的对RA诱导的粒细胞分化的敏感性进行了比较。奈伟拉平处理5天后，在两个细胞系中具有骨髓单核细胞样形态的细胞明显出现(图6)，而如报道的，通过1μM RA诱导了具有晚幼粒细胞样形态的细胞(图6和未显示的数据)。我们然后分析了在存在RA或奈伟拉平的条件下培养4天后三个表面抗原CD11b、CD14和CD15的表达(表1)。CD11b的诱导与粒细胞的分化有关，CD14被认为是单核细胞特异性抗原，CD15是骨髓单核细胞抗原。CD14和CD11b的同时诱导与单核细胞的分化有关。与粒细胞分化的诱导结果一致，在两个细胞系中RA处理都增加了CD11b和CD15的水平，但不增加CD14的水平。在奈伟拉平处理的NB4和HL60细胞中，检测到CD15表达的强诱导和较低程度的CD11b和CD14标记。因此，奈伟拉平处理诱导骨髓单核细胞分化标记的表达，与形态学研究的结果一致。奈伟拉平处理也使NBT染料还原实验中阳性细胞数增加了大约2.0-3.5倍(表2)。
在对RA诱导的粒细胞分化敏感性较差的髓细胞性白血病细胞(如表达t(8；21)易位产物AML1/ETO的Kasumi-1细胞系)和在来自两位AML患者的初级未成熟细胞中进一步分析了奈伟拉平的分化作用。虽然实际上并不抑制增殖，但奈伟拉平的处理诱导了处于细胞周期的G1期的细胞适度而持续聚集(数据未给出)。另外，Kasumi-1细胞和AML初级未成熟细胞都响应奈伟拉平处理而引发分化，由诱导下列事件所表明(i)与骨髓单核细胞分化相关的形态改变(图6)，包括具有起始细胞核分裂的染色质凝聚、细胞核/细胞质比率减少、细胞质嗜碱性的减少和核旁高尔基区(在AML#1患者中明显地具有的特殊颗粒)的出现；(ii)功能改变，通过NBT阳性的增加被证实(表2)；(iii)髓细胞样免疫表型标记CD11b、CD14和CD15表达的改变(表1和未给出的数据)。在初级AML未成熟细胞中髓样分化特征的诱导程度与在NB4和HL60细胞中所检测的程度相当。
表1.在用RA(1μM)或NEV(450μM)处理4天后的NB4和HL60细胞系中细胞表面标记的细胞荧光测定分析特异标记的平均荧光强度(AU)标记对照 RA NEV对照 RA NEV 对照NEVNB4细胞 HL60细胞AML#1CD11b7.253.7 10.1 12.1 15.3 16.6 5.6 5.9CD14 18.3 19.1 23.1 34.3 23.7 45.3 8.1 8.8CD15 106.5 421.7 196.3 122.5 609.71298.15.5 15.6
表2.处理4天后，RA或Nev对NB4、HL60、Kasumi-1细胞系及来自两位AML患者的初期白血病未成熟细胞生长和分化的影响治疗活细胞NBT+活细胞NBT+N°×105(％) N°×105(％)NB4细胞 HL60细胞对照 2.6±0.2 9.1±0.5 9.2±1.813.3±0.8RA(1μM) 1.4±0.1 80.6±4.5 6.5±0.931.2±1.4Nev(350μM)2.6±0.4 37.2±1.4 4.7±1.137.8±2.5治疗活细胞NBT+活细胞NBT+活胞NBT+N°×105(％) N°×105(％) N°×105(％)Kasumi-1细胞 AML#1AML#2对照 3.3±0.6 14.1±0.5 0.9±0.29.2±0.4 1.8±0.337.5±4.9Nev(350μM)4.5±0.9 31.2±1.1 0.6±0.119.5±0.71.2±0.168.1±1.4实施例6-奈伟拉平处理的F9细胞中细胞周期调节基因表达的变化为测定是否奈伟拉平影响生长和分化的能力反映特定基因表达变化，提取自对照、奈伟拉平和RA处理的F9细胞的RNA，并进行半定量RT-PCR分析。我们研究了一组编码D型细胞周期蛋白；生长抑制剂；细胞凋亡调节物和看家蛋白(housekeeping proteins)的基因。图7A中显示了代表性的图和图7B显示定量的结果。细胞周期蛋白D1基因显示最显著的变化，在奈伟拉平处理的F9培养物与未处理的比较中，其下调了7倍，然而，编码D型细胞周期蛋白的主要拮抗剂的p16INK4a上调了大约8倍。显示P27Kip1、Rb-2/p130和Bcl-2也被上调，P27Kip1主要调节响应细胞外形和粘附的增殖；Rb-2/p130，其与增殖周期的停止相关；Bcl-2，其在某些细胞型中能促进生长抑制。细胞周期蛋白D3的表达由于奈伟拉平而下调。因为看家基因(β-肌动蛋白、GAPDH)以及p53的表达不受影响，所以这些变化是特异的。
