特异于cadm1的全人抗体的制作方法

专利名称：特异于cadm1 的全人抗体的制作方法
技术领域：
本发明一般性地涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地，本文提供了抗体(特别是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体)和免疫缀合物，以及其它治疗性蛋白，所述抗体、免疫缀合物和治疗性蛋白针对免疫球蛋白样粘附分子CADMl ；编码此类抗体和治疗性蛋白的核酸；用于制备本发明的单克隆抗体和其它治疗性蛋白的方法；以及用于治疗疾病(例如由CADMl的表达/活性介导的癌症和/或与其配体的异常表达/活性相关的癌症)的方法。
背景技术：
细胞粘附分子一般被鉴定为钙粘着蛋白、整合素、选择素或被鉴定为为免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。免疫球蛋白超家族分子包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共同受体和共刺激分子，参与向淋巴细胞的抗原呈递的分子，细胞粘附分子和一些细胞因子受体。 Ig超家族细胞粘附分子构成脊椎动物中超过100种分子，包括NCAM (神经细胞粘附分子)、 Ll家族CAM、ICAM (细胞内细胞粘附分子)、VCAM (血管细胞粘附分子)、SIGLEC (唾液酸结合性Ig样凝集素，包括CD22和CD83)、结合素(nectin)、CD2、CD48。免疫球蛋白超家族分子CADMl最初是由多个研究小组表征的；因此，该分子在科学文献中通过许多名称而被鉴别，所述名称包括细胞粘附分子1、突触细胞粘附分子 (synCAM)、精子发生免疫球蛋白超家族分子(sgIGSF)、IGSF4、BL2、ST17、NECL2、RA175和 CADM1A。其最初还被报道作为肿瘤抑制因子，也已知为TSLCl (Murakami et al. , Nature Genetics 27(4) 427 (2001)) 钙粘着蛋白和整合素需要二价阳离子(例如Cf2或Mf2)用于粘附活性，与之不同，Ig超家族分子通常是不依赖于Cf2或Mg”的。CADMl的结构被表征为具有含有3个免疫球蛋白样基序的细胞外结构域、单一的疏水性跨膜α螺旋和通过DAL-I与肌动蛋白纤维结合的细胞内结构域，以及含有PDZ结合性基序的短的C末端细胞质尾巴。已知两种CADMl同种型ΝΜ_014333和ΝΜ_001098517，后者具有27个氨基酸的缺失。分析表明相应于CADMl 的细胞质结构域的氨基酸序列在5种哺乳动物中是相同的，并且在脊椎动物中是高度保守的，暗示着CADMl在正常的细胞-细胞相互作用中的重要作用。小鼠CADMl直系同源物(AAQ 023810)显示出与人类 CADMl 的 97%的同一性(Fukami et al.，Gene 295:7-12(2002))。CADMl 在神经和肥大细胞(Ito et al. J Pharmacol Sci. ；102(1) :1-5(2006)), 肺泡细胞(Ito et al. Histol Histopathol. 18(4) 1321-9 (2003)),胰腺分泌细胞 (Shingai et al. J Biol Chem. ；278 (37) :35421-7(2003)), (ffakayama et al.，Blood ； 101(7) :2601-8(2003))中表达。其还与肝细胞癌(HCC)相关。CADMl似乎在胚胎和肝硬化成人胆管细胞中表达，但不存在于无病的成人胆管中(Ito et al. , Hepatology, 45 (3) 684-94(2007)).还有报道称其与成胶质细胞瘤和肺癌相关。已经鉴定了导致CADMl失活的两种机制通过启动子甲基化和通过在基因座丧失杂合性(heterozygosity)。据报道CADM1启动子的甲基化导致在肿瘤(包括肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌)、特别是具有攻击性行为的肿瘤中丧失CADMl的表达 (Murakami et al. , Mol Cancer. 4 :28 (2005))。

发明内容
本发明通过下述解决了这些和其它相关的需要提供了针对CADMl的抗体(尤其是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体)和免疫缀合物；编码此类抗体和治疗性蛋白的核酸；用于制备抗-CADMl单克隆抗体和其它治疗性蛋白的方法；和用于治疗疾病的方法，所述疾病为例如CADMl介导的病症，例如人类的癌症， 包括小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、 乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、 肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体，尤其是鼠的、嵌合的、人源化的和全人单克隆抗体，所述单克隆抗体与一种或多种骨形态发生蛋白及其受体结合并且显示出一种或多种所需的功能特性。此类特性包括例如，与人类CADMl的高亲和力特异性结合。还提供了使用本发明的抗体、蛋白和组合物治疗多种由CADMl介导的疾病的方法。本发明提供了结合人CADMl上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段或抗体模拟物，所述表位被含有包含SEQ ID N0:19，20或21所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO :22，23或M所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体识别。在一些实施方式中，所述分离的抗体是IgGl，IgG2，IgG3或IgG4同种型的全长抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体选自完整抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗体、免疫缀合物、引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，和双特异性抗体。在优选的实施方式中，本发明的抗体是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的免疫缀合物或工程化抗体。抗体片段可以选自 UniBody、结构域抗体和纳米抗体(Nanobody)。在一些实施方式中，本发明的免疫缀合物包含治疗剂。在本发明的另一个方面，治疗剂是细胞毒素或放射性的同位素。在一些实施方式中，本发明的抗体选自Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer, Versabody 禾口 Duocalin。在本发明的一些方面，抗体以小于50Nm、小于IONm或小于INm的EC5tl与人类CADMl
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？口口。在备选实施方式中，本发明的组合物包含分离的抗体或抗原结合部分和药学上可接受的载体。在其它方面，本发明的抗体是包含权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方式中，本发明包括编码结合人类CADMl上的表位的分离的抗体或抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸。本发明的其它方面包括包含此类核酸分子的表达载体和包含其的宿主细胞。在一些实施方式中，本发明提供了用于制备抗-CADMl的方法，所述方法包括步骤获得包含编码本发明的抗体的一个或多个核酸分子的宿主细胞；使所述宿主细胞在宿主细胞培养物中生长；为宿主细胞培养物提供所述一个或多个核酸分子被表达的条件；和从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收抗体。在其它实施方式中，本发明涉及用于治疗或预防与表达CADMl的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括步骤向受试者施用有效治疗或预防该疾病的量的抗-CADMl抗体或其抗原结合部分。在一些方面，通过本发明的抗体或其抗原结合部分治疗或预防的疾病选自人类的癌症。在一些实施方式中，通过本发明的抗体治疗或预防的疾病是选自下组的癌症小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、 乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、 肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。在其它实施方式中，本发明涉及用于治疗或预防与表达CADMl的靶细胞相关的疾病的抗-CADMl抗体或其抗原结合部分。在一些方面，通过本发明的抗体或其抗原结合部分治疗或预防的疾病是人类的癌症。在一些实施方式中，通过本发明的抗体治疗或预防的疾病是选自下组的癌症小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。在其它实施方式中，本发明涉及抗-CADMl抗体或其抗原结合部分用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防与表达CADMl的靶细胞相关的疾病。在一些方面，通过本发明的药物治疗或预防的疾病是人类的癌症。在一些实施方式中，通过本发明的药物治疗或预防的疾病是选自下组的癌症小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌(包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤) 的神经内分泌癌)、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝或肾的类癌肿瘤。在其它实施方式中，本发明是结合人类CADMl上的表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段或抗体模拟物，所述表位被含有重链可变区和轻链可变区的抗体识别，所述重链可变区和轻链可变区选自SEQ ID NO :19所示的重链可变区氨基酸序列和 SEQ ID NO :22所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO :20所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO 23所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO 21所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO : 所示的轻链可变区氨基酸序列。在进一步的方面，抗体选自完整抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗体、免疫缀合物、引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，和双特异性抗体。在优选的方面，抗体是引起对于Fc 受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的免疫缀合物或工程化抗体。在本发明的进一步的方面，抗体片段选自=UniBody、结构域抗体和纳米抗体(Nanobody)。在一些实施方式中，抗体模拟物选自 Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody 和 Duocalin。在进一步的实施方式中，组合物包含分离的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，本发明是编码本发明的分离的抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸分子；在进一步的方面，可以包括包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。本发明的另一个实施方式是表达本发明的任一抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。本发明的其它方面涉及制备本发明的抗体的方法，包括步骤使用CADMl肽免疫包含人类免疫球蛋白基因的转基因动物；从所述转基因动物回收B-细胞；从所述B-细胞制备杂交瘤；选择表达结合CADMl的抗体的杂交瘤；和从所述选择的杂交瘤回收所述结合 CADMl的抗体。在其它实施方式中，制备抗-CADMl抗体的方法包括步骤使用CADMl肽免疫包含人类免疫球蛋白基因的转基因动物；从所述转基因动物的B-细胞回收mRNA ；将所述mRNA转变为cDNA ；在噬菌体中表达所述cDNA，从而由所述cDNA编码的抗-CADMl抗体被呈递在所述噬菌体的表面； 选择呈递抗-CADMl抗体的噬菌体；从所述选择的噬菌体回收编码所述抗-CADMl免疫球蛋白的核酸分子；在宿主细胞中表达所述回收的核酸分子；和从所述宿主细胞回收结合CADMl的抗体。在本发明的一些方面，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分结合具有SEQ ID NO 43或44的氨基酸序列的CADMl多肽上的表位，所述表位被含有包含SEQ ID NO 19，20或 21所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID而22，23或对所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体识别。本发明的其它特征和优点将通过以下不应被解释为限制性的详细描述和实施例而是显然的。本申请各处所引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容明确地通过引用方式并入本文。


图IA显示了 PTA021_A1人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO
25)和氨基酸序歹Ij(SEQ ID NO :19)。标示出了 CDRl (SEQ IDNO :1)，CDR2(SEQ ID NO 4)和 CDR3 (SEQ ID NO 7)区，并注明了 V、D和J种系衍生。图IB显示了 PTA021_A1人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO
28)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:22)。标示出了 CDRl (SEQ IDNO 10)，CDR2 (SEQ ID NO :13) 和CDR 3 (SEQ ID NO 16)区，并注明了 V和J种系衍生。图2A显示了 PTA021_A2人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO
26)和氨基酸序歹Ij(SEQ ID NO :20)。标示出了 CDRl (SEQ IDNO :2)，CDR2(SEQ ID NO 5)和 CDR3 (SEQ ID NO 8)区，并注明了 V和J种系衍生。图2B显示了 PTA021_A2人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO
