专利名称：人源化k33n单克隆抗体的生成、表达和表征的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫特异性识别人α 9整联蛋白的人源化抗体及其对与α 9整联蛋白有关或牵涉α 9整联蛋白的各种疾病或病症(包括癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、由α 9 整联蛋白诱发的疾病状况、等等)的治疗和诊断用途。
2.
背景技术：
由一组称作整联蛋白的细胞表面受体介导，细胞粘附于胞外基质(下文缩写为 ECM)。整联蛋白通过形成α和β链的1 1异二聚体来执行其功能。迄今为止，已经鉴定并确认至少18类α链、8类β链和对类α β异二聚体。已知每种整联蛋白识别一种特定的配体。整联蛋白根据其配体特异性或功能而分类入亚家族中，并分成胶原受体、层粘连蛋白受体、识别存在于纤连蛋白、玻连蛋白、等中的Arg-Gly-Asp (RGD)序列的RGD受体、和仅存在于白细胞中的白细胞特异性受体(Hynes, R. 0.，2002，Integrins bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110 :673-87 ；Miyasaka, Μ. ,2000, New edition of Adhesion Molecule Handbook，Shujunsya)。α 4和α 9整联蛋白是不属于任何这些类型并称作α 4整联蛋白亚家族的亚家族的成员(Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg，Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D.,1993, Sequence and Tissue Distribution of the Integrin α 9 Subunit, a Novel Partner of β 1 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology, 123 :1289-97)。同时，迄今为止， 过去认为ECM仅充当细胞间的粘合物质。现在已经变得清楚的是，整联蛋白介导的ECM-细胞相互作用显著牵涉调节细胞的生长、粘附、运动、等，而且与疾病的发作(包括癌症的进展、炎症的恶化、等)有关。例如，作为ECM之一的骨桥蛋白(下文缩写为0ΡΝ)是一种具有约41kDa分子量的分泌性、酸性磷酸化糖蛋白，而且是一种在母乳、尿液、肾小管、破骨细胞、成骨细胞、巨噬细胞、激活的T细胞、肿瘤组织、等等中广泛观察到其表达的分子。OPN具有粘附序列，即在其分子中央的GRGDS(SEQ IDNO :1)、在人OPN中的SWYGLR(SEQ ID NO 2)序列或小鼠OPN中的SLAYGLR(SEQ ID NO 3)序列，和与其极其接近的凝血酶切割位点，并经由GRGDS (SEQ ID NO 1)序列结合RGD整联蛋白或经由SVVYGLR (SEQ IDNO 2)序列或SLAYGLR (SEQ ID NO 3)序列结合α4(α4β 1)禾口 α9(α9β 1)整联蛋白。WO 02/081522披露了使用OPN敲除小鼠或针对OPN的中和性抗体通过抑制OPN功能实现的对类风湿性关节炎或肝炎的治疗效果。此外，此公开文本披露了 SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序列由于识别α9和α 4整联蛋白而对于炎性疾病的发病机制是至关重要的，并且 OPN的受体在免疫活性细胞等等中表达且与炎性疾病有关。已经找到了结合谱的差异，其在于α 4β 1既结合未经凝血酶切割的0ΡΝ(未切割的0ΡΝ)又结合经凝血酶切割的OPN (经切割的0ΡΝ)的N端片段，而α 9 β 1仅结合经切割的OPN(Y. Yokosaki等，(1999)The Journal of Biological Chemistry, 274 :36328-36334 ； P. Μ. Green 等，O001)raBS Letters, 503 :75-79 ；S. Τ. Barry 等，OOOO) Experimental CellResearch, 258 :342-351)。除了 OPN以外，α4和α9整联蛋白共享许多共同配体。已知的配体有纤连蛋白的EDA域、前肽-von Willebrand因子(pp-vWF)、组织转谷氨酰胺酶(tTG)、血液凝固因子XIII、血管细胞粘附分子-I(VCAM-I)等。另外，已知纤连蛋白的CS-I域、 MadCAM-I (α 4β 7)、等为受到α 4整联蛋白特异性识别的配体。已知生腱蛋白-C、纤溶酶、 等为受到α9整联蛋白特异性识别的配体。整联蛋白亚基α 9、α 4和β 1的氨基酸序列是众所周知的。例如，在GenBank，人 α 9 登记为 NM_002207，小鼠 α 9 为 NM_133721，人 α 4 为 NM_000885，小鼠 α 4 为 NM_010576， 人β 1为Χ07979，而小鼠β 1为ΝΜ_010578。还已知这些整联蛋白在氨基酸序列方面在物种间具有高度相似性。3.发明概述虽然目前已知许多用于治疗癌症、炎性疾病和自身免疫性疾病的药物，但是期望开发出对癌症、炎性疾病和自身免疫性疾病具有更为改善的治疗效果的预防和/或治疗剂等。本发明部分基于本发明人的发现，即针对α9整联蛋白的特异性抑制性抗体具有抑癌和消炎效果。先前，本发明人分离出免疫特异性识别人α 9整联蛋白并由杂交瘤克隆Κ33Ν(保藏登录号FERM ΒΡ-10830)生成的小鼠单克隆抗体。在本文中，该杂交瘤克隆名称与由该克隆生成的单克隆抗体的名称可互换使用。小鼠抗人α 9整联蛋白抗体是IgGl同种型的。该单克隆抗体抑制人和/或小鼠α 9整联蛋白与α 9整联蛋白的配体，诸如骨桥蛋白之间的结合。如此，该抗α 9整联蛋白抗体抑制α 9整联蛋白的功能，而且对癌症，例如癌细胞的生长或转移，和对炎性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩(Crohn)氏病)、自身免疫性疾病、由α 9整联蛋白诱发的疾病状况、等等展现出治疗效果。此外，本发明的抗α 9整联蛋白抗体可以作为体内诊断剂用于检测受试者中的 α 9整联蛋白表达的存在和水平，由此诊断牵涉α 9整联蛋白的病症或疾病。然而，因为该单克隆抗体是小鼠起源的，其在人中的免疫原性所致的可能的不利影响已经阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗用途。为了降低免疫原性，本发明人已经制备了人源化抗体，其具有与衍生所述人源化抗体的初始小鼠抗α 9整联蛋白抗体展现的生物学活性对应的生物学活性。因而，本发明提供了免疫特异性识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含部分自非人起源衍生和部分自人起源衍生的抗原结合区。在一个具体的实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含自非人来源(供体)，诸如Κ33Ν 单克隆抗体衍生的互补决定区(CDR)和自人来源(接受体)衍生的框架区(FR)。在一个实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合片段抑制人α9整联蛋白与人α9整联蛋白的配体之间的结合。在一个具体的实施方案中，所述免疫特异性识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗体结合片段包含(i)重链(H链)，其包含至少一种自人H链的可变区(V区)衍生的 H链FR(FRH)和至少一种自免疫特异性识别人α 9整联蛋白的非人抗体K33N的至少一种 ⑶RH衍生的H链互补决定区(⑶RH)；或(ii)轻链(L链)，其包含至少一种自人L链的V区衍生的L链FR(FRL)和至少一种自免疫特异性识别人α 9整联蛋白的非人抗体K33N的至少一种⑶RL衍生的L链互补决定区(⑶RL)；或上文的(i)和(ii)两者。例如，所述非人抗体(其衍生本发明的人源化抗体的至少一种CDRH和/或至少一种CDRL)是由登录号 FERMBP-10830的杂交瘤生成的单克隆抗体。在一个优选的具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含(i) 至少一种自人FRH衍生的FRH和至少一种包含选自氨基酸序列SEQID NO :4、5和6的氨基酸序列的CDRH ；或(ii)至少一种自人FRL衍生的FRL和至少一种包含选自氨基酸序列SEQ ID N0:ll、12和13的氨基酸序列的CDRL ；或(iii)上文的⑴和(ii)两者。本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ IDN0:4、5和6。在备选中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含⑶RL1、 ⑶RL2和⑶RL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :11、12和13。在一个优选的实施方案中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2和 CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO :4、5、6、11、12和13。在另一个备选中，本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含自由GenBank登录号DA980102 (SEQ ID NO 18) 编码的人H链的可变区衍生的FRH，或自由GenBank登录号X7M41 (SEQ ID NO 23)编码的人κ-L链的可变区衍生的FRL。在一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体的FRH包含至少一种选自氨基酸序列SEQID NO 19、20、21和22 (分别由DA980102的相应部分编码的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明的人源化抗体的FRL包含至少一种选自氨基酸序列SEQ ID NO :M、25J6和27 (分别由X7M41的相应部分编码的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含(i) H链可变区(VH区)，其包含氨基酸序列 SEQ ID N0:29;或(ii)L链可变区(VL区)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 31 ；或(iii)上文的(i)和(ii)两者。在一个最优选的实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含(i) Y-IH链，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 37 ；或(ii) κ L链，其包含氨基酸序列 SEQID NO 39 ；或(iii)上文的⑴和(ii)两者。