抗c-Met嵌合抗体及应用
【专利摘要】本发明公开了一种重组抗人c?Met嵌合抗体，其重链可变区核酸序列如SEQ ID:1所示，轻链可变区核酸序列如SEQ ID NO:2所示；其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID:3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；其完整重链核酸序列如SEQ ID:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID:6所示；其完整重链氨基酸序列如SEQ ID:7所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID:8所示。本发明所公开的嵌合抗体能特异性与人c?Met结合，在筛选阻断HGF/c?Met信号转导通路进而抑制肿瘤生长的中和抗体药物研发方面具有重大作用。
【专利说明】
抗c-Met嵌合抗体及应用
[0001]技术领域本发明属于抗体药物技术领域，具体涉及一种针对人间质表皮转化因子C-Met分子的重组嵌合抗体及其应用。
[0002]【背景技术】人间质表皮转化因子(c-Mesenchymalepithelial transit1nfactor, c-Met)是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体超家族成员，也是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)已知的惟一受体。其被受体激活后介导细胞信息传递，调控细胞骨架重排，是细胞增殖、分化和运动的重要调节因素。近年来研究发现，c-Met在我国发病率较尚的肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、脑胶质瘤等肿瘤组织中呈现异常高表达、突变或活性改变。且HGF/c-Met信号通路的激活程度与肿瘤侵袭和转移呈正相关。目前，c-Met已经成为抗肿瘤药物研究的一个重要靶点。2011年8月，第一个c-Me t激酶抑制剂药物克唑替尼胶囊(cr i z ο t i n i b )获得FDA批准用于治疗晚期和ROSI阳性非小细胞肺癌。目前，还没有FDA批准的抗c-Met的中和抗体药物。传统鼠源抗体在人体内会产生人抗鼠抗体反应(Human ant1-mouse antibody, HAMA)，且不能有效地活化补体和Fe受体相关的免疫效应，抑制了其临床应用。而基因工程改造后的人鼠嵌合抗体很好的解决了这个问题。
【发明内容】
[0003]
本发明解决问题之一是采用兼并引物法准确克隆出c-Met鼠单抗3E1D7的可变区序列。
[0004]本发明提供的重组抗人c-Met嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQID NO:1所示，其轻链可变区的核酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0005]本发明提供的重组抗人c-Met嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示;其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0006]本发明解决的问题之二是采用重叠延伸PCR技术构建了具有自主知识产权的抗人c-Met嵌合抗体。
[0007]本发明提供重组抗人c-Met嵌合抗体，其完整重链核酸序列如SEQID:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID: 6所示。
[0008]本发明提供重组抗人c-Met嵌合抗体，其完整重链氨基酸序列如SEQID: 7所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID: 8所示。
[0009]本发明提供的重组抗人c-Met嵌合抗体基因序列在哺乳动物内进行了表达，并获得了目的抗体。
[0010]以该序列为模板可以在保持特异性和亲和力的前提下进化成全人源抗体或人源化抗体以及各种具有应用前景的产品，如scFv, Fab等。
[0011]本发明所提供的重组抗人c-Met嵌合抗体，能特异性的与肝细胞生长因子受体C-Met结合。与其亲本抗体相比，其亲和力和特异性不仅得到保留，而且在人体内的免疫源性将大大降低，因而更符合抗体药物应用于人体治疗的要求。
【附图说明】
[0012]图1为琼脂糖电泳鉴定抗人C-Met单克隆抗体3E1D7重链可变区、轻链可变区、
人IgGl轻链恒定区基因Ck和人IgGl重链恒定区基因Cy I基因的PCR产物电泳图及嵌合抗体完整重、轻链慢病毒表达质粒酶切鉴定图，其中(a)是3E1D7重链可变区、轻链可变区基因电泳结果(泳道I为DL2000 Marker;泳道2为重链可变区条带339bp;泳道3为轻链可变区条带321bp);(b)是人IgGl恒定区Cy I和Ck基因电泳结果(泳道I为DL2000 Marker；泳道2为Cy I基因条带约100bp;泳道3是Ck基因条带约350bp); (c)是慢病毒表达质粒酶切鉴定(泳道I为DL2000 Marker;泳道2是嵌合抗体重链慢病毒表达载体酶切;泳道3是嵌合抗体轻链慢病毒表达载体酶切)。
[0013]图2为荧光显微镜(X100)观察转染慢病毒质粒的HEK293T细胞，其中(a)和(b)为显微镜下观察嵌合抗体组的绿色焚光蛋白表达(a:普通光镜;b:焚光光镜)。
