Il-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及再生医学及基因工程领域，具体设及IL-31在调控间充质干细胞增殖 和分化中的应用。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)最早由Pittenger等分离于骨髓， 后来在厮带和脂肪等组织中也能分离得到。MSCs具有如下优点:MSCs可塑性很高，在体内外 诱导条件下能分化成软骨、骨、肌肉、肌腫、初带和脂肪等组织;MSCs具有归巢能力，可W在 生物体内向受损和炎症部位集中；MSCs能诱导或增加新血管的形成;MSCs缺乏显著的免疫 原性，防止自身免疫；另外MSCs分离方便。近几年来，再生医学快速发展，由于胚胎干细胞用 于细胞治疗受伦理道德的影响，并且有致癌的风险，所WMSCs取代胚胎干细胞用于细胞治 疗已经成为一种趋势。但MSCs在再生医学和组织工程应用中也存在缺陷，例如：随着细胞传 代次数的增加，MSCs的形态发生变化，增殖能力和多向分化潜能等都逐渐下降。如何提高 MSCs的增殖能力和多向分化潜能已经成为急需解决的难题，解决运些问题将对MSCs应用于 再生医学和组织工程产生重大影响。最近的研究发现，多能性基因0ct4，Sox2和化nog等对 MSCs的增殖和多向分化潜能起促进作用，抑制运些基因的表达能对MSCs增殖和多向分化潜 能产生抑制作用。通过基因工程的手段提高MSCs增殖和多向分化潜能已经成为研究的热 点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供IL-31在调控间充质干细胞 增殖和分化中的应用。
[0004] 本发明的目的通过下述技术方案实现：化-31在调控间充质干细胞增殖和分化中 的应用，基于本发明发明人首次发现转染IL-31能促进MSCs的增殖和成脂或成骨分化潜能。
[0005] 所述的IL-31的氨基酸序列如下所示：
[0006] MA甜SGPSTSVLFLFiXLGGWLASHTLPV化LRPSDDVQKIVE化QSLSKMLL邸VE邸KG化VSQNYTLrcLSPDA QPP順I服PAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDA阳TNISVPTDT肥CKRFILTISQQF沈CMDLALKS LTSGAQQATT。
[0007]所述的IL-31的编码核巧酸序列如下所示：
[000引
ACACCCATGAATGTAAACGCTTCATCCTGACTATTTCTCAACAGTTTTCAGAGTGCATGGACCTCGCACTAAAATCA TTGACCTCTGGAGCCCAACAGGCCACCACTTAAo
[0009] 所述的调控为正调控，即促进作用。
[0010] 所述的IL-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用，是将IL-31蛋白或能表达 比-31的核酸序列制备为促进间充质干细胞增殖和分化的制剂。
[0011] 所述的核酸序列优选为DNA序列。
[0012] 所述的IL-31在调控间充质干细胞增殖和分化中的应用，是WIL-31基因为祀位 点，将能促进IL-31基因转录和表达的物质制备为促进间充质干细胞增殖和分化的制剂。
[0013] 所述的物质优选为0ct4转录因子。
[0014] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明是基于本发明发明人首次 发现转染IL-31能促进MSCs的增殖和成脂或成骨分化潜能得到的成果。本发明将含有IL- 31、sh比-31、0(3*4、3}1〇(3*4和空质粒的慢病毒分别转染至15〔3中进行表达，发现转染0(3*4或 比-31质粒都能促进MSCs的增殖和成脂或成骨分化潜能，而转染sh0ct4或shIL-31都能抑制 MSCs的增殖和成骨或成脂分化潜能。0ct4促进MSCs的增殖和成骨或成脂分化潜能已经被报 道，在本研究中被作为阳性对照。本发明掲示了细胞因子IL-31对MSCs的自我更新和多向分 化潜能起着关键调节作用提供了理论依据，为将MSCs用于再生医学和组织工程奠定了必要 的基础。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明实施例1中将含有0ct4、比-31、sh0ct4、shIL-31的慢病毒重组载体和 作为对照的慢病毒空质粒分别感染UC-MSCs后，采用MTT方法检测细胞因子IL-31对UC-MSCs 增殖影响的结果图；其中，冲<0.01相对于不同天数的空质粒对照。
[0016] 图2是本发明实施例2中将含有sh0ct4、sh化-31的慢病毒重组载体和作为对照的 慢病毒空质粒分别感染UC-MSCs后，检测细胞因子IL-31对UC-MSCs的成脂或成骨分化作用 的结果图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述，但不用来限制本发明的范 围。若未特别指出，实施例均参照常规实验条件，或者参照试剂盒制造厂商的说明书进行。 实施例中所用到的工程菌、细胞株均为商业化的菌株或细胞株。大肠杆菌感受态细胞的制 备按照《分子克隆》进行制备。
[001引实施例1采用MTT方法检巧U比-31对UC-MSCs增殖的影响。