29)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0:23)。标示出了 CDRl (SEQ IDNO :11)，CDR2 (SEQ ID NO :14)和CDR 3 (SEQ ID NO 17)区，并注明了 V和J种系衍生。图3A显示了 PTA021_A3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 27)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO :21)。标示出了 CDRl (SEQ IDNO :3)，CDR2(SEQ ID NO 6)和 CDR3 (SEQ ID NO 9)区，并注明了 V、D和J种系衍生。图;3B显示了 PTA021_A3人单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 30)和氨基酸序歹 Ij (SEQ ID N0:24)。标示出了 CDRl (SEQ IDNO 12)，CDR2 (SEQ ID NO :15) 和CDR 3 (SEQ ID NO 18)区，并注明了 V和J种系衍生。图4显示了 PTA021_A1的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 19)与人种系 VH2_05氨基酸序列(SEQ ID NO 31)以及人种系J11Jffib氨基酸序列(SEQ ID NO 37)的比对。图5显示了 PTA021_A2的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO :20)与人种系 VH2_05氨基酸序列(SEQ ID NO 32)以及人种系jpb氨基酸序列(SEQ ID NO 38)的比对。图6显示了 PTA021_A3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 21)与人种系 VH2_05氨基酸序列(SEQ ID NO 33)以及人种系jpb氨基酸序列(SEQ ID NO 39)的比对。图7显示了 PTA021_A1的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 22)与人种系 VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO 34)以及人种系JK4氨基酸序列(SEQ ID NO 40)的比对。图8显示了 PTA021_A2的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 23)与人种系 VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO 35)以及人种系JK4氨基酸序列(SEQ ID NO 41)的比对。图9显示了 PTA021_A3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO 24)与人种系 VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO 36)以及人种系JK4氨基酸序列(SEQ ID NO 42)的比对。图10显示了在NCI-H69小细胞肺癌细胞中对PTA021_A1, PTA021_A2和PTA021_ A3进行的FACS分析的结果。图IlA和IlB分别显示了在NCI-H69和DMS79小细胞肺癌细胞中对PTA021_A1， PTA021_A2和PTA021_A3进行的FACS分析的结果。图12显示了在SKOV 3卵巢癌细胞中对PTA021_A3进行的FACS分析的结果。图13显示了在A549非小细胞肺癌细胞中对PTA021_A3进行的FACS分析的结果。图14显示了在786-0肾细胞癌细胞和SkMeU8黑素瘤细胞中对PTA021_A3进行的FACS分析的结果。图15显示了在NCI-H69和DMS79小细胞肺癌细胞中对PTA021_A3和非岩藻糖化 (nonfucosylated)形式的 PTA021_A3 (nf)进行的 FACS 分析的结果。图 16A 和 16B 分别显示了 DMS79 和 NC1-H69 细胞系中由 PTA021_A1，PTA021_A2 和 PTA021_A3介导的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)。图 17A 和 17B 分别显示了在 DMS79 和 NCI-H69 细胞中对 PTA021_A1，PTA021_A2 和 PTA021_A3进行的Hum-ZAP测试的结果。图18的图显示了使用岩藻糖化或非岩藻糖化的PTA021_A3抗体对于小鼠异种移植模型中HepG2肿瘤大小的治疗效果。图19的图显示了使用PTA021_A3_式M缀合物对于小鼠异种移植模型中!fepG2肿瘤大小的治疗效果。图20A的图显示了使用剂量为0. 3umol/kg的PTA021_A3_式M缀合物对于小鼠异种移植模型中DMS79肿瘤大小的治疗效果。图20B的图显示了使用剂量为0. 1和0. 03umol/ kg的PTA021_A3-式M缀合物对于小鼠异种移植模型中DMS79肿瘤大小的治疗效果。该研究完成于第60天。图21、22和23的图分别显示了 PTA021_A3和非岩藻糖化的PTA021_A3对于H印G2、 786-0和DMS79细胞的ADCC活性。图M的图显示了单独使用或与顺钼联合使用PTA021_A3抗体对于小鼠异种移植中DMS79肿瘤大小的治疗效果。图25A和25B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的体重数据。图26A和^B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的葡萄糖数据。图27A和27B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的丙氨酸转氨酶数据。图28A和^B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的天冬氨酸转氨酶数据。图29A和^B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的碱性磷酸酶数据。图30A和30B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的乳酸脱氢酶数据。图31A和31B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的RBC数据。图32A和32B分别显示了在猕猴中进行的PTA021_A3和非岩藻糖化形式的 PTA021_A3 (NF)的探测性毒理学研究中雄性猴子和雌性猴子的WBC数据。
具体实施例方式本发明涉及以高亲和力特异性结合CADMl的分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，更特别地是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的免疫缀合物和工程化抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体源自特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体，引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，免疫缀合物，双特异性分子，affibodies，结构域抗体，纳米抗体和unibodies，制备所述分子的方法， 和包含所述分子与药学载体的药物组合物。本发明还涉及使用所述分子的方法，例如用来检测CADM1，以及用来治疗与CADMl的表达(例如CADMl在肿瘤上的表达)相关的疾病，所述肿瘤包括下列的肿瘤小细胞肺癌和神经内分泌胰腺癌，肺的类癌和胃肠的类癌。为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其它的定义贯穿于详细描述中而给出。术语“CADMl “，丨‘IGSF4 〃，“免疫球蛋白超家族成员4D”，“细胞粘附分子1 ”， “肺癌中的肿瘤抑制因子1”，“TSLC1”，“BL2”，“ST17”，“突触细胞粘附分子”，"syncaml", “结合素样蛋白2”和“NECL2”可互换地使用，并且包括人类CADMl的变体、同种型和物种同源物，包括CADMl同种型l(Genbank登记号ΝΜ_014333)和同种型2 (Genbank登记号 NM_001098517)。在PCT申请(0ΒΤ案卷号0GL_P121PCT)中，这两个同种型还被鉴定为 0GTA02fe和0GTA02^3，该申请通过引用方式全文并入本文。在一些情况下，该公开中的人类抗体可以与来自人类以外的其它物种的CADMl交叉反应。在一些实施方式中，抗体可以是完全特异于一种或多种人类CADMl的，并且可以不显示出物种或其它类型的非人类交叉反应活性。示例性的人类CADMl的完整氨基酸序列具有Genbank登记号NM_014333。术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用引起对于入侵的病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌性细胞或正常人类细胞或组织(在自身免疫或病理性炎症的情况下)的选择性损伤、对它们的破坏，以及从人体清除它们。“信号转导途径”是指在将信号从细胞的一个部分传送至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。如本文所使用的，用语“细胞表面受体” 包括例如能够接收信号并将此信号跨越细胞的质膜传送的分子和分子的复合物。本发明的 “细胞表面受体”的实例是CADMl受体。本文所称的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指可包含由二硫键互连的至少2个重链(H)和2个轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区(在本文中简写为Vh)和重链恒定区。 重链恒定区包含3个结构域CH1，Ch2和Ch3。每个轻链包含轻链可变区(本文中简写为\ 或\)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域C” Vh和/\区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，其散布在更为保守的被称作框架区(FR)的区域内。每个Vh 和八/Vk由3个⑶R和4个FR构成，按照下列顺序从氨基末端至羧基末端排列FR1，⑶R1， FR2，⑶R2，FR3，⑶R3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保持与抗原(例如CADM1)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由/νκ，Vh, CJPChI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，其为包含在铰链区由二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其实质上是具有部分铰链区的 Fab (见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed. ,3. sup. rd ed. 1993)； (iv)由Vh和ChI结构域组成的Fd片段；(ν)由抗体的单一臂的\和Vh结构域组成的Fv片段；(vi) dAb 片段(Ward et al.，(1989)NatureMi 544-546)，其由 Vh 结构域组成；(vii) 分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体包含单一可变域和2个恒定域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域/\和￥11是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成的连接子将它们连接起来，所述连接子使其成为单一的蛋白链，其中vyvK和 Vh区配对以形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；见例如Bird et al. (1988) Science242 423-426 ；和 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 距5879-5883)。此类单链抗体也意在被涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，按照与完整抗体相同的方式就功用来筛选片段。
如本文中所使用的，“分离的抗体”意指实质上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合CADMl的分离的抗体是实质上不含特异性结合除了 CADMl 之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CADMl的分离的抗体可以具有与其它抗原(例如来自其它物种的CADMl分子)的交叉反应活性。此外，分离的抗体可以实质上不含其它细胞物质和/或化学物质。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体成分”是指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体成分显示出对于特定表位的单一的结合特异性和亲和力。如本文中所使用的，术语“人抗体”意在包括具有这样的可变区的抗体其中框架区和⑶R区都源自人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定域也源自人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变导入的突变)。然而，如本文中所使用的，术语“人抗体”不意欲包括这样的抗体其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类框架序列上。术语“人类单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，其具有这样的可变区其中框架区和⑶R区都源自人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，通过包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞的杂交瘤产生人类单克隆抗体，所述转基因非人动物具有融合至永生细胞的、包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。如本文中所使用的，术语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从就人类免疫球蛋白基因而言为转基因的或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备而来的杂交瘤(下文进一步描述)分离的抗体；(b)从被转化以表达人类抗体的宿主细胞分离的抗体，例如来自转染瘤；(c)分离自重组的、组合人类抗体文库的抗体；和(d)通过涉及人类免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列的剪接的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人类抗体具有这样的可变区其中框架区和CDR区源自人类种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方式中，此类重组人类抗体可以经历体外诱变(或，当使用就人类Ig序列而言为转基因的动物时，可以经历体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的vjn V\区的氨基酸序列是这样的序列虽然源自并相关于人类种系Vh和序列，但是可能不天然地在体内存在于人类抗体种系库内。如本文中所使用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM 或 IgGl)。用语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换地使用。术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰的形式，例如抗体与另一试剂或抗体的缀合物。术语“人源化抗体”意指这样的抗体其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类框架序列上。可以在人类框架序列内进行另外的框架区修饰。术语“嵌合抗体”意指这样的抗体其中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一物种，例如这样的抗体其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人类抗体。如本文中所使用的，“特异性结合人类CADMl的抗体”意指以50Nm或更低，IONm或更低，或更优选以INm或更低的EC5tl与人类CADMl结合的抗体。如本文中所使用的，术语“不与蛋白或细胞实质性结合”的意思是不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与蛋白或细胞结合，即，以IxKTfiM或更高，更优选lxl(^M或更高，更优选1x10_4M或更高，更优选1X10_3M或更高，甚至更优选1X10_2M或更高的Kd与蛋白或细胞结合。如本文中所使用的，术语“EC5Q”意指通过定量引起50%的最大应答/效应的浓度而得的化合物效力。如本文中所使用的，术语"Kass。。“或"Ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文中所使用的，术语"Kdis“或“Kd，”意指特定的抗原-抗体相互作用的解离速率。如本文中所使用的，术语“K/意指解离常数，其由Kd%Ka之比(即Kd/Ka)获得，并且被表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域已确立的方法测定抗体的Kd值。用于测定抗体 Kd的优选方法是使用表面等离子共振，优选使用生物传感器系统例如Biaeore 系统。如本文中所使用的，术语对I gG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原的Kd为 1x1(TM或更低，更优选^lO-8M或更低，更优选IxlO-8M或更低，更优选hlO_9M或更低，更优选1x101或更低的抗体。然而，“高亲和力”结合对于其它的抗体同种型可变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合是指具有IO-fiM或更低，更优选IO-7M或更低，更优选10_8M 或更低的Kd的抗体。术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上的与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由连续的氨基酸或者由通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂后通常仍然会保留，而通过三级折叠形成的表位在经变性溶剂处理后通常会丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文中描述的技术，例如χ射线结晶和二维核磁共振(见，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996))。