本发明进一步提供了一种分离的核酸分子，其包含编码免疫特异性识别人α 9整联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。具体地，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码包含至少一种选自SEQID NO :4、5和6的氨基酸序列的人源化 H链，或包含至少一种选自SEQ IDNO 11、12和13的氨基酸序列的人源化L链，或所述人源化H链和所述人源化L链两者的核苷酸序列。在一个优选的具体实施方案中，此类分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO :28(其编码VH区)或编码氨基酸序列SEQ IDNO 29 的核苷酸序列。在另一个优选的具体实施方案中，此类分离的核酸分子包含核苷酸SEQ ID NO 30 (其编码VL区)或编码氨基酸序列SEQ ID NO 31的核苷酸序列。在又一个优选的具体实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO 和30两者。在一个优选的具体实施方案中，此类分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO :36(其编码 Y-IH链)或编码氨基酸序列SEQ ID NO :37的核苷酸序列。在另一个优选的具体实施方案中，此类分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO :38(其编码kL链)或编码氨基酸序列SEQ ID NO :39的核苷酸序列。在又一个优选的具体实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID N0:36和38两者。在又一个优选的具体实施方案中，本发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体起源(诸如分别为氨基酸序列SEQ ID N0:10和17) 或异源起源的信号肽的核苷酸序列。本发明进一步提供了一种载体，例如表达载体，其包含编码免疫特异性识别人α 9 整联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的H链或L链或二者的核苷酸序列。在此类载体中，本发明的核苷酸序列可以与一种或多种调节元件可操作连接。本发明的核苷酸序列可以包括编码对于衍生CDR的非人供体抗体而言天然的信号肽或异源起源的信号肽的核苷酸序列。此外，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子，包括包含本发明的核酸分子的载体。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的宿主细胞，其包含编码本发明的人源化H链的第一核酸分子和编码本发明的人源化L链的第二核酸分子，所述第一和第二核酸分子各自以使得本发明的生物学功能性人源化抗体或其抗原结合片段表达的方式与调节元件可操作连接。因而，本发明进一步提供了一种用于制备本发明的人源化抗体的方法，包括在使得该人源化抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并收集所生成的人源化抗体。本发明进一步提供了包含至少一种本发明的人源化抗体的组合物。另外，本发明提供了一种用于预防或治疗与α9整联蛋白有关的病症或疾病的药物组合物，其包含至少一种本发明的人源化抗体和药学可接受载体。任一种所述组合物可以进一步包含另一种活性化合物，其能附加地或协同地改善该病症或疾病。此类活性化合物包括(但不作为限制) 消炎化合物、化学治疗化合物、等等，以及抗体或其抗原结合片段，诸如能免疫特异性结合人α 4整联蛋白的抗体。在另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗与α 9整联蛋白有关或牵涉α 9 整联蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的至少一种本发明的人源化抗体。对于此类用途，本发明的人源化抗体可以与增强该人源化抗体的生物学效果的治疗模块缀合。此类治疗模块的例子包括另一种抗体，诸如抗α 4 抗体(例如以形成双特异性抗体)、抑制细胞性或杀细胞性细胞毒素、放射性元素、和/或其它治疗剂，包括消炎剂、抗生素、等等。在又一发面，本发明提供了一种用于在受试者中诊断与α 9整联蛋白有关或牵涉 α 9整联蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括对要检查的受试者施用诊断有效量的本发明的人源化抗体。对于此类诊断用途，可以用可检测标志物，诸如放射性元素标记本发明的人源化抗体。3. 1 定义如本文中所使用的，术语“抗体”指能够免疫特异性结合期望的抗原，诸如α 9整联蛋白的抗体分子，而且涵盖完整的抗体分子或其片段，包括抗原结合片段。本文中所使用的术语“免疫特异性识别”指抗体或其抗原结合片段特异性结合靶多肽或蛋白质，特别是人α 9整联蛋白的能力。此类抗体并不非特异性结合其它多肽或蛋白质。然而，免疫特异性结合靶多肽或蛋白质(例如人α9整联蛋白)的抗体或其抗原结合片段可以与其它抗原起交叉反应。例如，免疫特异性识别人α9整联蛋白的本发明的人源化抗体或抗原结合片段可以与例如其它物种的α9整联蛋白起交叉反应。优选地，免疫特异性结合人α 9整联蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原起交叉反应。
本文中所使用的术语“抗原结合片段”指保留免疫特异性结合靶多肽或蛋白质，特别是人α 9整联蛋白和/或非人α9整联蛋白的能力的任何抗体片段，而且包括单链抗体、 Fab片段、F(ab' )2片段、二硫化物连接的Fv、和含有特异性结合靶多肽或蛋白质的轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)或甚至互补决定区(CDR)的片段。如此，人源化抗体的此类抗原结合片段可以包含或不包含部分或全长人恒定区。用于获得上文所描述的抗体片段的各种方法是本领域中公知的。本文中所使用的术语“自人来源衍生的”或“自非人来源衍生的”指自人抗体或非人抗体的相应部分衍生其氨基酸序列的抗体部分。本文中所使用的术语“接受体序列”指充当来自供体抗体(其通常是非人抗体)的 CDR的接受体的，来自人抗体VH或VL区的框架区的核苷酸序列或氨基酸序列。4.附图简述
图1显示了实验结果，其中用人α-9整联蛋白表达细胞(人黑素瘤细胞G361)和 OPNa-9整联蛋白结合位点肽(SVVYGLR)测量抗人α _9整联蛋白抗体(即本发明的两种克隆(即Κ33Ν和Μ35Α)、五种其它克隆(1K11、21C5、24I11、25B6、和28S1)、和Υ9Α2)的细胞粘附抑制活性。使用针对人骨桥蛋白的单克隆抗体(5A1)作为阴性对照。图2显示了实验结果，其中用人α-9整联蛋白表达细胞(人黑素瘤细胞G361)和生腱蛋白C片段的α-9整联蛋白结合位点肽测量抗人α-9整联蛋白抗体(即本发明的两种克隆(即Κ33Ν和Μ35Α)、五种其它克隆(1K11、21C5、24I11、25B6、和28S1)、和Υ9Α2)的细胞粘附抑制活性。使用针对人骨桥蛋白的单克隆抗体(5A1)作为阴性对照。图3显示了小鼠K33N VH cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)及推导的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列(SEQID NO=IO)为斜体。 成熟VH的N端氨基酸残基(Q)加双下划线。依照Kabat等(kquences of Proteins of Immunological Interests,第五版,NIH出版No. 91-3242,U. S. Department of Health and Human Services, 1991)定义的⑶R序列加下划线。图4显示了小鼠K33N VL cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)及推导的氨基酸序列(SEQ ID N0:15)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列(SEQ ID N0 17)为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基⑶加双下划线。依照Kabat等(1991)定义的CDR序列加下划线。图5显示了侧翼有SpeI和HindIII位点(加下划线)的设计K33N VH(ChK33N VH) 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)及推导的氨基酸序列(SEQID NO 8)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列(SEQ ID N0 10)为斜体。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)加双下划线。依照Kabat等(1991)定义的CDR序列加下划线。内含子序列为斜体。图6显示了侧翼有NheI和EcoRI位点(加下划线)的设计K33N VL(ChK33N VL) 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)及推导的氨基酸序列(SEQID Ν0:Μ)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列(SEQ ID N0 17)为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)加双下划线。依照Kabat等(1991)定义的CDR序列加下划线。内含子序列为斜体。图7显示了 pChK33N和pHuK33N(集体为表达载体)的示意结构。从顶部的Mil 位点顺时针方向前进，该质粒含有重链转录单元，其始自人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV启动子)以启动抗体重链基因的转录。CMV启动子后面有VH外显子、含有人Y-I重链恒定区(包括CH1、铰链、CH2和CH3外显子及居间内含子)的基因组序列、和CH3后面供mRNA加工用的Y-I基因多聚腺苷酸化位点。重链基因序列后面，轻链转录单元始自CMV启动子，后面有VL外显子和含有人κ链恒定区外显子(CL)及其前面的内含子一部分的基因组序列、和κ基因的polyA信号。然后，轻链基因后面有SV40早期启动子(SV40启动子)、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)、和含有SV40多聚腺苷酸化位点的区段(SV40 poly(A)位点)。