在固相设备上分离和分析核酸分子的非标记方法
【技术领域】
[0001] 分离核酸，优选在固相设备上分离核酸的方法。
【背景技术】
[0002] 在识别疾病状态时，核酸是一种重要的分析工具。DNA生物标记（例如单核苷酸多 态性（SNP)、突变和DNA的甲基化）为研宄人员寻找癌症病因提供了重要线索，并且也为在 疾病初期诊断和监测疾病状况、以及预后和监视提供了许多机会。由于DNA与其它组分如 蛋白等相比，其生理浓度极低（即每微升全血中，DNA有数十纳克，而蛋白有数十微克），所 以对于接下来的下游操作例如扩增及检测，从临床样品中高效提取和预浓缩DNA是至关重 要的。当涉及到甲基化的DNA时，这一问题更加重要。
[0003] 在正常的真核细胞中，DNA的甲基化对于基因表达调控以及染色质组织起关键的 作用。DNA的甲基化的发生机制是，在胞嘧啶环的第5位碳原子上共价加成一个甲基，形成 5-甲基胞嘧啶。这些甲基基团伸入到DNA的大沟中并有效抑制转录。在哺乳动物的DNA 中，5-甲基胞嘧啶约占基因组DNA的4%，主要在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸位点（CpG)。这 种CpG位点以低于预期的频率遍布人类基因组中，但以较高频率出现在被称为CpG岛的 DNA小区段上。CpG岛典型地位于基因起始转录的启动子区或其附近。在基因组DNA主 体中，大多数CpG位点被高度甲基化，与之相反，正常体细胞的种系组织和启动子中的CpG 岛保持非甲基化，从而使基因表达得以进行。DNA的甲基化是由一系列高度相关的DNA甲 基转移酶〇)NMT)介导的，这种酶将甲基从S-腺苷-L-蛋氨酸转移到CpG二核苷酸中的 胞嘧啶上。DNMT构建的甲基胞嘧啶作为甲基-CpG结合域（MBD)蛋白MeCP2、MBD的结 合位点（S.B.Baylin,DNAmethylationandgenesilencingincancer.NatureClin. Prac.Oncol. 2(2005)4-11. ；M.T.McCabe,etal. ,CancerDNAmethylation:Molecular mechanismsandclinicalimplications.Clin.CancerRes.15 (2009) 3927-3937.； M.ffielscher,etal.Methyl-bindingdomainprotein-basedDNAisolationfromhuman bloodserumcombinesDNAanalysesandserum-autoantibodytesting.BMCClin. Pathol. 11 (2011) 11-20.;以及B.R.Cipriany,etal.Real-timeanalysisandselection ofmethylatedDNAbyfluorescence-activatedsinglemoleculesortingina nanofluidicchannel.Proc.Nat.Acad.SciUSA. 109(2012)8477-8482.)。通过与组蛋白 去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶以及ATP依赖的染色质重组酶的相互作用，MBD将甲基化 的DNA转变成紧密的染色质环境，从而抑制转录。特别地，MBD是MeCP2蛋白的甲基CpG 结合域，其结合任何序列中被对称甲基化的CpG对称，并参与介导依赖甲基化的转录抑制。 尽管具有有力的证据表明，MeCP2在体内专一地结合甲基化的DNA片段，同样的文献中也 报道了MeCP2在体外的DNA甲基化非依赖性结合活性，这使其适用于常规的体外DNA分析 [S.B.Baylin;McCabe等；M.Wielscher等；以及B.R.Cipriany等]。
[0004] DNA的甲基化导致人体癌症中肿瘤抑制基因的表达沉默。表观基因组学领域中，越 来越多的研宄都不断凸显关键核苷酸序列的高甲基化和许多不同肿瘤的出现之间的联系。 人体癌症细胞的DNA的甲基化模式都相当扭曲。典型地，癌症细胞显示基因间区域的低甲 基化，该区域通常包括大多数的细胞甲基-胞嘧啶含量。因此，转座因子可能被激活，并导 致癌症细胞中观察到的基因的不稳定。同时，癌症细胞在许多CpG岛相关的肿瘤抑制基因 的启动子区域内出现高甲基化。因此，这些调苄基因转录沉默，从而造成功能丢失。因而， 通过低甲基化和高甲基化的作用，DNA的甲基化很大程度影响癌症细胞的基因组全貌，并可 能比相对较罕见的编码区基因突变的影响还大[S. B. Baylin ;McCabe等；M. Wielscher等； 以及B. R. Cipriany等]。DNA的甲基化对癌症的研宄和临床有着重要的意义，因为其可以 在位点转移前就能进行早期癌症诊断。一个例子就是RAR0，一种甲状腺-类固醇激素受 体，通过调控基因表达来控制许多细胞类型的生长。RAR0的甲基化在乳腺癌、肺癌和膀胱 癌中已有报道。