因此，本发明中还包括与本文描述的抗体(即PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_ A3)结合(即识别)相同的表位的抗体。可以通过以统计学上显著的方式与针对靶抗原的参考抗体的交叉竞争(即竞争性抑制其结合)的能力来鉴定结合相同表位的抗体。例如， 如果抗体结合相同或结构相似的表位(例如重叠表位)，或空间上邻近的表位(当结合时引起抗体之间的空间位阻)，则可以发生竞争性抑制。可以使用常规测定法来确定竞争性抑制，其中待测免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。有多种类型的竞争性结合测定法是已知的，例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心式竞争测定(见 Stahli et al.，Methods in Enzymology 9 :242 (1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(见 Kirkland et al.，J. Immunol. 137 :3614(1986))；固相直接标记测定，固相直接标记夹心式测定(见 Harlow and Lane, Antibodies :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988))；使用 1-125 标记物的固相直接标记 RIA (见 Morel et al.， Mol. Immunol. 25(1) :7 (1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白 EIA(Cheung et al.， Virology 176 :546(1990))禾口直接标记 RIA (Moldenhauer et al.，Scand. J. Immunol. 32 77(1990))。通常，此类测定法包括使用结合于固体表面的纯化的抗原或携带这些的任一的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过测定在存在测试免疫球蛋白的情况下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将以至少50% -55%,55% -60%, 60% -65%,65% -70%,70% -75%或更多来抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。其它技术包括例如，表位定位法，例如抗原抗体复合物的晶体的χ射线分析，其提供表位的原子分辨率。其它的方法监控抗体与抗原片段或抗原的突变变体的结合，其中， 由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰而导致的结合的丧失通常被认为是表位组分的指征。 此外，还可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。然后所述肽被认为是用于定义对应于用于筛选肽文库的抗体的表位的引导(lead)。对于表位定位，还开发了计算算法，已经表明其定位构象型不连续表位。如本文中所使用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、 两栖类、爬行类等。在以下部分中进一步详细描述了本发明的各个方面。抗CADMl 抗体本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，抗体特异性结合人CADM1。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合CADM1，例如以8xlO_7M或更低，更通常为 IxlO-8M或更低的Kd结合。本发明的抗-CADMl抗体优选显示出一个或多个下列特征以50Nm或更低，IONm或更低，或更优选INm或更低的EC5tl结合人CADMl ；结合表达CADMl的人类细胞。在一个实施方式中，抗体优选结合存在于CADMl中的抗原性表位，所述表位不存在于其它蛋白中。抗体通常结合CADMl但不结合其它蛋白，或者，以低亲和力例如IxlO-fiM或更高，更优选1x10_5M或更高，更优选1X10_4M或更高，更优选1X10_3M或更高，更优选1χ10_2Μ 或更高的Kd与蛋白结合。优选地，抗体不与相关蛋白结合，例如，抗体实质上不与ICAM、VCAM 或其它细胞粘附分子结合。在一个实施方式中，抗体可以内化进入表达CADMl的细胞。用于评价抗体内化的标准测定法是本领域已知的，包括例如HumZap内化测定法。用于评价抗体与CADMl的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如， ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术分析。在实施例中详细描述了适宜的测定法。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，例如通过Biacore 系统分析。为了评估与Raji或Daudi B细胞肿瘤细胞的结合，可以从公众可获得的来源例如美国典型培养物保藏中心获得Raji(ATCC Deposit No. CCL-86)或 Daudi(ATCC Deposit No. CCL-213)细胞，并用于标准测定法(例如流式细胞术分析)中。单克隆抗体PTA021 Al, PTA021 A2, PTA021 A3本发明的优选抗体是人单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3，如实施例1、2和3中所描述进行分离和结构表征。PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的Vh氨基酸序列分别显示于 SEQ ID NO 19,20 禾口 21 中。PTA021_A1, PTA021_A2 和 PTA021_A3 的 Vk 氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO 22,23和M中。鉴于这些抗体中的每一个都能结合CADMl，可以“混合并匹配”所述Vh和Vk序列以
14产生本发明的其它抗-CADMl结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CADMl的结合。优选地，当混合并匹配Vh和 Vk链时，来自特定VH/VK对的Vh序列被替换为结构上相似的Vh序列。类似地，优选地，来自特定VH/VK对的\序列被替换为结构上相似的Vk序列。因此，在一个方面，本发明提供了包含下列的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有选自SEQ ID NO :19,20和21的氨基酸序列的重链可变区；和含有选自SEQ ID NO :22，23和M的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体特异性结合CADMl，优选人CADMl。优选的重链和轻链的组合包括包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID N0:23的氨基酸序列的轻链可变区；或包含SEQ ID NO :21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO : 的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面，本发明提供了包含PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的重链和轻链 CDR1，CDR2 和 CDR3 或其组合的抗体。PTA021_A1，PTA021_A2 和 PTA021_A 3 的 VhCDRI 的氨基酸序列显示于 SEQID NO :1，2 禾口 3 中。PTA021_A1, PTA021_A2 和 PTA021_A3 的 VHCDR2 的氨基酸序列显示于 SEQ ID NO :4，5 禾口 6 中。PTA021_A1，PTA021_A2 和 PTA021_A 3 的 VhCDR3 的氨基酸序列显示于 SEQ ID NO :7，8 禾口 9 中。PTA021_A1, PTA021_A2 和 PTA021_ A3 的 VkCDRI 的氨基酸序列显示于 SEQID NO 10,11 禾Π 12 中。ΡΤΑ021_Α1，ΡΤΑ021_Α2 和 ΡΤΑ021_Α3 的 VKCDR2 的氨基酸序列显示于 SEQ ID NO :13，14 和 15。PTA021_A1，PTA021_A2 和PTA021_A3的VKCDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO :16，17和18中。使用Kabat系统 (Kabat, E. A. ,et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health 禾口 Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 标示CDR区。鉴于这些抗体中的每一个都能结合CADMl并且抗原结合特异性主要由⑶R1，⑶R2 和⑶R3区提供，所以可以“混合并匹配” VfDRl，⑶R2和⑶R3序列和VfDRl，⑶R2和⑶R3 序列(即，可以混合并匹配来自不同抗体的⑶R，虽然每一个抗体必须包含VfDRl，⑶R2和 ⑶R3和VkCDRI,⑶R2和⑶R3)以产生本发明的其它抗-CADMl结合分子。可以使用上文和
实施例中描述的结合测定法(例如ELiSA、Biacore 分析)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CADMl的结合。优选地，当混合并匹配VhCDR序列时，来自特定Vh序列的⑶R1、⑶R2 和/或⑶R3序列被替换为结构上相似的⑶R序列。类似地，当混合并匹配VfDR序列时， 来自特定Vk序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域普通技术人员而言将为很显然的是可以通过将一个或多个Vh和/或/VKCDR区序列替换为来自如本文中公开的单克隆抗体PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的CDR序列的结构上相似的序列来产生新的Vh和Vk序列。因此，在另一个方面，本发明提供了包含下列的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分
包含选自SEQ ID NO 1，2和3的氨基酸序列的重链可变区⑶Rl ；包含选自SEQ ID NO :4，5和6的氨基酸序列的重链可变区⑶R2 ；包含选自SEQ ID NO :7，8和9的氨基酸序列的重链可变区⑶R3 ；包含选自SEQ ID NO :10,11和12的氨基酸序列的轻链可变区⑶Rl ；包含选自SEQ ID NO :13，14和15的氨基酸序列的轻链可变区⑶R2 ；禾口包含选自SEQ ID NO :16，17和18的氨基酸序列的轻链可变区⑶R3 ；其中所述抗体特异性结合CADMl，优选人CADMl。在优选的实施方式中，抗体包含含有SEQ ID NO 1的重链可变区CDRl ；含有SEQ ID NO 4的重链可变区CDR2 ；含有SEQ ID NO 7的重链可变区CDR3 ；含有SEQ ID NO 10的轻链可变区CDRl ；含有SEQ ID NO 13的轻链可变区CDR2 ；和含有SEQ ID NO 16的轻链可变区CDR3。在另一个优选的实施方式中，抗体包含含有SEQ ID NO 2的重链可变区CDRl ；含有SEQ ID NO 5的重链可变区CDR2 ；含有SEQ ID NO 8的重链可变区CDR3 ；含有SEQ ID NO 11的轻链可变区CDRl ；含有SEQ ID NO 14的轻链可变区CDR2 ；和含有SEQ ID NO 17的轻链可变区CDR3。在另一个优选的实施方式中，抗体包含含有SEQ ID NO 3的重链可变区CDRl ；含有SEQ ID NO 6的重链可变区CDR2 ；含有SEQ ID NO 9的重链可变区CDR3 ；含有SEQ ID NO 12的轻链可变区CDRl ；含有SEQ ID NO 15的轻链可变区CDR2 ；禾口含有SEQ ID NO 18的轻链可变区CDR3。本领域公知的是不依赖于⑶Rl和/或⑶R2域，⑶R3域能够单独地决定抗体对于关联抗原(cognate antigen)的结合特异性，并且基于共同的⑶R3序列可预测性地产生具有相同结合特异性的多个抗体。见，例如Klimka et al. ,British J. of Cancer 83(2) 252-260 (2000)(其描述了仅使用鼠抗-⑶30抗体Ki_4的重链可变区⑶R3域来产生人源化抗-CD30 抗体)；Beiboer et al.，J. Mol. Biol. 296 :833-849 (2000)(其描述了仅使用亲本鼠M0C-31抗-EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白_2 (EGP-2)抗体)；Rader et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 :8910-8915 (1998)(其描述了使用鼠抗-整合素 α ν β 3抗体LM609的重链和轻链可变⑶R3域的一组人源化抗-整合素α ν β 3抗体，其中每个抗体成员在CDR3域之外包含不同的序列并且能够与亲本鼠抗体结合相同的表位，其亲和力等于或高于亲本鼠抗体)；Barbas et al. , J. Am. Chem. Soc. 116 :2161-2162(1994)(其公开了 CDR3域提供了对与抗原结合的最显著的贡献)；Bartas et al. , Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 92 :2529-2533 (1995)(其描述了将针对人胎盘 DNA 的 3 个 Fab (SI-1，SI-40 和 SI-32)的重链⑶R3序列移植到抗-破伤风类毒素Fab的重链上，从而替换已有的重链 ⑶R 3，并且证明了⑶R 3域单独地赋予结合特异性)；和Ditzel et al.，J. Immunol. 157 739-749 (1996)(其描述了移植研究，其中仅将亲本多特异性Fab LNA3的重链⑶R3转移至单特异性IgG破伤风类毒素-结合性Fab p313抗体的重链上就足以保留亲本Fab的结合特异性)。这些参考文献中的每一篇通过引用方式全文并入本文。因此，本发明提供了包含来自源于人或非人动物的抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性地结合CADM1。在一些方面， 本发明提供了包含来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链 CDR3域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性结合CADMl。在一些实施方式中，包含来自非人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的此类本发明的抗体相对于对应的亲本非人类抗体而言，(a)能够与其竞争结合；(b)保留功能性特性；(c)结合至相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。在其它方面，本发明提供了包含来自人类抗体(例如获自非人动物的人类抗体) 的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述人类抗体能够特异性结合 CADMl0在其它方面，本发明提供了包含来自第一人类抗体(例如获自非人动物的人类抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述第一人类抗体能够特异性结合CADMl并且其中来自所述第一人类抗体的CDR3域替换缺乏对于CADMl的结合特异性的人类抗体的CDR3域，以产生能够特异性结合CADMl的第二人类抗体。在一些实施方式中，包含来自第一人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的此类本发明的抗体相对于对应的亲本第一人类抗体而言，(a)能够与其竞争结合；(b)保留功能性特性；(c)结合至相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。在优选实施方式中，第一人类抗体是 PTA021_A1，PTA021_A2 或 PTA021_A3。具有特定种系序列的抗体在一些实施方式中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，在优选的实施方式中，本发明提供了包含重链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区是人VH2-05基因的产物或源自人VH2-05基因，其中所述抗体特异性结合CADMl。在另一个优选实施方式中，本发明提供了包含轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区是人VKL15基因的产物或源自人VKL15 基因，其中所述抗体特异性结合CADM1。在另一个优选实施方式中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含是AVH2_05基因的产物或源自人VH2_05基因(该基因分别编码如SEQ ID NO :31,32或33所示的氨基酸序列)的重链可变区；包含是AVKL15基因的产物或源自人VKL15基因(该基因分别编码如SEQ ID NO: 34，35或36所示的氨基酸序列)的轻链可变区；并且特异性结合CADMl，优选人CADMl。