最后，该质粒含有质粒pUC19—部分，其包含细菌复制起点(PUC ori)和β -内酰胺酶基因(β -内酰胺酶)。图 8 显示了 Κ33Ν VH(SEQ ID NO 9)、人源化 K33N(HuK33N) VH(SEQID NO :29)和自由GenBank登录号DA980102的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的人接受体序列的 FRHl(SEQ ID NO 19)、FRH2(SEQ ID NO :20)、FRH3(SEQ ID NO :21)禾口FRH4(SEQ ID NO :22) 的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的数字标示依照Kabat等 (1991)的位置。由Kabat等(1991)限定的CDR序列加下划线。加双下划线的残基预测为与⑶R接触，而且小鼠残基在人源化形式中的这些位置处得到保留。将DA980102中的第82 位处的Met (加下划线)(其在人VH序列中的此位置处是非典型的)用典型的残基Leu替换以降低潜在的免疫原性。图中省略DA980102中的⑶R残基。图 9 显示了 K33N VL(SEQ ID NO :16)、人源化 K33N(HuK33N)VL(SEQID NO :31) 和自由GenBank登录号X7M41的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的人接受体序列的 FRLl (SEQ ID NO :24)、FRL2 (SEQ ID NO :25)、FRL3 (SEQ ID NO :26)和 FRL4 (SEQ ID NO :27) 的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的数字标示依照Kabat等 (1991)的位置。由Kabat等(1991)限定的CDR序列加下划线。加双下划线的残基预测为与⑶R接触，而且小鼠残基在人源化形式中的这些位置处得到保留。图中省略X7M41中的 CDR残基。图10显示了用于构建HuK33N VH基因的寡核苷酸。图11显示了用于构建HuK33N VL基因的寡核苷酸。图12显示了用于构建HuK33N VH基因的寡核苷酸。箭表示每种寡核苷酸的位置和取向(5’至3’)。VH区(SEQ ID NO 29)的氨基酸残基以单字母代码显示。图13显示了用于构建HuK33N VL基因的寡核苷酸。箭表示每种寡核苷酸的位置和取向(5’至3’)。VL区(SEQ ID NO 31)的氨基酸残基以单字母代码显示。图14显示了侧翼有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuK33N VH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 34)及信号肽(SEQ ID NO 58 ；以斜体显示)和VH区(SEQ ID NO 29) 的推导的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VH的N 端氨基酸残基(Q)加双下划线。依照Kabat等(1991)定义的CDR序列加下划线。内含子序列为斜体。图15显示了侧翼有NheI和EcoRI位点(加下划线)的HuK33N VL基因的核苷酸序歹丨J (SEQ ID NO 35)及信号肽(SEQ ID NO 59 ；以斜体显示)和VL区(SEQ ID NO 31)的推导的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟VL的N端氨基酸残基(D)加双下划线。依照Kabat等(1991)定义的CDR序列加下划线。内含子序列为斜体。图16显示了嵌合的与人源化的K33N抗体对人α 9整联蛋白的亲和力的比较。通过细胞ELISA检查1和0. 5 μ g/ml嵌合的和人源化的K33N对CHO/ α 9细胞的结合。一式三份实施实验。图中显示了均值吸光度值及SEM。图17显示了用于HuK33N重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸的序列 (SEQ ID NO 44-50)。图18显示了 pHuK33N中的HuK33N γ _1重链编码区的核苷酸序列(SEQID NO 36) 及推导的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:37)。氨基酸残基以单字母代码显示。终止密码子以“·” 表不。图19显示了 pHuK33N中的HuK33Nk轻链编码区的核苷酸序列(SEQ IDNO 38)及推导的氨基酸序列(SEQ ID N0:39)。氨基酸残基以单字母代码显示。终止密码子以“ ·，， 表不。图20显示了对纯化的抗体的SDS-PAGE分析的结果。依照Sambrook等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)在还原条件下在存在SDS的情况中在10%聚丙烯酰胺凝胶上运行6 μ g嵌合的和人源化的IgGl/ κ抗体(分别为ChK33N和HuK33N)。使用宽范围蛋白质标志物(MW;New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ)作为大小标志物。右侧显示的数字表示按千道尔顿(kDa)计的标志物大小。图21显示了对小鼠K33N抗体对人α 9整联蛋白的结合的FACS分析的结果。在多个浓度(以1. 67 μ g/ml开始且连续3倍稀释)对小鼠K33N抗体测试对CH0/hu α 9细胞的结合。在图中在测试的每个抗体浓度(X轴)为几何平均通道荧光数值(MCF;Y轴)绘图。 使用 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)来计算 EC50I^o图22显示了对嵌合的和人源化的K33N抗体对人α 9整联蛋白的结合的FACS分析的结果。在多个浓度(以5 μ g/ml开始且连续3倍稀释)对每种抗体测试对CHO/hu α 9 细胞的结合。在图中在测试的每个抗体浓度(X轴)为几何平均通道荧光数值(MCF;Y轴) 绘图。使用 GraphPad Pr ism (GraphPad Software, San Diego, CA)来计算 EC5tl 值。图23显示了针对人α 9整联蛋白的小鼠的、嵌合的和人源化的Κ33Ν抗体和小鼠抗人α 9整联蛋白抗体Υ9Α2的剂量响应细胞粘附抑制率。在5、1、0. 2、0. 04、0. 008和 0. 0016 μ g/mL的浓度对每种抗体测试对人α 9整联蛋白表达细胞系G-361的细胞粘附。一式四份实施实验。图中显示了均值抑制率值。5.发明详述5.1.针对人α 9整联蛋白的抗体的制备可通过本领域中已知的任何合适的方法来生成免疫特异性识别人α 9整联蛋白或其任何表位的抗体。在本发明中作为抗原使用的α 9整联蛋白可以是⑴自表达α 9整联蛋白的所有来自人的细胞，或其中存在这些细胞的所有组织衍生的蛋白质，( 重组蛋白，其中将编码 α 9整联蛋白的基因DNA，优选地cDNA转染入细菌、酵母、细胞系(包括动物细胞)、等中，并表达，或⑶合成的蛋白质。α 9整联蛋白包括包含与人α 9整联蛋白的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:55，其中残基 1-29是信号肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。在本文中，术语“包含基本上相同的氨基酸序列的多肽”指包含如下氨基酸序列的变体多肽，其中多个氨基酸，优选地1至10个氨基酸且更优选地1至几个(例如1至5个) 氨基酸被替代、删除和/或修饰，只要这些变体多肽与天然存在的人α 9整联蛋白具有基本上等同的生物学特性；和包含如下氨基酸序列的变体多肽，其中多个氨基酸，优选地1至10 个氨基酸且更优选地1至几个(例如1至5个)氨基酸被添加至天然存在的人α 9整联蛋白的氨基酸序列。此外，变体多肽可以是那些具有这些氨基酸替代、删除、修饰和添加中多处的。在基因重组技术外，可以通过本领域中公知的方法，诸如化学合成法、细胞培养法、等，或其修改方案来生成在本发明中作为抗原的人α 9整联蛋白。用于生成变体多肽的方法的例子包括合成寡核苷酸定点诱变(缺口双链体法)、 牵涉通过用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理来随机引入点突变的点诱变法、牵涉用Bal31酶或其它酶制备缺失突变体的方法、盒式诱变、接头扫描法、误掺入法(miss incorporation method)、错配引物法、DNA区段合成法、等等。要在本发明中作为抗原使用的人α 9整联蛋白还包括所述α 9整联蛋白一“部分”。如本文中所使用的，“部分”指包含结合0 9整联蛋白配体，例如0 1￥0六11-1、生腱蛋白 C、等所需要的区域的部分；具体地，成熟人α 9整联蛋白(SEQ ID NO 55的第30-第1035 氨基酸残基)中包含第14-第980氨基酸残基的部分，和包含第11-第981氨基酸残基的部分。所述α 9整联蛋白一“部分”可以依照下文所描述的本领域中已知的方法或其修改方案通过基因重组或化学合成来生成，或者可以通过用蛋白水解酶等等适当消化通过细胞培养法分离的人α9整联蛋白来生成。在细胞膜上过表达α 9整联蛋白的细胞本身或其膜级分也可以作为抗原使用。可以通过本领域中公知的重组DNA技术来制备过表达人α 9整联蛋白的细胞。使用如上文所描述的那样制备的合适的抗原，可以通过本领域中公知的多种方法来制备对人α9整联蛋白或其任何表位特异性的抗体。针对人α9整联蛋白的多克隆抗体可以通过本领域中公知的多种规程来生成。例如，可以对多种宿主动物(包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、等)施用感兴趣的抗原，以诱导含有对抗原特异性的多克隆抗体的抗血清生成。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来提高免疫学应答，并且包括但不限于弗 (Freund)氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷月旨、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔i威血蓝蛋白、二硝基苯酚、和对人潜在有用的佐剂诸如BCG (卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。此类佐剂也是本领域中公知的。可以使用本领域中已知的极其多种技术(包括使用杂交瘤、重组体、和噬菌体展示技术，或其组合)来制备单克隆抗体。