[0005] 最近，几种基因组范围的甲基化筛选技术的发展大大增加了我们对于正常细胞 和癌细胞的DNA的甲基化模式的理解。尤其是，通过MSP(甲基化特异性PCR)可以迅速 判断CpG岛内几乎任何CpG位点的甲基化状态。该测定通过亚硫酸氢钠对DNA进行初 始修饰，将所有非甲基化的、而不是甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并利用甲基化DNA， 而不是非甲基化DNA特异性的引物进行后续扩增。MSP仅需要少量DNA，对给定的CpG 岛位点的0. 1%的甲基化等位基因是灵敏的。利用亚硫酸盐处理来进行胞嘧啶到尿嘧 啶的化学修饰，为DNA的甲基化研宄提供了另一种方法，其避免了限制性酶的使用。然 而，这些方法技术上相当困难，并需要付诸大量劳动力，且由于不克隆扩增的产物，该技 术的灵敏性低于南方分析法（Southernanalysis)，需要25%的等位基因甲基化后用于 检测。因此，从人类基因组DNA中分离甲基化的DNA对于改进癌症中的DNA的甲基化分 析是重要的一步，同时也极具挑战性[J.G.Herman,J.R.et al.，Methylation-specific PCR:a novelPCRassay for methylation status ofCpGislands. Proc. Nat. Acad. Sci USA.93(1996)9821-9826. ；S.Pan, et al. , Double recognition of oligonucleotide and protein in the detection of DNA methylation with surface Plasmon resonance biosensors. Biosens. Bioelectron.26 (2010)850-853.；以及J.D. Suter, et al. , Label-free DNA methylation analysis using opt0-fluidic ring resonators. Biosens.Bioelectron.26(2010) 1016-102]〇
[0006] 在用于从基因组DNA中分离甲基化DNA的液相方法中，目前为止，在大肠杆菌中过 表达克隆的组氨酸标记蛋白获得的重组MBD蛋白主要被用于DNA的甲基化分析。MBD蛋白 优选地以类似亲和色谱的方式固定化使用，通过NaCl梯度洗脱步骤分离甲基化DNA，用于 液相中的PCR和凝胶分析。根据多个公司的商业化协议方案（protocol)，附着在Ni-琼脂 糖或磁珠上，用于DNA亲和纯化的MBD蛋白允许同时进行甲基化DNA的分析。MBD分离的 DNA尤其适用于DNA的甲基化分析（图1，黑线）。
[0007] 然而，之前有关无亚硫酸氢盐修饰的、基于非标记生物传感器的DNA甲基化的检 测的研宄迄今只用合成的寡核苷酸进行了验证。由于如血液、尿液或唾液等体液中的基 因组DNA中天然甲基化的DNA的含量极低，直接对其进行检测非常困难。特定基因的数 量在总DNA中是极低的。例如，Su等人报道了，在癌症患者的50-200y1尿液或血液样品 中仅能够发现约2个拷贝的突变的肿瘤克里斯汀-拉斯（Kristin-ras)DNA[Y.H.Su，et al.,Block,DetectionofmutatedK~rasDNAinurine,plasma,serumofpatientswith colorectalcarcinomaoradenomatouspolyps,AnnalsoftheNewYorkAcademyof Sciences1137(2008) 197-206.]。已报道的非标记生物传感器的灵敏度不足以检测如此 低浓度的天然DNA生物标记物。因此，这些非标记技术不适用于无靶DNA扩增的体外诊断 (IVD)设备。
[0008] 据最近报道，高灵敏度硅基微环形谐振器通过监测谐振波长的偏移而用于检测生 物分子（例如蛋白、甲基化DNA、核酸）。光学折射率（RI)传感器在许多应用领域被广泛研 宄，并且在生化分析领域有重要作用。在现有的生化RI传感器中，那些基于集成光学波导 的传感器因其灵敏度高、尺寸小以及集成度高而备受关注。最近，基于狭缝波导的RI传感 器得到了广泛的关注，原因在于狭缝波导的显著特性，该传感器在夹在两个高折射率条带 之间的亚波长尺寸低折射率区域（插槽区域）中产生高的光强。与传统波导相比，使用狭 缝作为感应区，可获得更大的光-分析物相互作用，从而获得更高的灵敏度。感应光通过一 个渐逝场被集中到表面附近，该渐逝场发生指数衰减，具有高达几百纳米的特征衰减长度。 因此，折射率在衰减长度内受分析物与固定化的捕获配体结合的影响。硅微环形谐振器是 基于折射率的光学传感器，对接近传感器表面的生物分子进行高度灵敏的、非标记的、实时 的多重检测。此外，该装置可通过标