具有VH2_05和VKL15的Vh和Vk的抗体的实例分别为 PTA021_A1，PTA021_A2 禾口 PTA021_A3。如本文中所使用的，如果抗体的可变区获自使用人类种系免疫球蛋白基因的系统，则人类抗体包含“是特定种系序列的产物”或“源自特定种系序列”的重链或轻链可变区。此类系统包括使用目的抗原免疫携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或使用目的抗原筛选展示于噬菌体上的人类免疫球蛋白基因文库。可以通过将人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并选择在序列上与人类抗体的序列最接近 (即具有最大的％同一性)的人类种系免疫球蛋白序列来鉴定“是人类种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自人类种系免疫球蛋白序列”的人类抗体。“是特定的人类种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自特定的人类种系免疫球蛋白序列”的人类抗体可以包含相比于种系序列的氨基酸差异，所述差异是由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。然而，所选择的人类抗体在氨基酸序列上通常与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%同一，并且当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠的种系序列)相比时，包含那些将人类抗体鉴定为是人类的氨基酸残基。在一些情况下，人类抗体在氨基酸序列上可以与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95%或至少96^,97%,98%或 99%同一。通常，相对于人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，源于特定人类种系序列的人类抗体将显示出不超过10个氨基酸差异。在一些情况下，相对于种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人类抗体可以显示出不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。同源抗体在另一个实施方式中，本发明的抗体包含含有同源于本文描述的优选抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的重链和轻链可变区，并且其中所述抗体保留本发明的抗-CADMl抗体的所需功能特性。例如，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO :19,20和21的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO :22,23和M的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且所述抗体以IONm或更低的EC5tl结合人CADMl。抗体还可以结合经过人CADMl转染的CHO细胞。在多个实施方式中，抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在其它实施方式中，Vh和/或Vk氨基酸序列可以与上文给出的序列85 %，90 %， 95%，96%，97%，98%或99%同源。含有与上文给出的序列的Vh和Vk区具有高度同源性 (即80%或更高)WVi^PVk区的抗体可以这样获得使编码SEQ ID NO =25,26,27,28,29 和30的核酸分子发生诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)，然后使用本文描述的功能测定法就保留的功能测试所编码的经改变的抗体。如本文中所使用的，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于这两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的百分比同一性取决于这两个序列共有的相同位置的数目 (即％同源性=相同位置的数目/总位置数目xlOO)，这考虑到了缺口数目和每个缺口的长度，缺口的引入是为了两个序列的最优比对。可以使用数学算法(例如以下非限制性实施例中描述的)来实现序列的比较和确定两个序列之间的百分比同一性。
18
可以使用并入到ALI GN程序O. 0版)中的E. Meyers和W. Miller的算法 (Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17 (1988))来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，可以使用并入到GCG 软件包(可以从http //www. gcg. com获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch的算法(J. Mol. Biol. M :444-453(1970))来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，其中使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16，14，12，10，8，6或4，长度权重为1,2,3, 4，5 或 6。另外或备选地，本发明的蛋白序列还可以被用作“查询序列”以针对公共的数据库进行搜索，以便例如鉴定相关的序列。可以使用Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 403-10的XBLAST程序(2. O版)进行此类搜索。可以使用XBLAST程序、得分=50、词长= 3来进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口化比对，可以使用如 Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402中描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如 XBLAST 和 NBLAST)的默认参数。见 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。具有保守件修饰的抗体在一些实施方式中，本发明的抗体包含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区和含有⑶R1、⑶R2和⑶R 3序列的轻链可变区，其中这些⑶R序列中的一个或多个包含基于本文描述的优选抗体(例如PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3)的指定氨基酸序列或其保守性修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗-CADMl抗体的所需功能特性。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区，其中重链可变区⑶R3序列包含选自SEQ ID NO :7，8和9的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；轻链可变区⑶R3序列包含选自SEQ ID NO :16，17和18的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且所述抗体以InM或更低的EC5tl结合人CADMl。抗体还可以结合经过人CADMl转染的CHO细胞。在优选的实施方式中，重链可变区⑶R2序列包含选自SEQ ID NO :4，5和6的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区⑶R2序列包含选自SEQ ID NO 13, 14和15的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。在另一个优选的实施方式中，重链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID NO :1，2和3的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID NO :10，11和12的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。在多个实施方式中，抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。如本文中所使用的，术语“保守性序列修饰”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰导入本发明的抗体中。保守性氨基酸置换是这样的置换其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以使用本文描述的功能测定法就保留的功能来检测经改变的抗体。SEQ ID NO 1，2或3的重链⑶Rl序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如
1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQIDNO :10，11或12的轻链⑶Rl序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO :4，5或6中显示的重链⑶R2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、 3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO 13，14或15中显示的轻链⑶R2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失； SEQ ID NO :7，8或9中显示的重链⑶R3序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、
2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；和/或SEQID NO :16，17或18中显示的轻链 ⑶R3序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失。与本发明的抗-CADMl抗体结合相同表位的抗体在另一个实施方式中，本发明提供了与本发明的任意CADMl单克隆抗体结合人 CADMl上的相同表位的抗体(S卩，具有与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合CADMl的能力的抗体)。在优选的实施方式中，用于研究结合的交叉竞争的参考抗体可以是单克隆抗体 PTA021_A1 (其具有分别如SEQ ID NO 19和22所示的Vh和Vk序列)，单克隆抗体ΡΤΑ021_ Α2 (其具有分别如SEQ ID NO 20和23所示的Vh和Vk序列)，或单克隆抗体PTA021_A3 (其具有分别如SEQ ID而21和对所示的￥11和￥￡序列)。可以在标准的CADMl结合测定中基于它们与ΡΤΑ021_Α1，ΡΤΑ021_Α2或ΡΤΑ021_Α3交叉竞争的能力来鉴定此类交叉竞争性抗体。例如，可以使用BIAcore分析、ELISA测定法或流式细胞术来证明与本发明的抗体就结合的交叉竞争。测试抗体抑制例如ΡΤΑ021_Α1，ΡΤΑ021_Α2或ΡΤΑ021_Α3与人CADMl结合的能力证明该测试抗体能够竞争ΡΤΑ021_Α1，ΡΤΑ021_Α2或ΡΤΑ021_Α3与人CADMl的结合，因此与ΡΤΑ021_Α1，ΡΤΑ021_Α2或ΡΤΑ021_Α3结合人CADMl上的相同表位。在优选的实施方式中，与ΡΤΑ021_Α1，ΡΤΑ021_Α2或ΡΤΑ021_Α3结合人CADMl上的相同表位的抗体是人单克隆抗体。可以按照实施例中的描述制备并分离此类人单克隆抗体。工程化和修饰的抗体还可以使用具有本文公开的一个或多个Vh和/或\序列的抗体作为起始材料来工程化修饰的抗体，从而制备本发明的抗体，所述修饰的抗体与所述起始抗体相比可具有改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即％和/或^内(例如一个或多个CDR 区内和/或一个或多个框架区内)的一个或多个氨基酸来工程化抗体。另外或备选地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如，为了改变抗体的效应子功能。在一些实施方式中，可以使用⑶R移植来工程化抗体的可变区。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，相对于CDR外的序列而言，CDR内的氨基酸序列在各抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体来表达模拟特定的天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的来自所述特定的天然存在的抗体的⑶R序列(见，例如Riechmann，L. et al. (1998) Nature332 323-327 Jones, P.et al. (1986)Nature321 :522-525；Queen, C. et al. (1989)Proc. Natl. Acad. See. U. S. A. 86 10029-10033 ；Winter 的美国专利号 5，225，539 和 Queen 等人的美国专利号 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370)。因此，本发明的另一个实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有分别选自SEQ ID N0:l，2和3;SEQ ID NO :4，5禾口 6 ；禾口 SEQ ID NO :7，8禾口 9的氨基酸序列的CDRl ；CDR2和CDR3序列；所述轻链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO :10，11和12 ;SEQ I D NO :13，14和15 ；和SEQID NO 16,17和18的氨基酸序列的⑶Rl ；⑶R2和⑶R3序列。因此，此类抗体包含单克隆抗体 PTA021_A1, PTA021_A2或PTA021_A3的Vh和VkCDR序列，但可以包含来自这些抗体的不同框架序列。此类框架序列可以获自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的文献。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在下列中找到“VBase"人类种系序列数据库(在网址www. mrc-Cpe. cam, ac. uk/vbase可获得)，以及Kabat, Ε. Α.， et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication No.91-3242 ; Tomlinson, I. Μ. , et al. (1992)" The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J.Mol.Biol.^I:776-798 ；和 Cox，J.P.L.et al. (1994) " A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur.J. Immunol. 24 827-836 ；其中每一个的内容均明确地通过引用方式并入本文。作为另一个实例，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在Genbank数据库中找到。例如，以随附的Genbank登记号可获得在HCo7HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列1-69 (NG_0010109，NT_024637 和 BC070333)，3-33 (NG_0010109 和 NT_024637)，以及 3-7 (NG_0010109 和 NT_024637)。作为另一个实例，以随附的Genbank登记号可获得在HCol2HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列1-69 (NG_0010109，NT_024637 和 BC070333)，5-51 (NG_0010109 和 NT_024637)， 4-34 (NG_0010109 和 NT_024637)，3-30. 3 (CAJ556644)，以及 3-23 (AJ406678)。使用本领域技术人员熟知的被称作Gapped BLAST(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25 :3389-3402)的一种序列相似性搜索方法针对汇编的蛋白质序列数据库来比较抗体蛋白序列。BLAST是启发式的算法，因为抗体序列与数据库序列之间的统计学上显著的比对可能包含所比对单词的高得分区段配对(high-scoring segment pairs，HSP)。