例如，可以使用杂交瘤技术来生成单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括那些在本领域中已知的和在例如Harlow等，Antibodies =A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988) ；Hammerling 等，于 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,第 563 页-第 681 页(Elsevier,N. Y., 1981)(通过提及而完整收录这两者)中教导的。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”不限于经由杂交瘤技术生成的抗体。术语“单克隆抗体”指自单克隆，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆衍生的抗体，而非生成其的方法。使用杂交瘤技术来生成和筛选特异性抗体的方法是本领域中公知的且常规的。在一个非限制性例子中，可以用感兴趣的抗原或表达此类抗原的细胞来免疫小鼠。一旦检测出免疫应答，例如在小鼠血清中检测出对抗原特异性的抗体，收获小鼠脾，并分离脾细胞。然后，通过公知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如P3Ul、P3X63-Ag8、 P3X63-Ag8-UU P3NS1-Ag4, SP2/0_Agl4、P3X63-Ag8-653 等)融合。选择杂交瘤，并通过有限稀释将其克隆。然后，通过本领域中已知的方法对杂交瘤克隆测定分泌能够结合抗原的抗体的细胞。可以通过给小鼠腹膜内接种阳性杂交瘤克隆来生成腹水，其一般含有高水平的抗体。可以通过已知的技术来生成识别特定表位的抗体片段。例如，可以通过使用诸如木瓜蛋白酶(以生成Fab片段)或胃蛋白酶(以生成F(ab’)2片段)等酶来蛋白水解切割免疫球蛋白分子，从而生成Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有完整的轻链和重链的可变区、CHl区和铰链区。本发明的抗体或其抗原结合片段也可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法，特别是通过化学合成或者优选地，通过重组表达技术来生成。编码抗体的核苷酸序列可以自本领域技术人员可得的任何信息(即自Genbank、 文献、或者通过常规的克隆和序列分析)获得。若不可获得含有编码特定抗体或其表位结合片段的核酸的克隆，但是抗体分子或其表位结合片段的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成或者使用与序列的3’和5’端可杂交的合成引物通过PCR扩增或者使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针以鉴定例如来自cDNA文库的编码抗体的cDNA 克隆通过克隆自合适的来源(例如抗体cDNA文库、或自表达抗体的任何组织或细胞诸如选择为表达抗体的杂交瘤细胞生成的cDNA文库、或自表达抗体的任何组织或细胞分离的核酸，优选地polyA+RNA)获得。然后，可以使用本领域中公知的任何方法来将通过PCR生成的扩增核酸克隆入可复制克隆载体中。5. 2.重组抗体的制备—旦确定抗体的核苷酸序列，便可以使用本领域中公知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR、等(参见例如Sambrook等，见上文；及Ausubel等 IS, 1998,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，NY 巾Micii^白勺技术，通过提及而将这两篇文献完整收入本文)来操作抗体的核苷酸序列，以通过例如将氨基酸替代、删除、和/或插入引入抗体的表位结合域区或抗体中可以提高或降低抗体的生物学活性的任何部分中来生成具有不同氨基酸序列的抗体。抗体的重组表达需要构建含有编码抗体的核苷酸序列的表达载体。一旦获得了编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分的核苷酸序列，便可以使用本领域中公知的技术通过重组DNA技术来生成供生成抗体分子用的载体，如先前的小节中所讨论的。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。可以将编码抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和轻链可变区两者、重链和/或轻链可变区的表位结合片段、或一个或多个互补决定区(CDR)的核苷酸序列克隆入此类载体中进行表达。可以将此类序列与编码对于初始抗体而言天然的信号肽或异源信号肽的多核苷酸融合。然后，可以将如此制备的表达载体导入合适的宿主细胞中以表达抗体。因而，本发明包括含有编码免疫特异性识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的宿主细胞。
可以用本发明的两种表达载体(第一种载体编码重链衍生的多肽，而第二种载体编码轻链衍生的多肽)共转染宿主细胞。两种载体可以含有相同的选择标志(其使重链和轻链多肽能够相等表达)或不同的选择标志以确保维持这两种质粒。或者，可以使用单一载体，其编码并能够表达重链和轻链多肽两者。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。在另一个实施方案中，也可以使用本领域中已知的多种噬菌体展示法来生成抗体。在噬菌体展示法中，功能性抗体域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上展示。在一个特别的实施方案中，可以利用此类噬菌体来展示自全集或组合抗体文库(例如人的或鼠的)表达的抗原结合域，诸如Fab和Fv或二硫键稳定化的Fv。可以用抗原，例如使用经标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原来选择或鉴定表达结合感兴趣抗原的抗原结合域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体， 包括fd和M13。抗原结合域作为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白的重组融合蛋白表达。可以用于生成本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示法的例子包括那些披露于 Brinkman 等，J. Immunol. Methods, 182 :41-50,1995 ；Ames 等，J. Immunol. Methods, 184 177-186,1995 ；Kettleborough 等，Eur. J. Immunol. ,24 :952-958,1994 ；Persic 等，Gene, 187 :9-18,1997 ；Burton等，Advances in Immunology, 57 :191-280，1994 ；PCT 申请No. PCT/ GB91/01134 ;PCT 公开文本 WO 90/02809 ；WO 91/10737 ；WO 92/01047 ；WO 92/18619 ；WO 93/11236 ；W095/15982 ；WO 95/20401 ；及美国专利 No. 5，698，426 ；5，223，409 ；5，403，484 ； 5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ； 5，780，225 ；5, 658，727 ；5, 733，743和5，969，108的；通过提及而将每篇完整收入本文。如上述参考文献中所记载的，噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区， 并使用其来生成完整抗体，包括人抗体，或任何其它期望的片段，并在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、和细菌)中表达，例如如下文更为详细地描述的。例如，也可以采用用于重组生成Fab、Fab'和F(ab’)2片段的技术，其使用本领域中已知的方法，诸如那些披露于PCT公开文本WO 92/22324 ；MulIinax等，BioTechniques, 12(6) :864-869,1992 ；及 Sawai 等，AJRI，34 :26-34,1995 ；及 Better 等，Science, 240 1041-1043，1988(通过提及而完整收录每篇)的方法进行。可以用于生成单链Fv和抗体的技术的例子包括那些记载于美国专利No. 4，946，778和5，258，498 ；Huston等，Methods in Enzymology,203 :46-88,1991 ；Shu 等，PNAS，90 :7995-7999,1993 ；及 Skerra 等，Science, 240 :1038-1040,1988 的。—旦通过上文所描述的任何方法生成了本发明的抗体分子，然后便可以通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过层析(例如离子交换、亲和、特别是在蛋白A或蛋白G纯化后通过对特定抗原的亲和、和筛分柱层析)、离心、差别溶解度、 或者通过任何其它用于纯化蛋白质的标准技术来将其纯化。此外，可以将本发明的抗体或其片段与本文中所描述的或者在其它情况中在本领域中已知的异源多肽序列融合以便于纯化。对于一些用途(包括抗体在人中的体内用途和体外检测测定法)，可以优选使用嵌合的、人源化的、或人的抗体。在下文5. 3 一节中详细讨论了嵌合抗体和人源化抗体。与其它化合物或异源多肽融合或缀合的抗体可以在体外免疫测定法中、在纯化法(例如亲和层析)中、及在体内治疗或诊断用途中使用。参见例如PCT公开文本 No. WO 93/21232 ；EP 439，095 ;Naramura 等，Immunol. Lett.，39 :91_99，1994 ；美国专利 5，474，981 ；Gillies 等，PNAS，89 :1428-1432,1992 ；及 Fell 等，J. Immunol.，146 M46-2452，1991，通过提及而将它们完整收入本文。例如，可以使用已知的方法或商品化试剂盒(例如生物素标记、FITC标记、APC标记)以多种方式来标记抗体。作为另一个例子， 可以将抗体与提高抗体的体内生物学效果的治疗模块缀合。此类治疗模块的例子包括另一种抗体、抑制细胞性或杀细胞性细胞毒素、放射性元素、和/或其它治疗剂，包括消炎剂、抗生素、等等。在本发明中，可以将人源化抗人α 9整联蛋白与另一种抗体，诸如抗α4抗体缀合(例如以形成双特异性抗体)。作为另一个例子，对于体内诊断用途，可以用可检测标志物，诸如放射性元素标记本发明的人源化抗体。5. 3.嵌合的和人源化的抗体嵌合抗体是一种自不同动物物种衍生抗体的不同部分的分子，诸如具有自鼠单克隆抗体衍生的可变区和自人免疫球蛋白衍生的恒定区的抗体。用于生成嵌合抗体的方法是本领域中已知的。