实施例7-依法韦仑和鼠细胞培养物温育剂量作用NIH/3T3胚胎成纤维细胞和F9畸胎癌细胞在含有10-20％胎血清和由100％的DMSO中的储存液(10mM)稀释所得到的两种浓度的依法韦仑(即10和20μM)的DMEM中培养。细胞被放置于35mm的培养皿中，密度为2-5×104，并随后用依法韦仑处理5-6小时。样品在特定的时间被取出并计数在依法韦仑处理的和相应未处理的细胞培养物中的细胞。图8的结果表明与非处理的细胞(实线)相比，在两个细胞系中依法韦仑的处理(虚线)以剂量依赖型方式减少了增殖速率。
实施例8-依法韦仑和人细胞培养物温育时间依赖性在人Hela腺癌和Saos-2骨肉瘤细胞中进一步地测定依法韦仑的作用。这两种细胞系都在上述(实施例6)的条件下培养。为测定药物处理时间的延长是否能提高生长抑制的有效性，两种细胞系在两个连续的周期中都用依法韦仑处理在1st周期中，细胞连续地用20μM依法韦仑处理5天；然后稀释细胞、再接种和接下来用新鲜的药物开始2nd周期处理。在图9中的结果显示了HeLa(图A)和Saos-2(图B)细胞系对依法韦仑都敏感并且细胞生长速率明显减少了。抑制作用是时间依赖性的，因为在HeLa和Saos-2培养物中，第一周期的处理(5天)分别产生1.6和1.5倍的减少，而在第二周期中获得5和4倍的减少(进行到处理开始之日起的第20天)。
实施例9-奈伟拉平体内抗肿瘤活性治疗Morris 3924A大鼠肝细胞瘤a)大鼠品系和肿瘤特征大鼠品系ACI/T近交系(大约180克)。
肿瘤Morris 3924A肝细胞瘤是一种快速生长的肿瘤，其在ACI/T近交系动物中生长。接种三周后肿瘤的大小是大约10cm3。
肿瘤细胞的制备从接种大约两周后的动物中制备肝细胞瘤肿瘤细胞。用外科手术从动物体中分离肿瘤，分离开结缔组织和坏死组织并切成小碎片。接着肿瘤碎片悬浮在灭菌生理溶液中并使用具有大口径针头的20ml注射器接种在一只大腿内。通常注射0.5ml的细胞悬浮液。植入肿瘤的成功率是大约99％。
步骤3只大鼠用奈伟拉平预处理，每只大鼠每日注射0.2ml的奈伟拉平溶液(储存液＝180mg/2ml DMSO)经过11天(每只大鼠每天18mg)。在第11天，将肝细胞瘤细胞皮下接种到预处理的和三只未处理的对照大鼠中。
结果在接种17天后，对照大鼠显示典型的2-4cm3的肿瘤，而奈伟拉平预处理的动物仅有一只在注射位置有几毫米大小的小结。在图10中的时间曲线显示了在对照大鼠(实线)和在奈伟拉平预处理的大鼠(虚线)中不同的肿瘤生长速率。对照大鼠的生长曲线表示三只动物的平均值，而奈伟拉平曲线表示在那些被处理的动物中生长有小肿瘤的单只动物的生长速率。用外科手术从未处理的和奈伟拉平处理的大鼠中分离肿瘤组织并进行组织学分析。图11显示了与未处理的样本比较(CTR列)在来自奈伟拉平处理的大鼠样本中(NEV列)转化区明显地减少，细胞存在清楚的凋亡特征。
总之，用奈伟拉平预处理能有效地拮抗因遗传预置(geneticallypredisposed)以产生特定肿瘤的大鼠(2/3)中实验诱导的肝细胞瘤的发生和生长。在肿瘤接种后两只大鼠持久保持健康，而在第三只中检测到一个小肿瘤。在同样的条件下，未处理的大鼠产生快速生长的肿瘤(3/3)并通常在27天内死亡。
实施例10-奈伟拉平体内抗肿瘤活性治疗接种腹水瘤的BALB/C小鼠步骤通过注射0.2ml取自8天前接种动物的腹水，10只BALB/C小鼠腹膜内(两次)接种腹水瘤细胞。在用肿瘤细胞接种的10只小鼠中的5只中，在同一天通过腹膜内注射1mg/每只小鼠/每天(在DMSO中的储存液10mg/ml)开始奈伟拉平的治疗。小鼠用奈伟拉平连续处理7天。