其得分不能通过延伸或截短被改善的区段配对被称作命中。简要地，VBASE来源(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php)的核苷酸序列被翻译，FRl 至 FR3框架区之间并包括FRl和FR3的区域被保留。数据库序列具有98个残基的平均长度。 去除那些在蛋白的整个长度上精确匹配的重复序列。BLAST蛋白质搜索以默认的标准参数 (除了被关闭的低复杂性过滤外)使用blastp程序以及BL0SUM62的置换矩阵)，过滤产生序列匹配的最高的5个命中。以所有6个框翻译核苷酸序列，并且在数据库序列的匹配区段中不含终止密码子的框被认为是潜在的命中。继而使用BLAST程序tblastx (其以所有6 个框翻译抗体序列)进行确认，并将这些翻译与以所有6个框动态翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。同一(identity)是抗体序列与蛋白质数据库在序列全长上的精确的氨基酸匹配。正数(同一 +置换匹配)是不相同的，而是由BL0SUM62置换矩阵引导的氨基酸置换。 如果抗体序列以相同的同一性与数据库序列中的两个匹配，则具有最多正数的命中将被确定为匹配序列命中。用于本发明的抗体中的优选的框架序列是与本发明所选择的抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些，例如，与本发明优选的单克隆抗体所使用的VH2-05框架序列 (SEQ ID N0:31)和 / 或 VKL15 框架序列(SEQ ID NO 34)相似。可以将 VHCDR1，CDR2 禾口 CDR3序列和VKCDR1，CDR2和CDR3序列移植到与框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中所发现的那些序列具有相同序列的框架区上；或者，可以将CDR序列移植到相比于种系序列包含一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在一些情况下，使框架区内的残基突变有益于维持或增强抗体的抗原结合能力(见例如Queen等人的美国专利号5，530，101 ； 5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370)。另一种类型的可变区修饰是使Vh和/或VKCDR1，CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以导入突变，并且可以在如本文描述和实施例中提供的体外或体内测定法中评价对于抗体结合或其它感兴趣的功能特性的影响。优选地，导入保守性修饰(如上文所讨论)。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但优选为置换。此外，通常改变CDR区内的不多于1个、2个、3个、4个或5个残基。因此，在另一个实施方式中，本公开提供了分离的抗-CADMl单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述抗体或其抗原结合部分包含(a)VHCDRl区，其包含选自 SEQ ID NO :1，2和3的氨基酸序列或与SEQ ID NO :1，2和3相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2区，其包含选自SEQ ID NO :4，5和6的氨基酸序列或与SEQ ID N0:4，5和6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VhCDR3区，其包含选自SEQ ID NO :7，8和9的氨基酸序列或与SEQ ID NO 7,8 和9相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d) VfDRl区，其包含选自SEQ ID NO :10,11 ^P 12的氨基酸序列或与SEQ ID NO :10，11和12相比具有1、2、3、 4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKOTR2区，其包含选自SEQ ID NO 13， 14和15的氨基酸序列或与SEQ ID NO :13，14和15具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3区，其包含选自SEQ ID NO :16，17和18的氨基酸序列或与SEQ ID而16，17和18相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。本发明的工程化抗体包括这样的抗体其中对Vh和/或Vk内的框架残基进行了修饰，例如以便改善抗体的特性。通常，进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方式是使一个或多个框架残基“回复突变”至对应的种系序列。更特别地，经历了体细胞突变的抗体可以包含不同于抗体所衍生自的种系序列的框架残基。可以通过将抗体框架序列与抗体所衍生自的种系序列进行比较来鉴定此类残基。例如，对于PTA021_A1，使用Kabat 编号系统，Vh的氨基酸残基#30(FR3内)是天冬酰胺(SEQ ID NO 19)，而在对应的VH2_05 种系序列中，该残基是丝氨酸(SEQ ID NO :31)。为了使框架区序列回复至其种系构型，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变使体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，PTA021_ Al的Vh的残基#30可以从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸)。作为另一个实例，对于PTA021_A1，Vh的氨基酸残基#54是天冬氨酸(SEQ ID NO
19)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是天冬酰胺(SEQID NO :31)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1的Vh的残基恥4从天冬氨酸“回复突变”为天冬酰胺。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。作为另一个实例，对于PTA021_A1，Vk的氨基酸残基#50是甘氨酸(SEQ ID NO 22)，而在对应的VKL15种系序列中，该残基是丙氨酸(SEQID NO :34)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1的Vk的残基#50从甘氨酸“回复突变”为丙氨酸。 此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。作为另一个实例，对于PTA021_A1，Vk的氨基酸残基#77是天冬酰胺(SEQ ID NO 22)，而在对应的VKL15种系序列中，该残基是丝氨酸(SEQ ID NO :34)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1的Vk的残基#77从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。作为另一个实例，对于PTA021_A2，Vh的氨基酸残基#54是天冬氨酸(SEQ ID NO
20)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是天冬酰胺(SEQID NO :32)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A2的Vh的残基#54从天冬氨酸“回复突变”为天冬酰胺。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。作为另一个实例，对于PTA021_A2，Vh的氨基酸残基#89是异亮氨酸(SEQ ID NO
20)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是苏氨酸(SEQID NO :32)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A2的Vh的FRl中的残基#89从异亮氨酸“回复突变”为苏氨酸。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。作为另一个实例，对于PTA021_A3，Vh的氨基酸残基#54是天冬氨酸(SEQ ID NO
21)，而在对应的VH2-05种系序列中，该残基是天冬酰胺(SEQID NO :33)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A3的Vh的残基#54从天冬氨酸“回复突变”为天冬酰胺。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。作为另一个实例，对于PTA021_A3，Vk的氨基酸残基#77是天冬酰胺(SEQ ID NO M)，而在对应的VKL15种系序列中，该残基是丝氨酸(SEQID NO :36)。为了使框架区序列回复至其种系构型，例如，可以使PTA021_A1 的残基#77从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸。此类经“回复突变”的抗体也意在被本发明所涵盖。另一种类型的框架修饰包括使框架区内、甚至是一个或多个⑶R区内的一个或多个残基突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体潜在的免疫原性。该方法也被称作“去免疫”，在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有更详细的描述。除了框架或CDR区内的修饰之外或作为其备选，可以对本发明的抗体进行工程化以使其包括Fc区内的修饰，通常是为了改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞性细胞毒性。此外，可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体连接一个或多个化学部分)或进行修饰以改变其糖基化， 这也是为了改变抗体的一种或多种功能特性。这些实施方式中的每一个在下文有更详细的描述。Fc区内的残基的编号是Kabat的EU索引中的编号。在一个实施方式中，修饰CHl的铰链区，从而改变(例如增大或减少)铰链区内的半胱氨酸残基数目。这种方法在Bodmer等人的美国专利号5，677，425中有更详细的描述。 CHl的铰链区中的半胱氨酸残基数目被改变是为了例如促进轻链和重链的组合，或为了增加或降低抗体的稳定性。在另一个实施方式中，使抗体的Fc铰链区突变以减小抗体的生物学半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，从而抗体相对于天然Fc铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，具有受损的SpA结合。该方法在Ward 等人的美国专利号6，165，745中有更详细的描述。在另一个实施方式中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。有多种方法是可能的。例如，可以导入一种或多种下列突变T252L，T254S, T256F，如Ward的美国专利号6，277，375 中所描述的。备选地，为了增加生物学半衰期，可以在CHl或q区内改变抗体以使其包含获自IgG的Fc区的CH2结构域的2个环的清道夫受体结合表位，如I^resta等人的美国专利号5，869，046和6，121，022中所描述的。在另一个实施方式中，按照W0/2007/059782中的描述以UniBody的形式产生抗体，该文献通过引用方式全文并入本文。在其它实施方式中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基来改变 Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234，235，236，237，四7，318，320 和322的一个或多个氨基酸可以被替换为不同的氨基酸残基，从而抗体对于效应子配体具有改变的亲和力，但保持亲本抗体的抗原结合能力。针对其的亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的Cl组分。该方法在Winter等人的美国专利号5，624，821和 5，648，260中有更详细的描述。在另一个实例中，可以将选自氨基酸残基329，331和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的Clq结合和/或减少的或消除的补体依赖性细胞毒性(⑶C)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6，194，551中有更详细的描述。在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中有更详细的描述。在另一个实例中，通过修饰下列位置上的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体的介导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对于Fc γ受体的亲和力238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278， 280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315， 320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382， 388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438 或 439。该方法在 Presta 的 PCT 公开 WO 00/42072中有更详细的描述。此外，已经定位了人IgGl上的对于Fc γ Rl，Fc γ RII， Fc YRIII和Fcfoi的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(见aiields，R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :6591-6604)。显示了在位置 256，290，298，333，334 和 339 上的特定突变会改善与Fc γ RIII的结合。另外，显示了以下组合突变会改善Fc γ RIII结合 T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。在另一个实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，以便例如增加抗体对于抗原的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。该方法在Co等人的美国专利号 5，714，350和6，350，861中有更详细的描述。另外或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的数量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式会增加抗体的ADCC能力。可以通过例如在具有改变的糖基化装置 (machinery)的宿主细胞中表达抗体来进行此类碳水化合物修饰。本领域中已经描述了具有改变的糖基化装置的细胞，并且可被用作宿主细胞而在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704，Ms705和Ms709缺少岩藻糖转移酶基因FUT8(a (1,6)岩藻糖转移酶)，从而在Ms704，Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺少岩藻糖。通过使用2个替换载体(见Yamane等人的美国专利公开号 20040110704 和 Yamane-Ohnuki et al. (2004)Biotechnol Bioeng^I :614-22)靶向破坏CH0/DG44细胞中的FUT8基因而创建Ms704，Ms705和Ms709FUT8-/_细胞系。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1，176，195描述了具有功能受损的FUT8基因(其编码岩藻糖转移酶)的细胞系，从而在此细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖化(通过减少或消除α 1， 6键-相关的酶)。Hanai等人还描述了具有低的或不具有将岩藻糖添加至结合抗体的Fc 区的N-乙酰葡萄糖胺的酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系TO2/0(ATCC CRL 1662)。 Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其具有减小的将岩藻糖附加至Asn (四7)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(同样见 Shields，R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277 :26733-26740)。Umana 等人的PCT公开WO 99/54342描述了被工程化为表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(e. g.，beta(l，4 )-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnTIII))的细胞系，从而在所述经工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的等分GlcNac结构，这产生抗体的增加的ADCC活性(同样见Umana et al. (1999)Nat. Biotech. H :176-180)。备选地，可以使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α -L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖残基(Tarentino， A. Let al. (1975) Biochem. 14 :5516-23) 本发明涉及的本文中的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体进行聚乙二醇，以便例如增加该抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的有反应活性酯或醛)在使一个或多个PEG基团附加至所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，通过与有反应活性的PEG分子(或类似的有反应活性的水溶性聚合物)发生酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文中所使用的，术语“聚乙二醇”意在涵盖任意形式的已经被用于衍生其它蛋白的PEG，例如单 (Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方式中，将被聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于将蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的，CN 102341412 A