参见例如 Morrison，kience，229 :1202,1985 ；Oi 等，BioiTechniques, 4 214，1986 ；Gillies 等，J. Immunol. Methods, 125 :191-202,1989 ；美国专利 No. 5，807，715 ； 4，816，567 ’及4，816，397，通过提及而将它们完整收入本文。人源化抗体是一种结合期望的抗原且包含含有一种或多种自非人物种衍生的互补决定区(CDR)和一种或多种自人免疫球蛋白分子衍生的框架区的可变区的分子。用于使非人抗体人源化的典型方法已经记载于多份参考文献，诸如如下那些Queen等，1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033 和美国专利 No. 5，585，089 和 5，693，762 ； Riechmann 等，Nature，332 :323，1988 ；及 Tsurushita 等，Methods 36 :69-83, 2005，通过提及而将它们都完整收入本文。例如，Tsurushita等Q005，见上文；下文称为“"Tsurushita”) 的参考文献提供了一种用于使小鼠单克隆抗体人源化的实用且指导性的方案，其基于最初由Queen等(1989，见上文)开发的抗体人源化方法。下文简要汇总了 Tsurushita中所披露的通用方案。5. 3. 1.用于制备人源化抗体的通用方案小鼠V基因的克隆和测序有多种方法可用于克隆编码目标小鼠单克隆抗体的VH和VL区的cDNA。例如， 通常使用5，RACE (cDNA末端快速扩增)法，其使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences,CA)或Genefcicer试剂盒(Invitrogen，CA)进行。可以基于目标单克隆抗体的H链和L链的同种型来制备用于5’ RACE的基因特异性引物，从而它可以刚好在H链和 L链之每种的可变区下游结合。如此，5’ RACE引物可以设计为对小鼠中的每种亚型，诸如 YU Y 2a, γ 2b或Y 3特异的。或者，可以基于亚型间共有的或高度同源的区域来设计所有亚型的共同引物。在Tsurushita中，下列5’ RACE引物作为例子被披露(i)5' -GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO :56)(用于克隆小鼠 y U Y 2a, y 2b 和Y3H链)(ii) 5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC- (SEQ ID NO :57)(用于克隆小鼠 κ 轻链)。可以例如使用kro Blunt T0P0 PCR克隆试剂盒(Invitrogen)来将PCR扩增的V 基因片段直接克隆入质粒载体中，并测定其DNA序列。获得的序列应当通过例如比较其编码氨基酸序列与使用例如241型蛋白质测序仪(Hewlett-Packard，CA)通过N端氨基酸测序测定的目标单克隆抗体的氨基酸序列来确认。通常，通过例如埃德曼(Edman)降解测定在目标抗体N端的至少15-20个氨基酸残基足以确认克隆DNA序列的真实性。Tsurushita 告诫，在谷氨酰胺(其是小鼠中两种最常见的N端氨基酸之一)是N端氨基酸时，其可能已经转变成焦谷氨酰胺并封闭N端的测序。在该情况中，有必要使N端去封闭以获得序列。V区的三维津樽基于VH和VL区的序列，首先通过例如由R.Levy等，1989，Biochemistry 28: 7168-7175 ；及 B. Zilber 等，1990，Biochemistry 29 :10032-10041 记载的方法来鉴定靴抗体中对于维持⑶R的构象结构潜在重要的框架残基。通常，将VH和VL区之每种分成 14个结构上有意义的区段，其是构成免疫球蛋白超家族域结构的β链和环样结构。将来自目标抗体的每个区段的氨基酸序列与PDB数据库(参见H. Μ. Berman等，2000，Nucleic Acids Res. 28 :235-342)中的已知结构的抗体的相应区段比对。通过多序列比对，选择与每个靶区段具有最高序列同源性的相应区段，并构建V区的三维模型。为了优化结构，将模型进行多轮共轭梯度能量最小化(例如使用ENCAD，或者如由Press等，1990，于 "Numerical Recipes，，，Cambridge University Press, Cambridge 中所记载的；Weiner 等， 1981，J. Comp. Chem. 2 :287-303 的 AMBER ；由英国癌症研究中心(Cancer Research UK)运行的BioMolecularModelling或“B匪”网站上可获得的3D-JIG-SAW ；或在由瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva)运行的 ExPASy 蛋白质组学服务器网站上可获得的SWISS-MODEL进行)。人框架的选择与对V区结构建模并行，将自小鼠VH和VL区的cDNA克隆推导的氨基酸序列分别与数据库，例如 Kabat 数据库(参见 Johnson 等，2000，Nucleic Acids Res. 28 :214-218.)、 GenBank、等等中的人V区序列比较。可以使用例如Smith-Waterman算法(Gusfield，1997， 于“Algorithms on Strings, Trees, and Sequences，，，Cambridge University Press, Cambridge)、或 BLAST (Karlin 等，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268)、等等来搜索与小鼠序列具有至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、 至少约90%、或至少95%同一性的总体序列同一性的人框架区。这些人序列可以根据基于cDNA的和蛋白质衍生的序列；然而，种系的使用常常是优选的，因为它可以用于消除与基于cDNA的、蛋白质衍生的序列中的体细胞高度突变有关的潜在免疫原性。在备选中，如 Queen等(1989，见上文)中所记载的，共有框架序列的使用也可以在自基于cDNA的或蛋白质衍生的序列获得的框架中鉴定并清除此类高度突变残基。在使用种系VH区段作为接受体框架的情况中，应当使用染色体14，而非15和16上编码的VH区段，因为只有染色体14 上的那些生成功能性VH区。人源化V区的设计依照Queen等(1989，见上文)，有必要鉴定距⑶R约4_6埃内的框架氨基酸，因为认为这些残基是支持正确CDR结构的潜在的关键框架残基。此类方法可以使用计算机程序，诸如由国家科学基金会(National Science Foundation, NSF)支持的分子可视化免费软件(Molecular Visualization Freeware)网站上可获得的RASMOL(其通过原子坐标或者经由计算机模型的手工检查来计算原子间距离)来实现。若关键框架位置处的氨基酸在小鼠供体和人接受体序列之间不同，则通常用小鼠供体的那些替换人残基。然后，若此类残基对支持CDR结构具有最小的贡献，则通常使用相应的人残基。还有，若选定的人接受体含有“非典型的”氨基酸(其在小于约10-20%的V区序列中发生)，则它们可以是亲和力成熟过程中体细胞高度突变的结果，而且应当用供体残基替换以避免在人中的潜在免疫原性。另外，在设计人源化V区时需要仔细考虑其它因素，诸如潜在的N连接的糖基化信号的残基(关于详情，参见Tsurushita)。根据治疗用途需要的或要消除的效应器功能，人源化抗体可以含有来自人抗体的人κ或λ轻链、和/或γ 1、γ 2、γ 3、γ 4、μ、α 1、α 2、δ、或ε重链、或其变体的人恒定区或其部分。例如，可以将含有突变的恒定区的Fc部分与本发明的嵌合的或人源化的抗体的可变区融合，从而降低抗体对Fc受体的结合和/或降低其固定补体的能力(参见例如 Winter 等，GB 2，209，757B ;Morrison 等，WO 89/07142 ;Morgan 等，WO 94/29351)。可以通过重组DNA技术来实施对抗体分子的此类操作，如5. 2 一节中所描述的。优选地，所得的嵌合或人源化抗体具有与非人供体抗体相同的特异性和与非人供体抗体的亲和力相似或非人供体抗体的亲和力的至少约1/3、至少约1/2、或至少约2/3 的亲和力。在另一方面，所得的嵌合或人源化抗体具有至少约lxlOl1、优选地至少约 lxlOl1、且最优选地至少约ΙχΚΛΓ1的亲和常数。在上文所描述的通用方案外，可以使用本领域中已知的多种技术来使抗体人源化，所述技术包括例如⑶R嫁接(EP 239,400 ;PCT公开文本W091/09967 ；美国专利 No. 5，225, 539 ；5，530，101 和 5，585，089)、镶饰(veneering)或重修表面(resurfacing) (EP 592, 106 ；EP 519, 596 ；Padlan, Molecular Immunology,28(4/5) :489-498,1991 ； Studnicka 等，Protein Engineering, 7 (6) :805-814,1994 ;Roguska 等，Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91 =969-973,1994)、和链改组(美国专利No. 5，565，332)，在此通过提及而将它们都完整收录。5. 3. 2.将人源化抗体制备为药物的其它考虑因素为了作为药物来供应人源化抗体，需要制备有效且一致的其生产系统。例如，通过插入H和L链序列来制备适合于人源化抗体的表达载体，并可以获得经表达载体转染的高生产率细胞系作为主细胞库(MCB)的种子细胞，其充当工作细胞库(WCB)的稳定且半永久来源。然后，可以通过培养来自WCB的工作细胞，并收集培养液来制备人源化抗体。可以使用具有合适调节基因的多种表达载体来制备此类生产细胞系。作为宿主细胞，可以使用通常用于表达哺乳动物蛋白质的宿主细胞来表达人源化抗体。此类宿主细胞的例子包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0-Agl4. 19细胞、NSO细胞、等等。可以通过选择表达载体和宿主细胞的最好组合来使人源化抗体的生产率最大化。此外，应当探索培养基的组成以从多种无血清培养基和补充物选择合适的培养基，从而可以优化宿主细胞的人源化抗体表达。基于效率和最终的产率，可以使用本领域中公知的多种方法来自培养物上清液纯化由宿主细胞生成的人源化抗体，所述方法包括亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、等等。 5. 4.药物组合物和治疗用途 本发明提供了一种包含免疫特异性识别人α 9整联蛋白的上述人源化抗体或其抗原结合片段的药物组合物。包含本发明的人源化抗体作为活性成分的药物组合物可以作为药剂用于预防和/或治疗与α 9整联蛋白有关的病症或疾病，包括但不限于癌症，例如癌细胞的生长或转移，和炎性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病、等等。