[0014]图3为RT-PCR鉴定c-Met嵌合抗体重、轻链转录水平的表达(泳道I是DL2000Marker ；泳道2是完整嵌合抗体重链PCR产物，约1400bp ；泳道3是完整嵌合抗体轻链PCR产物，约700bp)。
[0015]图4为嵌合抗体ch3ElD7的还原性SDS-PAGE检测(M:蛋白Marker; Lanel:细胞培养原液；lane2:滤过液;lane3:纯化后的嵌合抗体ch3ElD7)。
[0016]图5是ELISA检测嵌合抗体与人HGFR的结合活性。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0018]实施案例一鼠单抗3E1D7可变区基因及人恒定区基因的扩增及测序 HEK293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所；克隆载体pCR-Blunt购自
Invitrogen公司；感受态大肠杆菌DH5a购自北京全式金生物技术有限公司；分泌抗c_Met中和抗体的杂交瘤细胞株3E1D7、慢病毒表达质粒pRRL-CMV、质粒pcDNA3.1-CK(含有人IgGl轻链恒定区基因Ck)和质粒PCDNA3.l-1gGl(含有人IgGl重链恒定区基因Cy I)均为本实验室构建并保存。
[0019]TRIzol法从分泌抗人c-Met的杂交瘤细胞株3E1D7中提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。以合成的cDNA为模板，分别利用引物P1、P2和P3、P4扩增鼠单抗3E1D7的重、轻链可变区Vh和Vl基因。同时，以质粒pcDNA3.1-1gGl为模板，以P5、P6为引物扩增出人IgGl重链恒定区基因0丫1。以质粒?(^嫩3.1-0为模板，以？7、？8为引物人1861轻链恒定区基因0。扩增反应程序为:98 °C预变性3 min；98 °C变性15 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸40 s，32个循环；72 °C再延伸10 mirul.5%琼脂糖凝胶结果显示，鼠源Vh和Vl基因的PCR产物分别可见约339和321bp的特异性条带，人源Cy I和Ck基因的PCR产物可见约1000和350bp的特异性条带，大小均与理论值相符(图1)。将上述扩增基因分别连入克隆载体pCR-Blunt中，转化感受态大肠杆菌DH5a，送苏州金唯智生物技术有限公司测序。测序结果通过与Kabat数据库比较，确定无论是在基因序列还是氨基酸序列上均具有唯一性。说明成功扩增克隆抗体3E1D7的Vh和Vl基因及人IgGl的C γ I和Ck基因。
[0020]实施案例二嵌合抗体完整重、轻链基因的扩增及慢病毒表达质粒构建
利用Ρ9、Ρ10和PU、Ρ12引物，通过重叠延伸PCR连接鼠源可变区基因与人源恒定区基因，得到完整的嵌合抗体重、轻链基因。测序结果表明成功得到含有嵌合抗体完整重链的质粒pCR-Blunt-ch3E-H和完整轻链的质粒pCR- Blunt- ch3E_L，H链基因大小为1410bp，轻链大小为723bp。分别将以上两个质粒用AgeI和SalI双酶切，同时用AgeI和SalI酶切慢病毒表达载体pRRL-CMV。用T4连接酶将目的片段和慢病毒表达载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a，筛选阳性克隆，对获得慢病毒表达质粒pRRL-CMV-ch3E-H和pRRL-CMV-ch3E-L进行酶切及DNA序列测定。酶切结果如图1C。酶切后条带大小与预期条带相符，表明慢病毒表达载体构建成功。
[0021]上述PCR引物名称及序列如下:
Vh Pl引物序列:F:5’-ATGGA(A/G)GT(A/G)(A/C)AGCTG(C/G)AG-3’ ；
Vh P2引物序列:R:5’_ AATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCTGCT -3’；
Vi P3引物序列:F: 5'-GA(C/T)ATTGTG(A/C)T(C/G)AC CCAGACTCCA -3，;
Vi P4引物序列:R:5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCC-3’ ；
IgGl-C γ I P5 引物序列:F: 5 ’ -GCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC-3’；IgGl- Cy I P6引物序列:R:5’_ ATTGTCGACCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’(下划线所示是5?![酶切位点)；
IgGl- Ck P7引物序列:F: 5’-AGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGT-
3，；
IgGl- Ck P8引物序列:R:5’_ ATTGTCGACCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG-3’ (下划线所示是5?![酶切位点)；
嵌合抗体重链 P9 引物序列:F: 5 ’ -TATACCGGTCGCCACCATGGA (A/G)GT (A/G)(A/C)AGCTG(C/G)AG-3’(下划线所示是命el酶切位点)；