说明书
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并且可被应用于本发明的抗体。见，例如，Nishimura等人的EPO 154 316和Ishikawa等人的 EP 0 401 384。抗体的物理件质可以通过抗-CADMl抗体的各种物理性质进一步表征本发明的抗体。可以使用多种测定法基于这些物理性质来检测和/或区分不同类别的抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。一个或多个糖基化位点在可变区中的存在可以导致由于改变的抗原结合而产生的增加的抗体免疫原性或抗体PK的改变(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41 :673-702 ；Gala FA and Morrison SL(2004) J Immunol Γ72 :5489-94 ；Wallick et al(1988)J Exp Med 168 :1099-109 ；Spiro RG (2002)Glycobiology 12 :43R-56R ；Parekh et al (1985) Nature 316 :452-7 :Mimura et al. (2000)Mol Immunol 丑697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。可以使用Glycoblot测定法来测试可变区的糖基化，该测定法切割抗体以产生Fab，然后使用测量高碘酸盐氧化和khiff碱形成的测定法检测糖基化。备选地，可以使用Dionex光色谱法(Dionex-LC)来检测可变区糖基化，其从Fab上将糖切割为单糖，并分析单一糖的含量。在一些情况下，优选制备不含可变区糖基化的抗-CADMl抗体。这可以如下实现通过选择在可变区内不含糖基化基序的抗体，或者使用本领域熟知的标准技术使糖基化基序内的残基突变。作为糖基化的实例，对于PTA021_A1，使用Kaba t编号系统，Vh的氨基酸残基 #30(在FR3内)是天冬酰胺(SEQ ID N0:19)。这是潜在的糖基化位点，可以使该残基突变为谷氨酰胺。在优选的实施方式中，本发明的抗体不含天冬酰胺异构位点。在N-G或D-G序列可能分别发生脱酰胺或异天冬氨酸效应。脱酰胺或异天冬氨酸效应导致产生异天冬氨酸， 其通过形成脱离侧链羧基末端(而非主链)的纽结的结构而降低抗体的稳定性。可以使用等量(iso-quant)测定法来测量异天冬氨酸的产生，其使用反相HPLC来检测异天冬氨酸。每一种抗体都具有独特的等电点(pi)，但是一般地，抗体将落在6至9. 5的pH范围内。IgGl抗体的pi通常落在7至9. 5的pH范围内。IgG4抗体的pi通常落在6至8的pH 范围内。抗体可具有该范围之外的pi。虽然效应一般是未知的，但是存在以下推测具有处于正常范围之外的Pl的抗体在体内条件下可能具有某些解折叠和不稳定性。可以使用毛细等电聚焦测定法来测试等电点，其产生PH梯度并且可以使用激光聚焦用于增加的精确性(Janini et al (2002)Electrophoresis^ :1605-11 ；Ma et al. (2001)Chromatographia 53 :S75-89 ；Hunt etal(1998)J Chromatogr A ■ :355-67)。在一些情况下，优选的是含有落在正常范围内的Pl值的抗-CADMl抗体。这可以如下实现通过选择具有在正常范围内的Pl的抗体，或通过使用本领域熟知的标准技术使带电的表面残基突变。每种抗体都将具有指示热稳定性的熔化温度(Krishnamurthy R and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3 :361-71) 较高的热稳定性表示更大的总体上体内抗体稳定性。可以使用技术(例如差别扫描量热法(Chen et al (2003)Pharm Res 20 1952-60 ；Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 巡47-52))来测量抗体的熔点。Imi 表示抗体的最初解折叠的温度。Tm2表示抗体的完全解折叠的温度。一般地，优选的是，本发明的抗体的Tmi大于60°C，优选大于65°C，更优选大于70°C。备选地，可以使用圆二色谱法测量抗体的热稳定性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40 :343-9) 在优选的实施方式中，选择不迅速降解的抗体。可以使用如本领域熟知的毛细管电泳(CE)和 MALDI-MS (Alexander AJ 禾口 Hughes DE (1995) Anal Chem 67 :3626-32)来测量抗-CADMl抗体的片段化。在另一个优选实施方式中，选择具有最小的聚集效应的抗体。聚集可以导致引发不想要的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学性质。一般地，具有25%或更低，优选 20%或更低，更优选15%或更低，更优选10%或更低，更优选5%或更低的聚集的抗体是可以接受的。可以通过数种本领域熟知的技术(包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色谱(HPLC) 和光散射)来测量聚集，以鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体。工稈化抗体的方法如上文所讨论的，可以通过修饰Vh和/或Vk序列或与其相连的恒定区，使用具有本文公开的Vh和Vk序列的抗-CADMl抗体来产生新的抗-CADMl抗体。因此，在本发明的另一个方面，利用本发明的抗-CADMl抗体(例如PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3)的结构特征来产生结构上相关的保持本发明的抗体的至少一种功能特性(例如结合人CADM1) 的抗-CADMl抗体。例如，可以将？14021_41，？14021_42或？14021_々3或其突变的一个或多个⑶R区与已知的框架区和/或其它⑶R重组地组合，以产生另外的、重组工程化的、如上文讨论的本发明的抗-CADMl抗体。其它类型的修饰包括之前的部分中所描述的那些。用于工程化方法的起始材料是本文提供的一个或多个Vh和/或Vk序列，或其一个或多个CDR 区。为了产生工程化抗体，无需实际上制备出(即表达为蛋白)具有本文提供的一个或多个Vh和/或Vk序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，使用序列内包含的信息作为起始材料来产生衍生自原始序列的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列并表达为蛋白。因此，在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备抗-CADMl抗体的方法，包括提供(i)包含选自SEQ ID NO :1，2和3的CDRl序列、选自SEQ IDN0:4，5和6 的⑶R2序列和/或选自SEQ ID NO :7，8和9的⑶R3序列的重链可变区抗体序列；和/或 (ii)包含选自 SEQ ID NO :10，11 禾口 12 的 CDRl 序列、选自 SEQ ID NO :13，14 禾口 15 的 CDR2 序列和/或选自SEQID NO 16,17和18的CDR3序列的轻链可变区抗体序列；改变所述重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；和将所述改变的抗体的序列表达为蛋白。可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达所述改变的抗体序列。优选地，由改变的抗体序列编码的抗体是这样的抗体其保留本文描述的抗-CADMl抗体的一种、一些或全部功能特性，所述功能特性包括但不限于以IxlO-7M或更低的Kd结合人CADMl ；结合经CADMl转染的人CHO细胞。可以使用本领域可获得的和/或本文描述的标准测定法(例如实施例中给出的那些(例如流式细胞术，结合测定法))来评估经改变的抗体的功能特性。在本发明的工程化抗体的方法的一些实施方式中，可以在抗-CADMl抗体编码序列的全长或部分上随机或选择性地导入突变，并且可以就结合活性和/或如本文描述的其它功能特性筛选所产生的经修饰的抗-CADMl抗体。本领域中已经描述了突变方法。例如， Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选法来优化抗体的生理化学特性的方法。编码本发明的抗体的核酸分子本发明的另一个方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或以部分纯化的或实质上纯的形式存在。当使用标准技术(包括碱/ SDS处理、CsCl显带(banding)、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术)从其它细胞成分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)中纯化出来时，核酸是“分离的”或 “使得实质上纯的，，。见 F.Ausubel，et al.，ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或不含内含子序列。在优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸。对于由杂交瘤(例如按照下文描述从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于获自人免疫球蛋白基因文库的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从该文库回收编码抗体的核酸。本发明的优选的核酸分子是编码PTA021_A1，PTA021_A2或PTA021_A3单克隆抗体的Vh和\序列的核酸分子。编码PTA021_A1，PTA021_A2和PTA021_A3的Vh序列的DNA序列分别如 SEQ ID NO 25, 26 和 27 所示。编码 PTA021_A1,PTA021_A2 和 PTA021_A3 的 Vk 序列的DNA序列分别如SEQ ID NO :28，29和30所示。本发明的其它优选核酸是与SEQ ID NO :25，沈，27，观，四和30所示的序列之一具有至少80 %序列同一性，例如至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %，或至少99 %序列同一性的核酸，所述核酸编码本发明的抗体，或其抗原结合部分。两个核酸序列之间的百分比同一性是序列中核苷酸相同的位置的数目，考虑到了缺口数目和每个缺口的长度，缺口的引入是为了两个序列的最优比对的需要。可以使用数学算法(例如上文描述的Meyers和Miller的算法或Altschul的XBLAST程序)来实现序列的比较和确定两个序列之间的百分比同一性。另外，本发明的优选核酸包含SEQ ID NO :25，26，27，28，29和30所示的核酸序列的一个或多个⑶R编码部分。在该实施方式中，核酸可以编码PTA021_A1，PTA021_A2或 PTA021_A3 的重链 CDRl，CDR2 和 / 或 CDR3 序列或 PTA021_A1，PTA021_A2 或 PTA021_A3 的轻链CDRl，CDR2和/或CDR 3序列。与SEQ ID NO :25，26，27，28，四或30 (VH和VK序列)的CDR编码部分具有至少 80 %，例如至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %，或至少99 %序列同一性的核酸也是本发明的优选核酸。此类核酸与SEQID NO :25，沈，27, , 或30的对应部分可在非CDR 编码区和/或CDR编码区中相区别。当所述区别在CDR编码区中时，核酸编码的核酸CDR 区与PTA021_A1，PTA021_A2或PTA 021_A3的对应的⑶R序列相比通常包含一个或多个如本文定义的保守性序列修饰。一旦获得编码Vh和Vk区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以便将可变区基因转变为全长抗体链基因，转变为Fab片段基因，或转
28变为scFv基因。在这些操作中，编码Vk或Vh的DNA片段可操作地与另一个编码另一蛋白 (例如抗体恒定区或灵活的连接子)的DNA片段连接。如本文的情境中所使用的，术语“可操作地连接”意指两个DNA片段被连接在一起，从而由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持是符合读框的。可以通过将编码VH的DNA可操作地与编码重链恒定区(CH1，CH2和CH 3)的另一 DNA分子连接而将编码Vh区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat，Ε. A.，el al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH公开号No. 91-3242)，可以通过标准的PCR扩增来获得包含这些区域的DNA 片段。重链恒定区可以是IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD恒定区，但最优选是 IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码Vh的DNA可操作地与仅编码重链CHl恒定区的另一 DNA分子连接。可以通过将编码\的DNA可操作地与编码轻链恒定区CL的另一 DNA分子连接而将编码区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat，E.A.，el al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Humar^ervices，NIH公开号No. 91-3242)，可以通过标准的PCR扩增来获得包含这些区域的 DNA片段。在优选的实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。为了产生scFv基因，将编码Vh和的DNA片段可操作地与编码灵活连接子(例如编码氨基酸序列(Gly4^er)3W)另一片段连接，从而Vh和序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中和通过所述灵活连接子被连接(见，例如Bird et al. (1988) Science242 :423-426 ；Huston et al. (1988)Proc.Natl. Acad. Sci. USA85 :5879-5883 ； McCafferty et al. ， (1990)Nature 348 :552-554)。单克隆抗体的产生可以通过各种技术产生本发明的单克隆抗体(mAb)，包括常规的单克隆抗体方法， 例如Kohler和Milstein (1975)Nature256 :495的标准体细胞杂交技术。虽然体细胞杂交程序是优选的，但是原则上可以采用其它的用于产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是被良好建立了的方法。免疫方案和分离用于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合伴侣 (例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。可以基于如上文的描述而制备的非人单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。可以从非人目标杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA并使用标准的分子生物学技术进行工程化以使其包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法(见，例如Cabilly等人的美国专利号4，816，567) 将鼠可变区连接至人恒定区。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法(见，例如Winter的美国专利号5，225，539和Queen等人的美国专利号5，530，101 ；5，585,089 ； 5，693，762和6，180，370)将鼠CDR区插入至人框架中。在优选的实施方式中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生针对CADMl的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称作HuMAb Mouse 禾日km Mouse 株的小鼠，并且在本文中联合被称作“人Ig小鼠”。HuMAb Mouse 株(Medarex , inc.)含有人免疫球蛋白基因微小基因座，其