也可以使用包含本发明的人源化抗体的药物组合物来治疗器官移植后慢性排斥反应、和自身免疫性疾病诸如系统性自身免疫性疾病、全身性红斑狼疮(erythematosus)、 葡萄膜炎、贝切特(Behcet)氏病、多肌炎、肾小球增殖性肾炎(glomerular proliferative nephritis)、结节病、由α 9整联蛋白诱发的疾病状况、等等。用于预防或治疗上文所描述的病症或疾病的预防和/或治疗剂(其包含本发明的人源化抗体)具有低毒性，而且可以作为通过在合适的溶剂中混合得到的液体制剂，或者作为合适剂量形式的药物组合物直接给人口服或胃肠外施用。用于上文所描述的施用的药物组合物含有上述抗体或其盐和药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物以适合于口服或胃肠外施用的剂量形式提供。剂量可以随要施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、状况、施用路径、等等而所有变化。在使用抗体来预防和/或治疗例如成年患者中的类风湿性关节炎时，有利的是，通常以约0. 01至约20mg/kg体重、优选地约0. 1至约10mg/kg体重、且更优选地约0. 1至约 5mg/kg体重的单剂每天约1至5次、优选地每天约1至3次静脉内施用本发明的抗体。在其它胃肠外施用和口服施用中，可以以与上文给定的剂量对应的剂量施用抗体。在状况特别严重时，可以根据状况增加剂量。多种投递系统是已知的，并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如脂质体中的包囊、微粒、微囊剂、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如mi和 Wu, 1987，J. Biol. Chem. 262 =4429-4432)。导入的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、 静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、和口服路径。化合物可以通过任何方便的路径，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜、等)的吸收来施用， 而且可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。还可采用肺部施用， 例如通过使用吸入器或喷雾器和含雾化剂的配制剂来实现。在一个具体的实施方案中，可期望对需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合物；这可以通过例如(而不作为限制)手术过程中的局部输注、表面应用(例如与手术后的伤口敷料一起)、通过注射、依靠导管、依靠栓剂、依靠鼻喷雾、或者依靠植入物来进行，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝胶状的材料，包括膜，诸如硅橡胶膜、或纤维。在一个实施方案中，可以通过在受感染组织部位(或以前的部位)直接注射进行施用。在另一个实施方案中，药物组合物可以在囊泡，特别是脂质体中投递(参见 Langer,1990, Science 249 :1527-1533 ；Treat 等， 于 Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein 禾口 Fidler (编)，Liss, New York,第 353页-第365页(1989) ；Lopez-Berestein,同上，第317页-第327页；通常参见如上)。在又一个实施方案中，药物组合物可以在受控释放系统中投递。在一个实施方案中，可使用泵(参见 Langer，见上文 Jefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 201 ；Buchwald 等，1980，Surgery 88 :507 ；及 Saudek 等，1989，N. Engl. J. Med. 321 :574)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release, Langer 禾口 Wise (编)，CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974) ；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance，Smolen 禾口 Ball (编)，ffiley， New York (1984) ；Ranger 禾口 P印pas，J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 61 (1983)； 还可参见 Levy 等，1985，Science 228 :190 ；During 等，1989，Ann. Neurol. 25 :351 ；Howard 等，1989，J. Neurosurg. 71 :105)。在又一个实施方案中，受控释放系统可以放置在组合物的靶物附近，如此仅需要系统剂量的一部分(参见例如Goodson，于Medical Applications of Controlled Release，见上文，第 2 卷，第 115 页-第 138 页(1984))。Langer (Science 249 :1527-1533(1990))的综述中讨论了其它受控释放系统。供口服施用的组合物的例子包括固体或液体剂量形式，具体有片剂(包括糖衣片和薄膜衣片剂)、丸剂、颗粒剂、粉状制剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆剂、乳剂、悬浮液、等。此类组合物通过众所周知的方法来制造备，而且含有药用制剂领域中常规使用的媒介、稀释剂或赋形剂。供片剂用的媒介或赋形剂的例子有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁、等等。可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、点滴输注、等的剂量形式。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法来制备。可以例如通过在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上文所描述的抗体或其盐来制备可注射制剂。作为供注射用的水性介质，有例如生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂的等张溶液、等， 其可以与合适的增溶剂诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨酯80、HC0-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]、等组合使用。作为油性介质，有采用例如芝麻油、大豆油、等，其可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇、等组合使用。优选地，在合适的安瓿中装满如此制备的注射剂。可以通过将上述抗体或其盐与供栓剂用的常规基质混合来制备用于直肠施用的栓剂。有利地，将上文所描述的供口服或胃肠外使用的药物组合物制备成单位剂量的剂量形式，其适合于配合活性组分的剂量。此类单位剂量的剂量形式包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂、等。所含有的上述抗体量一般是每单位剂量的剂量形式约5至 500mg ；尤其在注射剂形式中，优选的是以约5至IOOmg包含上述抗体，而对于其它剂量形式以约10至250mg包含上述抗体。上文所描述的每种组合物可以进一步含有其它活性成分，除非配制剂引起与上文所描述的抗体的任何不利的相互作用。本发明还涉及用于细胞和/或组织重塑的抑制剂和/或促进剂，其包含α 9整联蛋白结合性功能分子(例如0 1￥0六11-1、生腱蛋白-(、纤连蛋白、？ 11 、《6、等)作为活性组分；和用于抑制和/或促进细胞和/或组织重塑的方法，其包括使表达α9整联蛋白的细胞和/或组织(例如肿瘤细胞、嗜中性粒细胞、平滑肌、等)与α 9整联蛋白结合性功能分子接触。可以通过参照包含本发明人源化抗体的药物的前述描述适当地确定此类治疗剂中的活性组分的剂量、施用方法、药用制剂、等。如上文所描述的，本发明进一步提供了一种用于预防或治疗与α 9整联蛋白有关或牵涉α 9整联蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量的至少一种本发明的人源化抗体。5. 5.诊断用途
包含本发明的人源化抗体的药物组合物可以作为癌症(例如癌细胞的生长或转移)，和炎性疾病(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、 癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、等)的诊断剂，或者作为器官移植后慢性排斥反应、自身免疫性疾病诸如系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎、贝切特氏病、多肌炎、肾小球增殖性肾炎、结节病、由α 9整联蛋白诱发的疾病状况、等等的诊断剂使用。本发明的人源化抗体能够特异性识别α 9整联蛋白，因此可以用于量化测试流体中的 α 9整联蛋白，尤其是用于通过三明治式免疫测定法、竞争性测定法、免疫测量法、肾测量法 (nephrometry)、等、免疫染色、等等进行的量化。在将这些免疫学方法应用于本发明的测定方法时，不需要列出任何特定的条件、规程、等。通过向常规的条件和规程添加本领域中普通的技术考虑因素足以构建测定系统。关于这些通用技术手段的详情，可以参照综述、教科
4 绝绝节、寸寸°如上文所描述的，可以通过使用本发明的抗体以高灵敏度量化α 9整联蛋白。本发明的人源化抗体特别可用于诊断与α 9整联蛋白有关的各种疾病，其通过应用用于在体内量化α 9整联蛋白的方法来实现。例如，在检测出α 9整联蛋白表达水平升高或降低的情况中，可以诊断很有可能现在患有与α 9整联蛋白有关的疾病，例如癌症或炎性疾病，或者很有可能将来会患有这些疾病。如此，本发明还提供了一种用于在受试者中诊断与α9 整联蛋白有关或牵涉α 9整联蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量的至少一种本发明的人源化抗体或两者。此类体内诊断需要的剂量可以小于治疗用途所需要的，而且可以由本领域技术人员依照常规规程确定。还可以使用本发明的人源化抗体来特异性检测测试流体诸如体液、组织、等中存在的α9整联蛋白。还可以使用人源化抗体来制备用于纯化α9整联蛋白的抗体柱，检测纯化时每个级分中含有的α9整联蛋白或分析α9整联蛋白在要测试的细胞中的行为。