结果在7-8天后，在动物被处死后测定所有对照动物显示出含有5-7ml腹水的肿胀的腹部。相反地，在5只奈伟拉平处理的动物中的三只(3/5)仍保持健康，没有肿瘤生长的迹象；当这些动物中的2只在肿瘤接种15天后被处死及分析尸体证实了没有肿瘤发生。存活的被处理的动物持久保持健康。值得注意的是接种腹水瘤的小鼠仅存活12-14天。
总之，该实验证实了在肿瘤接种的同时注射奈伟拉平，在5只小鼠中的3只中永久阻断了腹水瘤的发生。在同样的条件下，在未处理的大鼠(5/5)中肿瘤发育，所有的大鼠在接种后12-14天内死亡。
实施例11-依法韦仑体内抗肿瘤活性治疗Morris 3924A大鼠肝细胞瘤步骤和结果在4只大鼠(3924A品系)中接种Morris肝细胞瘤细胞。同一天，在它们中的两只中通过注射1mg/每只大鼠/每天开始用依法韦仑治疗。图12显示了在对照(实线)和依法韦仑处理的动物(虚线)中肿瘤生长的速率。在对照动物中肿瘤快速生长，它们在接种27天后都死亡；相反地，在两只处理的动物中仅有一只形成了非常小的肿瘤，而另外一只完全保持健康。
总之，该实验证实了在肿瘤接种的同时开始用依法韦仑治疗能有效地拮抗Morris肝细胞瘤的发生和生长。两只处理的大鼠中，一只在接种几星期后仍保持健康，而另一只形成非常小的肿瘤。在同样的条件下，在未处理的大鼠(2/2)中形成肿瘤并在第27天死亡。
权利要求
1.用于抵抗在肿瘤和非肿瘤病症中细胞分化丧失的药物，特征在于其含有作为有效成分的有效量的至少一种逆转录酶(RT)抑制剂化合物，所述的化合物能结合RT亚基p66上的疏水口袋。
2.根据权利要求1的药物，其中肿瘤病症选自白血病和实体瘤如上皮肿瘤、间充质肿瘤、神经系统肿瘤、畸胎癌、纤维和骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤和肝细胞瘤。
3.至少一种逆转录酶抑制剂化合物在制备抵抗在肿瘤和非肿瘤病症中细胞分化丧失的药物组合物中的用途。
4.根据权利要求3的用途，其中化合物恢复分化细胞为表型正常的细胞。
5.根据权利要求3的用途，其中所述的肿瘤病症是选自白血病和实体瘤如上皮肿瘤、间充质肿瘤、神经系统肿瘤、畸胎癌、纤维和骨肉瘤、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤和肝细胞瘤。
6.根据权利要求3-5的用途，其中的化合物是选自5，11-二氢-6H-二吡啶并[3，2-b2’，3’-e][1，4]二氮杂 类化合物。
7.根据权利要求3-5的用途，其中所述化合物选自奈伟拉平、依法韦仑、地拉韦啶、其相应的盐和/或药学上可接受的衍生物。
8.根据权利要求3-7的用途，其中的药物组合物还包含用于制备用于口服、静脉内、肌内或皮下注射给药的组合物的载体和/或稀释剂和/或溶剂和/或赋形剂。
9.根据权利要求3-8的用途，其中的药物组合物为丸剂、悬浮液或溶液的形式。
10. 5，11-二氢-6H-二吡啶并[3，2-b2’，3’-e][1，4]二氮杂类用于制备具有抗增殖活性的药物组合物的用途。
11.至少一种选自奈伟拉平、依法韦仑、地拉韦啶、其相应的盐和/或药学上可接受的衍生物的化合物用于制备具有抗增殖活性的药物组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及使用逆转录酶(RT)抑制剂化合物来制备药物组合物以抵抗在肿瘤和非肿瘤病症中细胞分化的丧失，所述的化合物能结合RT亚基p66上的疏水口袋。特别优选用于该用途的化合物如下奈伟拉平(nevirapine)、依法韦仑(efavirenz)、地拉韦啶(delavirdine)、其相应的盐和/或药学上可接受的衍生物。
文档编号A61K31/5513GK1607953SQ02826053
公开日2005年4月20日 申请日期2002年12月23日 优先权日2001年12月24日
发明者C·斯帕达弗拉, P·拉维亚, E·马泰, G·帕隆比尼, R·N·洛仑兹尼, C·尼尔维 申请人:高等健康研究院