嵌合抗体重链 PlO引物序列:R:5’-TGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3’ ；
嵌合抗体轻链 Pll 引物序列:F: 5 ’ -TATACCGGTCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACACCG-3 ’(下划线所示是酶切位点)；
嵌合抗体轻链 P12引物序列:R:5’_ TTTGATTTCCAGCTTGGTGCCT-3’。
[0022]实施案例三嵌合抗体在293T细胞中的表达
接种处于对数生长期的293T细胞，待细胞生长至50%-60%融合时进行转染。嵌合抗体组将5.4yg慢病毒包装质粒混合物和5.0yg慢病毒表达质粒(pRRL-CMV-ch3E-H与pRRL-CMV-ch3E-L各占2.5yg)用基础培养基重悬至84yL，利用磷酸钙法转染293T细胞。同时，以含有绿色荧光蛋白的空载体(PRRL-CMV-GFP)作为阳性对照，以未转染质粒的293T细胞作为空白对照。转染24h后病毒包装成功，换完全DMEM培养基，加入工作浓度的助感染剂polybrene，以利于病毒颗粒进一步感染293T细胞。感染后24h，荧光显微镜观察发现，嵌合抗体组及阳性对照组细胞均有绿色荧光蛋白。未转染质粒的空白对照293T细胞则无荧光表达(如图2)。初步证明慢病毒表达体系快速产生了嵌合抗体蛋白。
[0023]实施案例四检测嵌合抗体重、轻链基因mRNA的表达收集感染后24h的293T细胞，TRIzol法提取总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，PCR法鉴定嵌合抗体在转录水平的表达情况。以P9、P6为上、下引物扩增嵌合抗体重链基因片段，以P11、P8为上、下游引物，扩增嵌合抗体轻链基因片段。1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示，嵌合抗体组293T细胞中有大小约1400bp的嵌合抗体重链基因片段和大小约700bp的嵌合抗体轻链基因片段(如图3)。测序结果也表明，目的条带为编码嵌合抗体重链、轻链的基因序列。
[0024]实施案例五嵌合抗体的纯化及SDS-PAGE检测
收集293T细胞培养上清，将其经0.45 μπι的滤膜过滤。将滤过的培养液与PBS缓冲液等体积混合，采用Protein A Sepharose 4B亲和层析柱纯化，操作方法按说明书进行。将收集的洗脱液进行10%的SDS-PAGE电泳分析，BCA试剂盒测定蛋白浓度，结果显示蛋白纯化效果较好，无明显杂带。可见分子质量分别约为2 5KDa和5 OKDa的蛋白条带，与理论值一致，表明纯化得到的蛋白是完整的嵌合抗体(如图4)。
[0025]实施案例六嵌合抗体ch3ElD7生物学活性检测
ELISA法检测抗体活性。将人c-Met胞外区重组蛋白按照200ng/孔的浓度进行过夜包被，次日封闭后，加入倍比稀释的嵌合抗体ch3ElD7。以亲本鼠源抗体作为对照，37°C孵育2h，I3BST洗板3次，每次5min，再加入HRP标记的羊抗人IgG Fe片段，37°C孵育lh，测定0D450数值。值为三次平行实验的平均值。结果显示，加入纯化后的嵌合抗体呈强阳性反应，且随着浓度的增加，信号逐渐增强。而加入鼠源亲本抗体则呈阴性反应。表明嵌合抗体可与人C-Met抗原特异性结合，同时具有人抗体的恒定区(如图5)。
【主权项】
1.一种重组抗人C-Met嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；其轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.—种重组抗人c-Met嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQID N0:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。3.—种DNA分子，编码了权利要求1或2所述的重组抗人c-Met嵌合抗体。4.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人c-Met嵌合抗体的重链核酸序列如SEQIDNO:5所示;轻链核酸序列如SEQ ID NO:6所示。5.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人c-Met嵌合抗体的重链氨基酸序列如SEQID: 7所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID: 8所示。6.编码有权利要求1-5任一所述重组抗人c-Met嵌合抗体DNA的质粒。7.编码有权利要求1-5任一所述重组抗人c-Met嵌合抗体的表达，包括在原核和真核细胞的表达。8.根据权利要求1-5之一所述的重组抗人c-Met嵌合抗体，其特征在于其与肝细胞生长因子受体c-Met特异性结合，其能阻断HGF与c-Met结合。9.一种如权利要求4-5所述的重组抗人c-Met嵌合抗体的应用，其特征在于:用于肿瘤的诊断及治疗。
【文档编号】C07K16/28GK105924524SQ201610254063
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月23日
【发明人】郭佳, 蒋明, 尹衍新, 于丽华, 毛玉婷
【申请人】同济大学苏州研究院