[0019] (1)比-31和shIL-31慢病毒表达载体的构建。
[0020] 1)比-31基因引物的设计。
[0021] 用Primer 5.0软件设计扩增IL-31基因开放阅读框的引物，引物两端酶切位点分 别为BamH I和化nd虹，引物由上海生工生物有限公司合成，引物的序列如下：
[0022] 比-31 正向引物：5' -TAGGATCCTCCCACACGTTGCCCGT-3' ；
[0023] 比-31 反向引物：5' -GCAAGCTTAGTGGTGGCCTGTTG-3'。
[0024] 2)扩增 IL-31 基因。
[002引 W人Th2细胞(购自上海哈灵生物科技有限公司）的cDNA为模板扩增比-31基因。
[0026] PCR扩增的反应体系如下：
[0030] 3)比-31基因的回收。
[0031] 将上述PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用Gel Extraction Kit(Omega)对PCR 产物回收，实验步骤按试剂盒说明书，略有改动，步骤如下：
[0032] A、用手术刀片切下含有目的片段的琼脂糖胶，尽量切除DNA片段周围多余的琼脂 糖胶W减少凝胶体积。
[0033] B、将凝胶块置于1.5ml微量离屯、管中。加入与凝胶等体积的Binding buffeH X p2)。将混合物置于50-55°C，7min，直到凝胶完全溶解。
[0034] C、将化Bind DNA离屯、柱置于2ml收集管中，将70化1 DNA/琼脂糖溶液加至化Bind DM离屯、柱，室溫下，10，000 X g离屯、Imin。
[00巧]D、弃去液体，将化Bind DNA离屯、柱重新放回相同的收集管，向化Bind DNA离屯、柱 中加入300μ1 Binding buffe;r(Xp2)，室溫下，10,000Xg离屯、Imin，洗HiBind DNA离屯、柱， 弃去流出液并重新使用收集管。
[0036] E、加入70化1无水乙醇稀释的洗涂缓冲液洗涂化Bind DNA离屯、柱，室溫下10,000 Xg离屯、Imin。
[0037] F、弃去液体并最大转速空柱离屯、2minW干燥离屯、柱基膜。
[0038] G、将化Bind DNA离屯、柱置于干净的1.5ml离屯、管，向离屯、柱基膜中间滴加15-3化1 洗脱缓冲液，室溫放置Imin后W13，OOOg离屯、Imin洗脱DNA。
[0039] 4)比-31基因表达载体的构建。
[0040] 将回收的比-31 DNA片段和pGL3-Basic真核表达载体(Promega公司）经过BamH巧口 化nd虹双酶切处理，用T4 DNA连接酶将双酶切后的比-31 DNA片段克隆至经双酶切的pGL3- Basic真核表达载体中，然后转染大肠杆菌D册α感受态细胞，使用正向引物和反向引物对克 隆进行筛选，将筛选得到的阳性克隆送去测序，DNA测序表明序列正确，命名为pGL3-比-31。 [0041 ] 5)比-31慢病毒质粒的构建。
[0042] A、使用BamH I单酶切pGL3-比-31及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl (购买于汉恒 生物科技有限公司）；
[0043] B、使用T4 DNA连接酶将化-31 DNA片段亚克隆入BamH I单酶切线性化的慢病毒转 移质粒化VX-IRES-ZsGreenl，然后转染大肠杆菌D册α感受态细胞，通过限制性内切酶化nd 虹单酶切初步鉴定重组质粒，将鉴定正确的克隆送上海生工生物有限公司进行DNA测序，测 序正确的克隆命名为pLVX-比-31-ZsGreenl;大量提取质粒W备转染用。
[0044] 6)sh比-31慢病毒质粒的构建。
[0045] 在上海生工生物有限公司合成比-31 shRNA颈环结构对应的DNA序列（含有趾0巧口 化〇1酶切位点），使用趾〇1单酶切比-31 shRNA颈环结构对应的DNA序列及慢病毒载体pLVX- IRES-ZsGreenl，使用T4 DNA连接酶将化-31 shRNA颈环结构对应的DM序列克隆入线性化 的慢病毒质粒载体 pLVX-IRES-ZsGreenl，命名为pLVX-sh化-31-ZsGreenl。化-31 shRNA 颈 环结构对应的DNA序列如下：
[0046] 5 '-CTCGAGAGAGGGCTACCTGGAGACACCATTG-3 '。
[0047] (2)0ct4和sh0ct4慢病毒表达载体的构建(在本实验中做为对照组）。
[004引l)0ct4基因引物的设计。
[0049] 用Primer 5.0软件设计扩增0ct4基因开放阅读框的引物，引物两端酶切位点分别 为化〇1和化〇1。引物由上海生工生物有限公司合成，扩增0ct4的引物序列如下：
[0050] 0ct4正向引物：5'-CCGCTCGAGAGGATGGCGGGACACCTGGCTT-3' ；
[0化 1 ] 0ct4反向引物：5'-CATGCCATGGAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3'。
[0化2] 2)扩增0ct4基因。
[0053] W人胚胎干细胞的cDNA(购自上海斯丹赛生物技术有限公司）为模板扩增0ct4基 因。PCR扩增的反应条件同上，PCR扩增的反应体系如下：
[