一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，主要涉及一种核酸分子及其在人源化抗体制备中的应 用。
【背景技术】
[0002] 抗体是一类重要的生物医药制品，在人类疾病的预防和治疗过程中发挥了重要的 作用。治疗性抗体的发展经历了鼠源抗体、嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体和全人源化 抗体等不同的发展阶段。全人源化抗体（FullHumanizedAntibody)，是指经过基因改造或 转基因动物免疫而获得的与人源抗体蛋白质序列完全一致的抗体。全人源化抗体由于不含 动物蛋白，因此副作用较低，作用效果更好，已成为当前和未来抗体工程的主要研究和发展 方向。转基因动物全人源化抗体（TransgenicHumanizedAntibody)是指将人类免疫球蛋 白基因全部或部分通过转基因或转人工染色体技术，转移至动物基因组中[动物内源的抗 体基因缺失（或失活）]，使动物表达人类抗体，从而获得全人源化抗体。
[0003] 通过体外对人的免疫球蛋白基因进行改造，转入动物体内，再用抗原免疫改造后 的动物获得高亲和力的抗体是目前人源化抗体研发的一项重要技术，截止目前，美国FDA 已批准7个利用该方法制备的人源化抗体。当前主流的方法是将人类的免疫球蛋白重链 和轻链基因替代动物自身的免疫球蛋白重链和轻链基因，使其在动物体内进行重排生成人 类的抗体蛋白。但随着研究的深入，发现转入的人类免疫球蛋白基因片段虽然能在动物体 内重排和表达，但其产生人抗体蛋白的性能要低于未经基因改造前的动物自身抗体生产效 果。以小鼠为例，其原因主要是当抗体在B细胞发育的初级阶段作为B细胞表面受体（BCR) 时，其与鼠源的信号蛋白Iga和Igi3的相互作用并不是最优的（即鼠源BCR与鼠源的Iga 和IgP或人BCR与人的Iga和IgP相互作用效果是最好的），因此影响了抗体的类型转 换、亲和力成熟和B细胞发育为成熟的生产抗体的浆细胞。为克服这一难题，Lee等（Nature biotechnology，2014 ;32 (4) :356-363)将三个人免疫球蛋白基因（IgH，IgK和IgA)的可 变区替代小鼠的免疫球蛋白可变区，而恒定区使用小鼠免疫球蛋白的相应片段，利用这种 策略可克服上述提到的问题，获得可变区为人源，恒定区为鼠源的嵌合抗体，再通过下游的 改造将鼠源的恒定区改造为人源的恒定区，得到全人源化抗体。这种方法存在的缺点是需 要进行二次改造才能获得全人源化抗体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种可在动物体内进行重排表达人源化抗体的核酸分子， 该核酸分子克服了人类免疫球蛋白基因在不同物种中由于BCR与Iga和Igi3相互作用不 兼容性的问题，同时相对【背景技术】中提到的Lee采用的方法，其表达的人源化抗体无需进 行二次改造。
[0005] 本发明提供了一种核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因或其片段，以及人CD79基 因序列。
[0006] 上述⑶79基因序列包括⑶19α蛋白肽和⑶79β蛋白肽的编码序列。⑶19α蛋 白肽和CD79β蛋白肽的氨基酸序列分别如SEDIDΝ0. 3和SEDIDΝ0. 2所示。
[0007] 上述人CD79基因序列如SEDIDNO. 1所示。
[0008] 上述转入的人⑶79序列可位于人免疫球蛋白基因载体上或转入小鼠或猪的基因 组中。优选的，上述人⑶79序列位于人Ig核酸分子两端中的任意一端。所述人⑶79序列 位于人免疫球蛋白V区的前端或C区后端。
[0009] 上述核酸分子中⑶79基因序列的结构如图1-1所示。⑶79在上述核酸分子中位 置如图1-2所示。所述核酸分子的结构如图1-3所示。
[0010] 优选地，上述人免疫球蛋白抗体基因或其片段为人免疫球蛋白抗体重链基因。本 发明不需对人免疫球蛋白基因进行内部改造。
[0011] 上述人免疫球蛋白基因包括了人免疫球蛋白重链基因的V区基因、D区基因、J区 基因。上述人免疫球蛋白重链基因还可以包括1^以、1^丫、1^€[、1^5和/或1^|重链基 因和/或人的3' -调控区（hLCR)等。
[0012] 例如，上述核酸分子的基因簇如图2所示（黑框位置为导入的人⑶79序列）。
[0013] 通过以上的改造，上述核酸分子能够形成B细胞发育的信号传递体，并有利于IgM 细胞直接转化为IgG细胞，以及亲和力成熟。
[0014] -种表达载体，包含上述核酸分子。一种细胞，包含上述核酸分子或上述载体。一 种动物，如鼠、猪等，包含上述核酸分子。一种人源化抗体，由上述核酸分子重排、编码制得。 上述核酸分子或载体或细胞在制备人源化抗体中的应用。上述核酸分子或载体或细胞在制 备转基因动物中的应用。
[0015] 将经过上述改造的人免疫球蛋白基因转入动物体内获得转人免疫球蛋白转基因 动物，或进一步与自身免疫球蛋白基因不表达的动物进行杂交获得只表达人抗体蛋白的基 因工程动物。利用抗原免疫转入人免疫球蛋白基因（重链、轻链）的动物，获得全人源化抗 体。例如：
[0016] 采用上述核酸分子或载体或细胞制备转基因动物的方法，包括以下步骤：
[0017] (1)所述核酸分子的获得；
[0018] (2)将所述核酸分子构建入载体；
[0019] (3)向宿主细胞（包括干细胞，诱导干细胞和体细胞）或胚胎导入含有所述核酸分 子的载体；
[0020] (4)将含有人Ig的细胞植入宿主动物的胚胎内（嵌合体制备）或体细胞克隆；
[0021] (5)繁育杂合、纯合的转人Ig基因的动物（包括与宿主内源免疫球蛋白基因失活 的动物杂交）。