编码非重排的人重链(μ和Y)和K轻链免疫球蛋白序列，以及使内源μ和K链基因座失活的靶向的突变(见，例如 Lonberg，et al. (1994)Nature 368(6474) :856-859)。 因此，小鼠显示出减少的小鼠IgM或κ的表达，并且，响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因发生类别转换和体细胞突变，以产生高亲和力的人IgGK单克隆抗体(Lonberg， N. et al. (1994)，见上文；综述于 Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology!!^ :49-101 中；Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13 65-93，以及 Harding，F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 7M :536-546)。HuMAb
Mouse 的制备和使用以及此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor，L. et al. (1992)Nucleic Acids Research20 :6287-6295 ；Chen, J. et al. (1993)International Immunology 5 :647-656 ；Tuaillon et al. (1993)Proc. Natl.Acad.Sci.USA90 3720-3724 ；Choi et al. (1993)Nature Genetics 4 :117-123 ；Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12 :821-830 ；Tuaillon et al. (1994)J. Immunol. 152 :2912-2920 ；Taylor, L. et al. (1994)InternationalImmunology6 :579-591 ；禾口 Fishwild， D. et al. (1996)Nature Biotechnology H =845-851，所有这些文献的内容通过引用方式以其全文被特别并入本文。另外见 Lonberg 和 Kay 的美国专利号 5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ； 5，789，650 ；5，877，397 ；5，661，016 ；5，814，318 ；5，874，299 ；和 5，770，429 ；Surani 等人的美国专利号 5，545, 807 ；Lonberg 和 Kay 的 PCT 公开 WO 92/03918，W093/12227, WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884 和 WO 99/45962 ；以及 Korman 等人的 PCT 公开 WO 01/14424o在另一个实施方式中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)来产生本发明的人类抗体。这种小鼠在本文中被称作“KM mouse ”株的小鼠，在Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中有详细描述。另外，本领域中可以获得表达人免疫球蛋白基因的备选的转基因动物系统，可用于产生本发明的抗-CADMl抗体。例如，可以使用被称作Xenomouse (Amgen，Inc.)的备选转基因系统；此类小鼠被描述于例如Kucher 1 apati等人的美国专利号5，939，598 ； 6，075，181 ；6，114，598 ；6，150，584 和 6，162，963 中。此外，本领域中可以获得表达人免疫球蛋白基因的备选的转染色体动物系统， 可用于产生本发明的抗-CADMl抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；此类小鼠被描述于Tomizuka et al. (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 =722-727中。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的母牛(Kuroiwa et al. (2002)Nature Biotechnology 巡889-894 和 PCT 申请 W0/2002/092812)，并且可被用于产生本发明的抗-CADMl抗体。还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法来制备本发明的人单克隆抗体。本领域建立了此类用于分离人类抗体的噬菌体展示方法。见，例如， Ladner等人的美国专利号5，223，409 ；5，403，484和5，571,698 ；Dower等人的美国专利号 5，427，908 和 5，580，717 ；McCafferty 等人的美国专利号 5，969，108 和 6，172，197 ；Gr iffi ths 等人的美国专利号 5，885，793 ；6，521，404 ；6，544，731 ；6，555，313 ；6，582，915 和 6，593，081。还可以使用这样的SCID小鼠来制备本发明的人单克隆抗体向其中重构了人免疫细胞，从而可以在免疫后产生人类抗体应答。此类小鼠被描述于例如Wilson等人的美国专利号 5，476，996 和 5，698，767 中。人Ig小鼠的免疫当使用人Ig小鼠来产生本发明的人类抗体时，可以使用CADMl抗原和/或重组 CADMl的纯化的或富集的制备物或表达CADMl的细胞或CADMl融合蛋白来免疫此类小鼠， 如Lonberg，N. et al. (1994)Nature368(6474) :856-859 ；Fishwild，D. et al. (1996)Nature Biotechnology H :845-851 ；和 PCT 公开 WO 98/24884 和 WO 01/14424 中所描述的。优选地，小鼠在第一次输注时是6-16周龄。例如，可以使用CADMl抗原的纯化的或重组的制备物(5-50 μ g)腹膜内地免疫人Ig小鼠。用于产生针对CADMl的全人单克隆抗体的详细程序描述于下文的实施例1中。以多种抗原获得的累积的经验已经表明当以完全弗氏佐剂中的抗原通过腹膜内(IP)方式进行最初免疫、然后以不完全弗氏佐剂中的抗原隔周IP免疫时(总共6周)，转基因小鼠有应答。然而，发现除了弗氏佐剂以外的其它佐剂也是有效的。另外发现在不存在佐剂的情况下，完整细胞是高度免疫原性的。可以通过眶后取血获得的血浆样品在免疫程序的过程中监控免疫应答。可以通过ELISA筛选血浆(如下文描述)，具有足够的抗CADMl人免疫球蛋白滴度的小鼠可被用于融合。可以在处死前3天使用抗原通过静脉内方式对小鼠加强免疫，并取出脾脏。预期对于每个免疫可能需要进行2-3次融合。通常，对于每种抗原进行6-M只小鼠的免疫。在一个实施方式中，可以使用携带HCo7，HCol2或HCol7人重链转
基因株的小鼠株。备选地或另外，可以使用km Mouse 株。另外，可以将这些株中的两种
或更多种共同繁育为含有多个不同人重链转基因的单一小鼠。制备产生人单克隆抗体的杂交瘤为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以从经免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞并与适宜的永生化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。可以就抗原特异性抗体的产生来筛选所产生的杂交瘤。例如，可以使来自经免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与含有50% PEG的1/6数目的P3X63-Ag8. 653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞 (ATCC，CRL 1580)融合。备选地，可以使用CytoPulse大室细胞融合电穿孔器(CytoPulse Sciences, Inc.，Glen Burnie Maryland)，利用基于电场的电融合方法，使来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合。将细胞以大约^clO5铺板于平底的微量滴定板中，然后在含有20%牛克隆血清，18%〃 653〃条件化培养基，5% Origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，5mM HEPES,0. 055mM 2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50mg/ml链霉素， 50mg/ml庆大霉素和IX HAT (Sigma ；融合后M小时加入HAT)的选择性培养基中温育2周。 在大约2周后，可以在将HAT替换为HT的培养基中培养细胞。然后，可以通过ELISA就人单克隆IgM和IgG抗体筛选单个孔。一旦发生大量的杂交瘤生长，通常可以在10-14天后可观察培养基。可以将分泌抗体的杂交瘤重新铺板，再次筛选，并且，如果仍然是人IgG阳性的，可以通过有限稀释法将单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量的抗体用于表征。为了纯化人单克隆抗体，可以使所选择的杂交瘤在2升的旋转瓶中生长用于单克隆抗体的纯化。可以过滤上清液并浓缩，然后以蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway, N. J.)进行亲和色谱。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查所洗脱的IgG以确保纯度。 可以将缓冲液更换为PBS，可以使用1.43的消光系数通过0D280测定浓度。可以将单克隆抗体等份分装并储存于-80°C。制备产牛单克降抗体的转染瘤也可以使用例如本领域熟知的重组DNA技术与基因转染方法的组合(例如 Morrison, S. (1985) Science 229 1202)在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，PCR 扩增或使用表达目的抗体的杂交瘤进行cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的 DNA,并且可以将该DNA插入至表达载体，从而基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。 在此情境中，术语“可操作地连接的”意指抗体基因被连接到载体中，从而该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。将表达载体和表达控制序列选择为与所用的表达宿主细胞相容的。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入至单独的载体，或者更通常地，将这两个基因插入至同一表达载体。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上的互补性限制性位点的连接，或者，如果不存在限制性位点，则进行平末端连接)将抗体基因插入至表达载体。本文描述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因通过将所述轻链和重链可变区插入至已经编码所需的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，从而Vh区段可操作地连接于该载体内的Ch区段， 并且Vk区段可操作地连接于该载体内的Q区段。另外或备选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，从而信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白的信号肽)。除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞内表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷化信号)，它们控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列被描述于例如 Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press， San Diego,CA(1990))中。本领域技术人员将理解，表达载体的设计、包括调节序列的选择可取决于如下因素，例如，待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如源自下列病毒的启动子和/或增强子巨细胞病毒(CMV)，猴病毒40 (SV40)，腺病毒 (例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤。备选地，可以使用非病毒的调节序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。另外，调节序列包括来自不同来源的序列，例如SRa 启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的序列 (Takebe, Y. et al. (1988)Mol. Cell. Biol. 8 :466-472) 除了抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起始点)和可选择的标志物基因。所述可选择的标志物基因促进其中导入了载体的宿主细胞的选择(见，例如Axel等人的美国专利号4，399，216，4，634，665和5，179，017)。例如，通常可选择的标志物基因赋予其中导入了载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的可选择标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主细胞中以氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意在涵盖通常用于将异源DNA导入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞(最优选在哺乳动物宿主细胞中)表达抗体是最优选的，因为此类真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更易于组装和分泌正确折叠且免疫上有活性的抗体。已经报道了抗体基因的原核表达对于高产率产生活性抗体是无效的(Boss，Μ. A. andffood, C. R. (1985) Immunology Today 6 :12-13)。用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞)(包括 dhfrTHO 细胞，描述于 Urlaub and Chasin, (1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,与DHFR可选择标志物一起使用，例如描述于R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159 :601-621 中)、NSO 骨髓瘤细胞、COS 细胞和 SP2 细胞。特别地，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是公开于WO 87/04462(Wilson 的)，WO 89/01036 (Bebbington 的)和 EP 338，841 (Bebbington 的)中的GS基因表达系统。当把编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间而产生抗体，所述时间足以允许抗体在该宿主细胞中表达或更优选地，允许抗体被分泌到该宿主细胞所生长的培养基中。可以使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。抗体与抗原结合的表征可以通过例如标准的ELISA就与CADMl的结合来检测本发明的抗体。简要地，以 PBS中的0. 25 μ g/ml的纯化的CADMl包被微量滴定板，然后以PBS中的5%牛血清白蛋白封闭。向每个孔中加入抗体的稀释物(例如来自经CADMl免疫的小鼠的血浆稀释物)并在 37°C温育1-2小时。以PBS/Tween洗涤平板，然后以缀合于碱性磷酸酶的二级试剂(例如， 对于人类抗体，使用山羊-抗-人IgG Fc-特异性多克隆试剂)在37°C温育1小时。洗涤之后，以PNPP底物(lmg/ml)使平板显色，并在405-650的OD进行分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将被用于融合。也可以使用如上所述的ELISA测定法来筛选显示出与CADMl免疫原有阳性反应活性的杂交瘤。亚克隆并进一步表征那些以高亲和力与CADMl结合的杂交瘤。可以从每个保留亲本细胞的反应活性(通过ELISA测定)的杂交瘤中选择1个克隆，用于制成5-10瓶细胞库，贮存于_140°C，并用于抗体纯化。为了纯化抗-CADMl抗体，可以使所选择的杂交瘤在2升的旋转瓶中生长以进行单克隆抗体的纯化。可以过滤上清液并浓缩，然后以蛋白A-琼脂糖Pharmacia，Piscataway， NJ)进行亲和色谱。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查所洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲液更换为PBS，可以使用1. 43的消光系数通过0D280测定浓度。可以将单克隆抗