6.实施例以下实施例例示了免疫特异性识别人和/或小鼠α 9整联蛋白的单克隆抗体的制备、单克隆抗体的可变区的测序和抗体的其它表征及此类抗体的嵌合化和人源化，以及所得的嵌合和人源化抗体的表征。这些实施例不应解释为限制性的。6. 1.针对人α 9整联蛋白的小鼠抗体的制备依照扣除免疫法(WilliamsC. V.等，1992，Biotechniques 12 :842-847)来制备针对人α 9整联蛋白的小鼠单克隆抗体。简言之，以每只小鼠3xl06个给3只Balb/c小鼠腹膜内注射表达人^9整联蛋白的肌!1-313细胞(人α9/ΝΙΗ-3Τ3细胞)。在注射后1和2周时，给小鼠腹膜内注射3χ106个细胞/小鼠的人α 9/ΝΙΗ-3Τ3细胞，接着是一周后，以2χ106 个细胞/小鼠再次静脉内注射相同细胞。通过本领域中公知的方法制备杂交瘤(参见例如 Harlow等，Antibodies :A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988) ；Hammerling等，于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,第563 页-第681页(Elsevier,N. Y. , 1981)) 建立生成与表达人α 9整联蛋白的人α 9/CH0-K1 细胞和内源表达人α 9整联蛋白的人黑素瘤细胞而非表达人α 4整联蛋白的CHO Kl细胞有免疫特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤克隆，并分离生成免疫特异性识别人α 9整联蛋白的单克隆抗体的杂交瘤克隆(即Κ33Ν)。
6. 2.对抗人α 9整联蛋白抗体的⑶R分析通过逆转录自相应的杂交瘤提取的mRNA以制备cDNA来测定单克隆抗体(即 K33N)的CDR的氨基酸序列。使用cDNA作为模板，使用kFv克隆引物(轻链引物混合物和重链引物混合物；Amersham Biosciences Corp.，IL)通过PCR来延伸并扩增H链和L链的可变区。将PCR产物克隆入pCRII TOPO载体中，测序，并确定氨基酸序列。将此过程重复三次。表1中显示了结果。表1
CDR氨基酸序列SEQ ID NO CDRHlSYYMN4CDRH2WIFPGSGNTKYNEKFKG5CDRH3SWVSYERGYYFDY6CDRLlRASENIYYSLA11CDRL2NANSLED12CDRL3KQAYDVPYT136. 3.细胞粘附抑制活件(1)因为已知细胞粘附牵涉α 9整联蛋白与其配体，即各种ECM(包括0ΡΝ、纤连蛋白、生腱蛋白-C、VCAM-1、等等)的结合，通过使用表达人α 9整联蛋白的细胞(人黑素瘤 G361细胞)与配体的结合来对分离的抗人α 9整联蛋白抗体检查其细胞粘附抑制活性。简言之，以牛血清清蛋白(BSA)-融合SVVYGLR(SEQ ID NO 2)肽来制备OPN肽。 通过在大肠杆菌宿主细胞中表达，以人生腱蛋白C中的纤连蛋白III型重复的第三区制备 TN-C fn3 (RAA)，其中已经用RAA序列替换该肽的GRD序列。以Syg/mL将OPN肽和生腱蛋白C片段(TN-C fn3 (RAA))添加至96孔板，并于 37°C温育1小时以包被平板，然后用封闭溶液(0. 5%BSA/PBS)封闭平板。将人黑素瘤G361 细胞在0. 25% BSA/DMEM中悬浮(IxlO5个细胞/mL)，并将每个浓度的抗人α 9整联蛋白抗体添加至细胞悬浮液。将0. 25% BSA/DMEM中的人黑素瘤G361细胞(IxlO5个细胞/mL)和抗体的混合物以200 μ L/孔添加至96孔板，并于37°C在5% CO2下温育1小时。用PBS洗去非粘附细胞，将粘附细胞固定，并用0.5%结晶紫(WAKO，Osaka, Japan)/20%甲醇染色。 用蒸馏水将经染色的细胞清洗三次，然后向其添加20%乙酸溶液以实现溶解。通过测量 590nm波长的OD来量化粘附活性。使用抗人OPN单克隆抗体(5A1)作为阴性对照和先前制备的抗人α 9整联蛋白抗体(1K11、21C5、MI11、25B6和28S1)作为阳性对照。图1中显示了抗人α 9整联蛋白抗体对G361细胞结合OPN肽的影响，而图2中显示了抗人α 9整联蛋白抗体对G361细胞结合生腱蛋白C片段的影响。如图1中所显示的， 牵涉OPN的细胞粘附受与阳性对照21C5和24111相比低浓度的和与Υ9Α2相同浓度的Κ33Ν 抑制。牵涉生腱蛋白C的细胞粘附受低浓度的和与Υ9Α2相同浓度的Κ33Ν抑制，抑制效果显著强于阳性对照21C5和24111。6. 4.非人抗体的人源化6. 4. 1.小鼠K33N V基因的克隆和测序将小鼠K33N杂交瘤细胞在含有10%胎牛血清(FBS ；HyClone, Logan, UT)的TIL 培养基 I (Immuno-Biological Laboratories,Gunma, Japan)中于 37°C在 7. 5% CO2 培养箱中培养。使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)依照供应商的方案自约IO7个杂交瘤细胞提取总RNA。使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)遵循供应商的方案来合成寡聚dT引发的cDNA。使用分别与小鼠Y-I和κ链恒定区退火的3，引物和GeneRacer试剂盒中提供的 GeneRacer 5’ 引物(5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3，)(SEQ ID NO 51)用 Phusion DNA 聚合酶(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增Κ33Ν重链和轻链的可变区cDNA。为了重链可变区(VH)的PCR扩增，3’引物具有序列 5，-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3，(SEQ ID NO :52)。为了轻链可变区(VL)的 PCR 扩增，3， 引物具有序列 5，-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3，(SEQ ID NO :53)。将扩增的 VH 和 VL cDNA 亚克隆入pCR4Blunt-T0P0载体(Invitrogen)中以进行序列测定。可变区的DNA测序在 Tocore (Menlo Park, CA)实施。对数个重链和轻链克隆测序，并鉴定与典型的小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。图3和图4中分别显示了 K33N VH和VL的共有cDNA序列及推导的氨基酸序列。6. 4. 2.嵌合 K33N IgGl/ κ 抗体的构建使用Κ33Ν VH cDNA 作为模板、5' -GGGACTAGTACCACCATGGGATG GAGCTGGATCTTTCTC-3，(SpeI 位点加下划线)(SEQ ID NO 40)作为 5，引物、和 5，-GGGAAG CTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTCTGAGACTG GTGCC-3，(SEQ ID NO 41) (HindIII 位点加下划线)作为3’引物通过PCR以包含剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显子生成编码K33N VH的基因(图5)。类似地，使用K33N VL cDNA作为模板、5’-GGGGCTAGCACCA CCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-3，(SEQ ID NO :42) (NheI 位点加下划线)作为 5，引物、和 5‘-GGGGAATTCTGAGAAGAC TACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3，(SEQ ID NO 43) (EcoRI 位点加下划线)作为3’引物通过PCR以包含剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显子生成编码K33N VL的基因(图6)。K33N VH和VL外显子的剪接供体信号分别衍生自小鼠种系JH4和J κ 2序列。使用QIAquick凝胶提取试剂盒Oliagen，Valencia, CA)将PCR 扩增的片段进行凝胶纯化，用SpeI和HindIII (对于VH)或NheI和EcoRI (对于VL)将其消化，并克隆入携带人Y-I和κ恒定区的哺乳动物表达载体中以生成嵌合K33N IgGl/κ 抗体。图7中显示了所得的表达载体pChK33N的示意结构。6. 4. 3.人源化K33N V基因的生成如由Queen 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033,1989)所概述的那样实施K33N可变区的人源化。首先，借助于计算机程序来构建K33N可变区的分子模型。接着，基于针对人可变区序列的同源性搜索，选择自DA980102 (GenBank登录号)衍生的人氨基酸序列(其与K33N VH具有高度同源性)作为接受体以为人源化K33N VH提供框架。 小鼠K33N与DA980102 VH区之间的框架氨基酸同一性是74. 7% (65/87)。类似地，选择 X7M41 (GenBank登录号)的人氨基酸序列作为接受体以使K33N VL人源化。小鼠K33N和 X72441VL区之间的框架氨基酸同一性是76. 3% (61/80)。