[0022] 上述宿主动物为哺乳动物，如鼠、兔、猪、牛、羊、鸡、马等。上述载体为人工染色体 (如酵母，细菌）、噬菌体、质粒等。上述载体导入宿主细胞的方法，包括电穿孔、病毒感染、 脂质体转染和显微注射等。
[0023] 有益效果
[0024] L本发明生产的全人源化抗体具有高亲和力。
[0025] 2.本发明可利用一种转基因动物品系产生不同类型的各种抗体，且本发明适用于 多种动物。
[0026] 3.本发明的宿主自身免疫球蛋白不表达或在检测限度以下。
[0027] 4.本发明基因重排效率高，VDJC重排、突变和利用率与人体一致。
[0028] 5.本发明直接生产全人源化抗体，不需进行二次改造，体内表达量可达到健康成 人水平。
[0029] 6.本发明不需对人免疫球蛋白基因进行内部改造。
【附图说明】
[0030] 图1-1转人⑶79基因结构图
[0031] 图1-2转人⑶79基因结构和筛选基因
[0032] 图1-3转人⑶79基因和hlg位置结果图。
[0033] 图2实施例1的改造后人免疫球蛋白重链基因簇结构图
[0034] 图3实施例1人免疫球蛋白Kappa轻链基因簇结构图
[0035] 图4实施例1人免疫球蛋白lambda轻链基因簇结构图
[0036] 图5实施例1小鼠免疫球蛋白重链基因簇
[0037] 图6实施例1敲除小鼠免疫球蛋白重链基因的基因打靶
[0038] 图7实施例1小鼠免疫球蛋白轻链基因簇
[0039] 图8实施例1敲除小鼠免疫球蛋白轻链基因的基因打靶
【具体实施方式】
[0040] 下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发 明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根 据上述
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。
[0041] 实施例1
[0042] 将改造的人免疫球蛋白基因转入小鼠体内，再免疫含有人免疫球蛋白基因的小鼠 获得全人源化抗体，具体步骤如下：
[0043] 1.人免疫球蛋白基因的优化改造
[0044] 1)人免疫球蛋白重链基因的改造
[0045] 将人⑶79基因通过同源重组转入含人Ig的YAC或BAC载体上，构建人免疫球蛋 白重链基因的基因簇如图2所示（黑框位置为导入的人CD79基因序列）。包括了依次为人 免疫球蛋白重链基因的V区、D区、J区，hlgHCy、hIgHCS、hIgHCy3、hIgHCyUhlgHCa1、 hLCR、h⑶79。h⑶79的内部结构如图1-1所示，其基因序列如SEDIDNO. 1所示；包括了 CD79a蛋白肽和CD79 0蛋白肽的编码序列；CD79a蛋白肽和CD79 0蛋白肽的氨基酸序列 分别如SEDIDN0. 3 和SEDIDN0. 2 所示。
[0046] 2)人免疫球蛋白Kappa轻链基因的改造
[0047] 人免疫球蛋白kappa轻链基因包括了人免疫球蛋白kappa轻链基因全部或部分V 区、J区、C区，以及KDE区。基因簇如图3所示。
[0048] 3)人免疫球蛋白lambda轻链基因的改造
[0049] 人免疫球蛋白lambda轻链基因包括了人免疫球蛋白lambda轻链基因全部或部分 V区、J区和C区，同时在末端加入了增强子结构。基因簇如图4所示。
[0050] 2.人源化抗体转基因小鼠的培育
[0051] 1)转人免疫球蛋白重链基因小鼠的培育
[0052] 利用已有的常规转基因技术将步骤1的1)中构建的人免疫球蛋白重链基因转入 小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白重链转基因小鼠。
[0053] 使用的PCR鉴定引物为：
[0054] PCR1
[0055] For：TGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTC
[0056] Rev：TTGCTTAACTCCACACCTGCTCCTG
[0057] PCRproductsize：329bp
[0058] PCR2
[0059] For：TTGAGGAGACTGTCCATCCTTCAC
[0060] Rev：GAGAGGGCATCTTGGTCTTCTTTC
[0061] PCRproductsize：471bp
[0062]使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(I1886)和sigma(A8792)，以健康成年人和健 康小鼠血清作为对照。
[0063] 2)转人免疫球蛋白kappa轻链基因小鼠的培育
[0064] 利用已有的常规转基因技术将步骤1的2)中构建的人免疫球蛋白kappa轻链基 因转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白kappa轻 链转基因小鼠。
[0065] 使用的PCR鉴定引物为：
[0066] PCR1 ：
[0067] FOR：TGCTCTGACCTCTGAGGACCTGTCTGTA
[0068] Rev：TTCAGGCAGGCTCTTACCAGGACTCA
[0069] PCRproductsize：616bp
[0070] PCR2 :
[0071] For：CACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACT
[0072] Rev：GAGGAAAGAGAGAAACCACAGGTGC
[0073] PCRproductsize：596bp
[0074] 使用的ELISA