一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表 达载体。
【背景技术】
[0002] CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat ( CRISPR) -CRISPR-associated endonuclease (Cas9))技术是近年出现的革命性的基因编辑 技术。该技术可以快速，容易的实现对目标DNA序列在精确的位点进行编辑，包括突变，修 改，插入等改变，使得生命的遗传密码可以按照人类的意愿改变，可以在细胞层面，也可以 在生命个体层面。该技术还近年还有广泛的拓展应用，如用于基因的激活，干扰，活细胞基 因标记，RNA的切割等等。对于农业，工业，药业，以及人类的健康都有广泛的应用前景（参 见文献：Hsu, P. D.，Lander, E. S.，and Zhang, F. (2014) · Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering. Cell 157,1262-1278)。
[0003] CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)艮P成 簇规律间隔短回文重复，是存在于细菌基因组中的DNA序列，Cas(CRISPR associated)即 CRISPR相关基因，有多种类型，Cas9是其中一种。CRISPR-Cas9系统本身是细菌的一种获 得性免疫机制，用于切割入侵的外源DNA。将其用于基因编辑，该技术以其简单，高效，精确 等优势，迅速得到广泛应用，该技术也被评为生物学2013年10大突破之一。
[0004] 该技术主要是通过向细胞内导入gRNA和Cas9蛋白实现对目标DNA的切割。gRNA 是一个经过特殊设计的向导RNA，可以识别并结合靶基因 DNA序列，Cas9蛋白是一个酶，可 以与gRNA以及其识别的DNA结合，将目的DNA序列切断，再利用细胞DNA的损伤修复机制以 及同源重组等机制，实现对DNA在断裂位点及附近进行突变，插入，替换等等修改，实现基因 编辑的目的（参见文献：Mali, P.，Yang, L.，Esvelt, K. M.，Aach, J.，Guell, M.，DiCarlo, ΙΕ. ， Norville, J. E. ， and Church, G. M. (2013) · RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339,823-826)。通常情况下，向细胞内导入Cas9蛋白是通过转染或感染 Cas9表达载体而实现的，比如在细胞里转染Cas9表达质粒，而Cas9表达质粒在细胞内被 转录为mRNA，进而翻译为Cas9蛋白，发挥结合gRNA，靶向切割DNA的作用。由此我们想到， Cas9的mRNA作为外源的核酸物质，会不会影响细胞内环境，对细胞产生影响？
[0005] mRNA和microRNA有广泛的相互作用，近年不断发现mRNA可以结合并吸附 与其序列部分互补的microRNA，从而抑制这些microRNA，使得这些microRNA所抑制 的 mRNA 表达上调（参见文献：Hansen, T. B.，Jensen, T. I.，Clausen, B. H.，Bramsen, J. B. , Finsen, B. , Damgaard, C. K. , and Kjems, J. (2013). Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature 495,384-388)。本发明人所在的实验室前期 的实验也在胚胎干细胞中发现一条长链非编码RNA，IincRNA-RoR可以吸附mir-145,从而 上调mir-145的靶基因：0ct4, Nanog等干细胞多能因子，维持胚胎干细胞的多能性（参 见文献：Wang, Y.，Xu, Z.，Jiang, J.，Xu, C.，Kang, J.，Xiao, L.，Wu, M.，Xiong, J.，Guo, X.，a nd Liu, Η. (2013). Endogenous miRNA sponge IincRNA-RoR regulates 0ct4, Nanog, and Sox2in human embryonic stem cell self-renewal. Dev Cell 25,69-80)。因此，本发明 人深知在存在序列部分互补的情况下，在mRNA表达量比较高的条件下，mRNA完全可以吸附 microRNA，从而上调该microRNA的革巴基因。
[0006] 由于CRISPR-Cas9技术通常需要在细胞中表达高水平的Cas9的mRNA，因此本发明 人认为极有必要评估这条外源mRNA是否能够影响某些重要microRNA。
[0007] 经检索国内外科技文献和专利文献，CRISPR-Cas9技术应用于基因工程的研宄 很多，例如中国专利申请CN201410400098. X等，也致力于研发新的携带Cas9蛋白的编 码基因的重组表达载体，该专利申请涉及的是携带CAS9的重组腺病毒，申请公布号为 CN104178461A。
[0008] 但目前尚无文献报道Cas9的mRNA与microRNA的相互作用，并从此方面入手改进 CRISPR-Cas9 技术。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种更安全的编码Cas9蛋白的核酸分子，本发明的另一 目的在于提供携带上述编码Cas9蛋白的核酸分子的重组表达载体。
[0010] 本发明的第三目的在于提供上述的核酸分子及其重组表达载体在CRISPR-Cas9 技术中的应用。
[0011] 本发明的第四目的在于提供一种减弱Cas9核酸分子与microRNA结合的方法。