33体等份分装并储存于-80°C。为了测定所选择的抗-CADMl单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用商业上可获得的试剂(Pierce，Rockford, IL)将每个抗体生物素化。可以按照上文的描述，使用 CADMl包被的ELISA平板，使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体，进行与本发明的抗体的竞争性结合的研究。可以使用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的mAb的结合。为了测定纯化的抗体的同种型，可以使用特异于特定同种型的抗体的试剂进行同种型ELISA。例如，为了测定人单克隆抗体的同种型，可以使用lyg/ml的抗-人免疫球蛋白在4°C过夜包被微量滴定板的孔。以BSA封闭后，使平板与1 μ g/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在室温反应1至2小时。然后可以使孔与人IgGl或人IgM 特异性的经碱性磷酸酶缀合的探针反应。按照上文描述使平板显色并进行分析。可以通过Wfestern印迹就与CADMl抗原的反应活性进一步测试抗-CADMl人IgG。 简要地，可以制备CADMl并使其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，以10%的胎牛血清封闭，并用待测的单克隆抗体进行探测。 可以使用抗-人IgG碱性磷酸酶检测人的IgG结合并以BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem. Co. , St. Louis, Mo.)显色。还可以通过例如流式细胞术通过监控抗体与表达CADMl的细胞的结合来测定本发明的抗体结合特异性。通常，可以使用编码CADMl的跨膜形式的表达载体来转染细胞系 (例如CHO细胞系)。在一些实施方式中，在CHO细胞系的细胞表面上表达具有氨基末端HA 标签的全长CADMl分子(SEQ ID NO 43)。转染的蛋白可以包含标签，例如myc标签，优选在N末端，以便使用针对该标签的抗体进行检测。可以通过将经转染的细胞与抗体一起温育并检测所结合的抗体来测定本发明的抗体与CADMl的结合。抗体与转染的蛋白上的标签的结合可被用作阳性对照。还可以使用相同的方法(测定与CADMl的结合的方法)通过测定抗体是否与其它蛋白(例如TSLL2/CADM1C或免疫球蛋白超家族的其它成员)结合来进一步研究本发明的抗体对于CADMl的特异性。抗体-伴侣分子綴合物在优选的方面，提供了包含根据本发明的抗-CADMl抗体和伴侣分子的缀合物，所述缀合物由式(a)表示Z [(Xz)aC (Xd) bD]m (a)其中Z是根据本发明的抗体；D是伴侣分子；(Xz)aC(X11)b合起来被称作“连接子部分”或“连接子”，因为它们连接前2个元件。在连接子内，C是可切割基团，其被设计为在伴侣分子D的预期的生物学作用的位点处被切割；XZ和Xd被称作间隔子部分(或“间隔子”)， 因为它们分别将Z和C以及C和D间隔开；下标a和b独立地是0或1 (即，Xz和/或Xd的存在是任选的)；下标m是1，2，3，4，5，6，7，8，9或10 (优选为1，2，3或4)。下文更详细地定义了上述各项。抗体Z发挥靶向功能通过结合其抗原所位于的靶组织或细胞，其将缀合物指引至那里。优选地，靶组织或细胞是肿瘤或癌细胞，并且抗原是肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。 在靶组织或细胞处，基团C的切割会释放伴侣分子D，以执行其预期的生物学功能。在一些情况下，缀合物通过胞吞作用而被内化到靶细胞中，并且切割发生于靶细胞内。通过这种方式，在作用位点处实现伴侣分子D的精确递送，减少了所需的剂量。另外，伴侣分子D在其缀合态时通常是无生物学活性的(或活性显著较低)，从而减少了针对非靶组织或细胞的不希望的毒性。由于抗癌药物通常是具有低治疗指数的高度毒性化合物，所以这是一项重要的考虑。如下标m所反映的，抗体Z的每个分子可以与多于一个伴侣分子D缀合，这取决于前者所具有的可用于缀合的位点的数目以及所采用的实验条件。本领域技术人员将理解， 虽然抗体Z的每个分子与整数数目的伴侣分子D缀合，但是缀合物的制备物可分析为伴侣分子D与抗体Z的非整数比率，这反映了统计学上的平均数。抗体Z抗体Z上的数个不同反应活性基团中的任一个可被用作缀合位点，包括赖氨酸残基中的氨基，悬垂的碳水化合物部分，羧酸基团，二硫基以及巯基。每种类型的反应活性基团代表一种权衡，具有一些优点但也具有一些抵消性的局限。关于适合于缀合的抗体反应活性基团的综述，见例如 Garnett，Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001)，171-216 和 Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123, Jt^Jfft Wffl 过引用方式并入本文。在一个实施方式中，抗体Z通过赖氨酸ε-氨基缀合。多数抗体具有多个暴露的赖氨酸ε -氨基，可以使用本领域已知的技术(包括使用异双官能试剂修饰)(如下文进一步描述的)通过酰胺、脲、硫脲或氨基甲酸酯键缀合。然而，控制哪些和多少ε_氨基发生反应是困难的，这导致缀合物制备物中潜在的批与批之间的差异。另外，缀合可引起中和对于维持抗体的天然构象而言是重要的质子化的ε -氨基，或者缀合可能发生在接近抗原结合位点的地方或发生于抗原结合位点，这两种情况都不是希望发生的。在另一个实施方式中，抗体Z可以通过碳水化合物侧链缀合，因为很多抗体是糖基化的。可以使用高碘酸盐氧化碳水化合物侧链以产生醛基，醛基继而可以与胺反应以形成亚胺基团，例如在缩氨基脲、肟或腙中。如果需要，可用氰基硼氢化钠还原亚胺基团以产生更稳定的键。关于通过碳水化合物侧链进行缀合的其它公开物，见例如Rodwell et al., Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 83,2632-2636(1986)；其公开内容通过引用方式并入本文。如同使用赖氨酸ε -氨基一样，存在关于缀合位点的位置和化学计算学的担忧。在另一个实施方式中，抗体Z可以通过羧酸基团缀合。在一个实施方式中，使末端羧酸基团官能化以产生碳酰胼，然后碳酰胼与携带醛的缀合部分反应。见Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992，3，147-153。在另一个实施方式中，抗体Z通过桥接抗体Z上的半胱氨酸残基的硫与缀合物的其它部分上的硫的二硫基缀合。一些抗体(例如IgG同种型)缺少游离的巯基但具有(例如在铰链区中)二硫基。在这样的情况中，可以通过还原天然的二硫基产生游离的巯基。 然后，如此产生的巯基可被用于缀合。见，例如，Packard et al. , Biochemistry 1986,25, 3548-3552 ；King et al. , Cancer Res.54，6176-6185(1994)；禾口 Doronina et al. , Nature Biotechnol. 21 (7), 778-784 (2003)；其公开内容通过引用方式并入本文。同样地，存在关于缀合位置和化学计算学以及可能破坏抗体的天然构象的担忧。在另一个优选的实施方式中，抗体Z通过巯基向受体部分的亲核加成产物缀合。优选的受体部分是马来酰亚胺基团，其与抗体巯基的反应示意如下
权利要求
1.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，其结合人类CADMl 上的表位，所述表位被含有包含SEQ ID NO :19，20或21所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO :22，23或M所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体识别。
2.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，其结合人类CADMl 上被包含图1-3中定义的CDR的抗体所识别的表位，包括与这些CDR被置于的框架无关而保持原始序列与人CADMl的结合的90%的DNA和氨基酸变化。
3.权利要求1或权利要求2的抗体，其中所述抗体是IgGl，IgG2，IgG3或IgG4同种型的全长抗体。
4.权利要求1或权利要求2的抗体，其中所述抗体选自完整抗体、抗体片段、人源化抗体、人类抗体、单链抗体、引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，和双特异性抗体。
5.权利要求1或权利要求2的抗体片段，其中所述片段选自=UniBody、结构域抗体和纳米抗体。
6.权利要求1或权利要求2的抗体模拟物，其中所述模拟物选自Affibody、DARPin、 Anticalin、Avimer>Versabody 禾口 Duocalin。
7.权利要求1或权利要求2的抗体，其与治疗剂缀合。
8.权利要求7的抗体，其中所述治疗剂是细胞毒素或放射活性同位素。
9.权利要求1或权利要求2的分离的抗体，其中所述抗体以小于50Nm范围内的EC5tl与人类CADMl结合。
10.权利要求1或权利要求2的分离的抗体，其中所述抗体以小于IONm范围内的EC5tl 与人类CADMl结合。
11.权利要求1或权利要求2的分离的抗体，其中所述抗体以小于INm范围内的EC5tl与人类CADMl结合。
12.组合物，其包含权利要求1或权利要求2的分离的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
13.编码权利要求1或权利要求2的抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸分子。
14.包含权利要求13的核酸分子的表达载体。
15.包含权利要求14的表达载体的宿主细胞。
16.用于制备抗-CADMl抗体的方法，所述方法包括步骤获得含有编码权利要求1或权利要求2的抗体的一种或多种核酸分子的宿主细胞；使所述宿主细胞在宿主细胞培养物中生长；为宿主细胞培养物提供所述一种或多种核酸分子被表达的条件；和从所述宿主细胞或宿主细胞培养物中回收抗体。
17.用于治疗或预防与表达CADMl的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括步骤向受试者施用有效治疗或预防所述疾病的量的抗-CADMl抗体或其抗原结合部分。
18.权利要求17的方法，其中所述疾病是人类癌症。
19.权利要求18的方法，其中所述人类癌症选自小细胞肺癌、成人T-细胞白血病、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)、黑素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经内分泌癌，包括肺、肾上腺、垂体、胃肠道、肾、肝(包括肝细胞癌)、胰腺(包括胰岛素瘤和胰高血糖素瘤)的神经内分泌癌、成胶质细胞瘤和类癌肿瘤，包括胰腺、肺、胃肠道、肝和肾的类癌肿瘤。
20.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、抗体片段、或抗体模拟物，其结合人类 CADMl上被含有重链可变区和轻链可变区的抗体所识别的表位，所述重链可变区和轻链可变区选自SEQ ID NO 19所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO :22所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO :20所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO :23所示的轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO :21所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO : 所示的轻链可变区氨基酸序列。
21.权利要求20的分离的抗体，其中所述抗体选自完整抗体、抗体片段、人源化抗体、 人类抗体、单链抗体、引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体，和双特异性抗体。
22.权利要求20的抗体片段，其中所述片段选自UniBody、结构域抗体和纳米抗体。
23.权利要求20的抗体模拟物，其中所述模拟物选自Affib0dy、DARPin、Anticalin、 Avimer>Versabody 禾口 Duocalin0
24.组合物，其包含权利要求20的分离的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
25.编码权利要求20的分离的抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸分子。
26.包含权利要求25的核酸分子的表达载体。
27.包含权利要求沈的表达载体的宿主细胞。
28.表达权利要求1、2或20的任一项的抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。
29.制备权利要求1、2或20的任一项的抗体的方法，所述方法包括步骤 用CADMl肽免疫包含人类免疫球蛋白基因的转基因动物；从所述转基因动物中回收B-细胞；由所述B-细胞制备杂交瘤；选择表达结合CADMl的抗体的杂交瘤；和从所述选择的杂交瘤回收所述结合CADMl的抗体。
30.制备抗-CADMl抗体的方法，所述方法包括步骤用CADMl肽免疫包含人类免疫球蛋白基因的转基因动物； 从所述转基因动物的B-细胞回收mRNA ； 将所述mRNA转化为cDNA ；在噬菌体中表达所述cDNA，从而由所述cDNA编码的抗-CADMl抗体被呈递在所述噬菌体的表面上；选择呈递抗-CADMl抗体的噬菌体；从所述选择的噬菌体回收编码所述抗-CADMl免疫球蛋白的核酸分子；在宿主细胞中表达所述回收的核酸分子；和从所述宿主细胞中回收结合CADMl的抗体。
31.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合具有SEQIDNO :43或44的氨基酸序列的多肽上的表位，所述表位被含有包含SEQ IDNO :19,20或21所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID而22，23或对所示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体所识别。
32.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合具有SEQIDNO :43或44的氨基酸序列的多肽上的表位，所述表位被包含图1-3中所定义的CDR的抗体所识别，包括与这些CDR 被置于的框架无关而保持原始序列与人CADMl的结合的90%的DNA和氨基酸变化。
全文摘要
本公开提供了分离的单克隆抗体、特别是人单克隆抗体、更特别地是引起对于Fc受体的增加的结合和/或对于ADCC的增加的效力的工程化抗体或者免疫缀合物，所述抗体或免疫缀合物以高亲和力特异性结合CADM1。还提供了编码CADM1抗体的核酸分子、用于表达CADM1抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含所述CADM1抗体的双特异性分子和药物组合物。公开了用于检测CADM1的方法，以及用于治疗各种癌症、包括肺癌和胰腺癌的方法。
文档编号C07K16/28GK102341412SQ201080010338
公开日2012年2月1日 申请日期2010年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者B·陈, C·劳-奈克, C·潘, E·麦道, H·勒布兰克, H·黄, J·A·特雷特 申请人:梅达莱克斯公司, 牛津生物疗法有限公司