[0012] 本发明人通过生物信息学分析发现，现在广泛应用的Cas9表达载体所转录的 mRNA上存在3个microRNA let-7家族的结合位点（如图1所示），而已报道的let-7家族 的靶基因大多是癌基因。当细胞转染现有的Cas9表达载体后，本发明人检测发现一些重要 的癌基因表达水平明显上升，如CCND2、hRAS、kRAS等（如图2A所示）。
[0013] 因此，本发明人认为，将现有的Cas9表达载体导入细胞有增加癌症的风险。
[0014] 本发明人设想构建一种新的Cas9表达载体，降低其mRNA与重要microRNA的结合 力，且仍能翻译为功能完全的Cas9蛋白，将有利于提高CRISPR-Cas9技术的安全性。
[0015] 本发明的第一方面，提供一种更安全的编码Cas9蛋白的核酸分子，所述的编码 Cas9蛋白的核酸分子，其mRNA形式的序列选自以下任一：
[0016] a)如 SEQ ID NO :1 所示；或
[0017] b)是对SEQ ID NO :1所示的序列修改、添加、缺失或取代若干个核苷酸而得的序 列，并且所述Cas9的mRNA与microRNA let-7的结合力弱。
[0018] 所述Cas9的mRNA与microRNA let-7的结合力弱，是指不至于上调let-7抑制的 癌基因，或上调程度降低，可减低Cas9核酸分子的致癌风险。
[0019] 本发明所述的M-mir-Cas9的序列，可以是在SEQ ID N0:1所示的序列的基础上 修改、添加、缺失或取代若干个核苷酸而得的核酸序列。且达到同样的与let-7结合减弱并 能翻译为发挥功能的Cas9蛋白。本领域技术人员知晓，要达到减低Cas9的mRNA与let-7 结合减弱，对Cas9的mRNA与let-7的结合位点进行同义突变就可以，本发明所提供的序列 只提供一种特例，本发明还包括其他能达到同义突变目的的序列。本领域技术人员还知晓， mRNA可以包括5 ' UTR和3 ' UTR，本发明所提供的序列只提供编码M-mir-Cas9的⑶S区，其 5' UTR和3' UTR可以有多种序列样式。
[0020] 本发明优选的Cas9核酸分子，如SEQ ID NO :1所示。
[0021] 本发明的第二方面，提供一种携带上述编码Cas9蛋白的核酸分子的重组表达载 体，所述的携带编码Cas9蛋白的核酸分子的重组表达载体，本发明命名为M-mir-Cas9,其 中携带的编码Cas9蛋白的核酸分子其mRNA形式的序列选自以下任一：
[0022] a)如 SEQ ID NO :1 所示；或
[0023] b)是对SEQ ID NO :1所示的序列修改、添加、缺失或取代若干个核苷酸而得的序 列，并且所述Cas9的mRNA与microRNA let-7的结合力弱。
[0024] 所述的载体可以是质粒、病毒（如慢病毒或腺病毒等）、合成序列、人工染色体等， 也可以是RNA等。
[0025] 所述Cas9的mRNA与microRNA let-7的结合力弱，是指不至于上调let-7抑制的 癌基因或上调程度降低，可减低Cas9核酸分子的致癌风险。
[0026] 本发明优选的Cas9核酸分子，如SEQ ID NO :1所示。
[0027] 本发明的第三方面，提供上述的核酸分子及其重组表达载体在CRISPR_Cas9技术 中的应用。
[0028] 本发明人提供的M-mir_Cas9核酸序列，将之前的Cas9序列上3个结合let-7家 族的位点全部做了同义突变，因此M-mir-Cas9不具有与let-7结合的序列基础，本发明人 通过实验证实，将M-mir-Cas9表达载体导入细胞后，CCND2, hRAS，kRAS等癌基因的表达水 平没有明显上调（图2B)，再导入相应gRNA后，目的基因仍能被成功敲除（图3)。说明本 发明人提供的M-mir-Cas9表达载体相对于现在广泛应用的Cas9表达载体具有同样功能， 但安全性更高。
[0029] 本发明提供的一个新的Cas9表达载体（M-mir-Cas9)，所转录出的mRNA与关键 microRNAlet-7的结合力弱，不能吸附let-7,同时依然能翻译成完整的Cas9蛋白发挥作 用，增加 CRISPR-Cas9基因编辑工具的安全性。本发明不上调let-7抑制的癌基因，可以克 服现有Cas9表达载体增加癌症风险的弊端，涉及更加安全的CRISPR-Cas9基因编辑工具及 其应用。
[0030] 本发明的第四方面，提供一种减弱Cas9核酸分子与microRNA结合的方法，使得 Cas9的应用中考虑其与microRNA的相互作用，从而对其进行改进。
[0031] 所述的方法包括以下步骤：
[0032] E.生物信息学方法分析现有的Cas9表达载体与microRNA结合的位点；分析可与 Cas9的mRNA结合的microRNA的作用，确定关键的microRNA，作为一个特例，本发明主要研 宄Cas9与microRNA let-7的相互作用，也可以研宄Cas9与其他任何microRNA的相互作 用，如 mir-145, mir-22, mir-15 等；
[0033] F.分析Cas9对步骤A确定的microRNA所抑制的基因表达情况的影响；作为一 个特例，本发明主要研宄Cas9表达载体所转录出的mRNA对let-7所抑制的基因如CCND2， hRAS，kRAS 的影响。
[0034] G.步骤B确认Cas9与相应microRNA革巴基因的表达情况成正比（或反比）后，同 义突变Cas9中与相应microRNA结合的位点，设计并合成Cas9核酸分子；
[0035] H.构建携带步骤C合成的Cas9核酸分子的重组表达载体。
[0036] 进一步地，实验分析步骤D获得的M-mir-Cas9表达载体所转录出的mRNA对相应 microRNA革巴基因的影响。
[0037] 进一步地，实验验证步骤D获得的M-mir_Cas9表达载体具有在gRNA的帮助下位 点特异性的切割靶DNA的功能。
[0038] 所述的同义突变，是利用遗传密码是简并性，即决定一个氨基酸的密码子大 多不止一个，置换对应同一个氨基酸的核酸三联体密码子，这