在计算机模型提示了与互补决定区(OTR)的显著接触的框架位置处，用来自K33N 可变区的氨基酸替换人框架氨基酸。这在第28位、第48位、第66位、第67位和第71位进行以生成人源化K33N(HuK33N)VH(图8)。另外，发现人DA980102接受体的第82位处的 Met在人VH序列的相同亚组中是非典型的，因此用最常见的氨基酸残基(Leu)替换以降低潜在的免疫原性。对于轻链，在残基70和71处进行替换以生成HuK33N VL(图9)。图8中对VH和图9中对VL显示了 K33N(称作HuK33N)与人接受体氨基酸序列的比对。将编码HuK33N VH和VL之每种的基因设计为包含信号肽、剪接供体信号、和合适的限制酶位点(用于随后将其克隆入哺乳动物表达载体中)的外显子。HuK33N VH和VL外显子的剪接供体信号分别衍生自人种系JH4和J κ 1序列。通过SIG-Pred信号肽预测软件 (http://bmbpcu36. leeds. ac.uk/prot_analysis/Signal.html)指明小鼠 K33N VH 基因的信号肽序列对于精确切割是亚最佳的。因此，在HuK33N VH基因中使用小鼠抗人α 9整联蛋白单克隆抗体Mill (Gene Techno Scienee)的VH基因的信号肽序列，其通过SIG-Pred 软件预测为被有效且精确切割。人源化K33N VL外显子中的信号肽序列衍生自相应的小鼠 K33N VL序列。SIG-Pred软件指明HuK33N VL基因的信号肽被有效且精确切割。使用ThermalAce DNA聚合酶(Invitrogen)通过数种交叠的合成寡核苷酸引物的延伸和PCR扩增来构建HuK33N VH和 VL基因，如由 He等(J. Immunol. 160 :1029-1035,1998) 所概述的。图10和图11中分别列出了用于构建HuK33NVH和VL基因的寡核苷酸。图12 和图13中分别显示了寡核苷酸在HuK33N VH和VL基因中的位置。使用QIAquick凝胶提取试剂盒Oiiagen)来将PCR扩增的片段进行凝胶纯化，并将其克隆入pCR4Blimt-T0P0载体中以进行序列测定。用SpeI和HindIII (对于VH)或NheI和EcoRI (对于VL)消化后， 将HuK33NVH和VL基因亚克隆入哺乳动物表达载体中的相应位点中以便以人IgGl/ κ形式生成。图7中显示了所得的表达载体pHuK33N的示意结构。图14和图15中分别显示了所获得的HuK33N VH和VL基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。6. 4. 4.嵌合的和人源化的K33N IgGl/ κ的瞬时表达依照Durocher等(Nuc 1. Acids Res. 30 :e9，2002)使用聚乙烯亚胺来分别将 pChK33N和pHuK33N质粒DNA转染至HEK293细胞，从而瞬时表达嵌合的和人源化的K33N IgGl/ κ抗体。将经瞬时转染的HEK293细胞在含有10% FBS的DMEM中于37°C在7. 5% CO2 培养箱中维持4天。通过三明治式ELISA来测量培养物上清液中ChK33N和HuK33N IgGl/ κ抗体之每种的表达水平。用100 μ 1/孔PBS中1/2，000稀释的山羊抗人IgG Fc γ链特异性多克隆抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)于4°C包被ELISA板过夜，用清洗缓冲液(含有0. 05% Tween 20的PBS)清洗，并用300ul/孔的封闭缓冲液(含有2%脱脂奶和 0. 05% Tween 20的PBS)于室温封闭1小时。用清洗缓冲液清洗后，将100 μ 1/孔在ELISA 缓冲液(含有脱脂奶和0.025% Tween 20的PBS)中适当稀释的样品应用于ELISA板。 使用自人骨髓瘤血清纯化的人IgGl/κ抗体(SouthernBiotech)作为标准品。于室温将 ELISA板温育2小时并用清洗缓冲液清洗后，使用100 μ 1/孔的1/2，000稀释的偶联有HRP 的山羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech)来检测所结合的抗体。于室温温育1小时并用清洗缓冲液清洗后，通过添加100 μ 1/孔的ABTS底物(bio WORLD, Dublin, 0H)来进行显色。通过添加100 μ 1/孔的2%草酸来停止显色。以405nm读取吸光度。通过细胞ELISA来检查瞬时表达的ChK33N和HuK33N抗体对人α 9整联蛋白的结合。将在表面上表达重组人α 9整联蛋白的CHO-Kl稳定转染子(CHO/hu α 9 ；由Gene Techno Science 提供)以 2xl05 个细胞 / 孔在 50 μ 1 含有 10% FBS 的 F12/DMEM(HyClone)中在 96 孔组织培养板中接种，并于37°C在7. 5% CO2培养箱中培养过夜。为了测试对人α 9整联蛋白的结合，将50 μ 1含有10 % FBS的F12/DMEM中的ChK33N、HuK33N或无关的人IgGl/ κ骨髓瘤抗体(SouthernBiotech)添加至每孔。于4°C温育1小时并用冰冷的PBS将细胞清洗两次后，将100 μ 1 1/1，000稀释的偶联有HRP的山羊抗人IgG多克隆抗体(SouthernBiotech) 添加至每孔。于4°C温育1小时后，用冰冷的PBS将细胞清洗三次。为了显色，添加100 μ 1 ABTS底物。通过添加100 μ 1 2%草酸来停止显色。以405nm读取吸光度。结果显示了在 0. 5和1 μ 1/ml两者，ChK33N抗体对人α 9整联蛋白的结合几乎与HuK33N抗体对人α 9整联蛋白的结合相同(图16)。6. 4. 5.生成ChK33N和HuK33N IgGl/ κ抗体之每种的NSO稳定转染子的生成为了获得稳定生成ChK33N和HuK33N IgGl/κ抗体的细胞系，分别将表达载体 pChK33N和pHuK33N导入小鼠骨髓瘤细胞系NSO (欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire, UK)的染色体中。将 NSO 细胞在含有10% FBS的DME培养基中于37°C在7. 5% CO2培养箱中培养。通过电穿孔来实施进入 NSO 中的稳定转染，如 Bebbington 等(Bio/Technology 10 169-175，1992)中所记载的。转染前，使用FspI来使表达载体线性化。用IOyg线性化质粒转染约IO7个细胞，将其在含有10% FBS的DME培养基中悬浮，并分配入数块96孔板中。M小时后，应用选择培养基(含有 10% FBS, HT 培养基补充物(Sigma，St. Louis, MO)、0· 25mg/ml 黄嘌呤和 1 μ g/ ml霉酚酸的DME培养基)。启动选择后约10天，对培养物上清液测定抗体生成。通过三明治式ELISA本质上依照6. 4. 3 一节中所描述的规程来测量ChK33N和 HuK33N IgGl/κ抗体的表达。使用杂交瘤SFM(Invitrogen)来使生成高水平ChK33N抗体的NSO稳定转染子(NS0-ChK33N 3D11)适应于在无血清培养基中的生长。通过有限稀释将生成高水平HuK33N抗体的NSO稳定转染子在96孔板中进一步亚克隆。使亚克隆之一 (NS0-HuK33N 8G8-11)适应于在杂交瘤SFM中生长。用PCR枝原体检测组(Takara Bio USA, Madison, WI)进行的测试指明，NS0_ChK33N 3D11 和 NS0_HuK33N 8G8-11 两者在枝原体存在方面呈阴性。通过cDNA测序来确认NS0-HUK33N 6D5-11中生成的HuK33N重链和轻链的真实性。使用TRIzol试剂(Invitrogen)自NS0_HuK33N 6D5-11细胞提取总RNA,并使用 GeneRacer试剂盒(Invitrogen)遵循制造商的方案来合成寡聚dT引发的cDNA。使用CMV2 和JNT098作为引物(图17)和Phusion聚合酶(New England Biolabs)通过PCR扩增γ-1 重链的编码区。将PCR片段进行凝胶纯化，并用CMV2、JNT082、JNT097和JNT098作为引物 (图17)进行测序。类似地，使用CMV2和JNT026 (图17)来扩增κ轻链的编码区。用CMV2、 JNT026、JNT080和JNT084作为引物(图17)对凝胶纯化的DNA片段进行测序。HuK33N重链和轻链之每种的编码区获得的核苷酸序列与pHuK33N载体中的相应序列完全匹配(分别为图18和图19)。6. 4. 6. ChK33N 和 HuK33N 抗体的纯化将NS0-ChK33N 3D11和NS0_HuK33N 8G8-11细胞在滚瓶中在杂交瘤SFM中培养至耗尽。离心并过滤后，将培养物上清液加载至蛋白A kpharose柱(GE Healthcare,Piscataway, NJ)上。用PBS清洗柱，之后用0. IM甘氨酸-HCl (pH 3.0)洗脱抗体。用IM Tris-HCKpH 8)中和后，通过透析将洗脱抗体的缓冲液更换成PBS。通过测量^Onm的吸光度来测定抗体浓度(lmg/ml = 1. 4个0D)。NS0-ChK33N 3D11细胞的抗体表达水平是50 μ g/ ml，而NS0-HuK33N8G8-ll细胞的抗体表达水平是12μ g/ml。通过SDS-PAGE依照标准的规程来表征纯化的ChK33N和HuK33N抗体。还原条件下的分析指明ChK33N和HuK33N抗体之每种由具有约50kDa分子量的重链和具有约25kDa 分子量的轻链构成(图20)。每种抗体的纯度表现为超过95%。6. 4. 7. ChK33N 和 HuK33N 抗体的表征在用CHO/hua 9细胞进行的FACS结合测定法中检查小鼠的、嵌合的和人源化的 K33N抗体对人α 9整联蛋白的结合。用FACS结合缓冲液(含有0. 5% BSA和0. 05% NaN3 的PBS)清洗约切105个CHO/hu α 9细胞/测试，并在200 μ 1含有多个量的测试抗体的FACS 结合缓冲液中悬浮。在冰上30分钟后，用FACS结合缓冲液清洗细胞。然后，将用小鼠Κ33Ν 染色的细胞在100 μ 1 FACS结合缓冲液中1/200稀释的经FITC标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(SouthernBiotech)中悬浮。将用嵌合或人源化Κ33Ν染色的细胞在100 μ 1 FACS 结合缓冲液中1/200稀释的经FITC标记的山羊抗人IgG多克隆抗体(SouthernBiotech) 中悬浮。在冰上30分钟后，将细胞用FACS结合缓冲液清洗，在200 μ 1 FACS结合缓冲液中悬浮，并使用FACScan流式细胞仪(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)来分析。小鼠 K33N抗体结合CHO/hu α 9细胞的EC50值是104ng/ml (图21)。在ChK33N和HuK33N抗体之间，结合样式彼此非常相似(图22)。另外，ChK33N和HuK33N抗体的EC5tl值彼此几乎相同(ChK33N抗体为143ng/ml，而HuK33N抗体为151ng/ml)。此结果指明小鼠K33N抗体在不损失抗原结合亲和力的情况中成功人源化。6.4.8.细胞粘附测定法用50 μ L 5 μ g/mL hTNC (AEIDGIEL)-BSA 溶液于 37°C在 CO2 培养箱中将 96 孔平底微量滴定板(Nunc)包被1小时。用50 μ L 5 μ g/mL BSA溶液包被对照孔。包被反应后，用 200 μ L 0. 5w/v% BSA(封闭)溶液更换孔中的溶液，并于室温温育1小时。封闭反应后， 用PBS清洗孔。将150 μ L含有0. 25w/v% BSA的TIL培养基中悬浮的2. 5x10s个细胞/mL G-361细胞和50 μ L测试抗体溶液(0. 25w/v% BSA/TIL)在孔中分配，并于37°C在(X)2培养箱中温育1小时。温育后，用PBS溶液将每孔小心清洗三次以除去非粘附细胞。添加50 μ L 0. 5w/V%结晶紫溶液以将粘附细胞固定并染色。30分钟后，通过用一盆水清洗三次来除去过量的染料，并用50yL 20v/v%乙酸溶解孔中的染料。使用吸收分光光度计来测量每孔在595nm的吸光度。通过下式计算细胞粘附抑制率；(1_ (A-B) / (C-B)) xlOO (%)。A 在存在抗体的情况中用hTNC-BSA包被的孔的吸光度，B 在没有任何测试抗体的情况中用BSA包被的孔的吸光度，C 在存在正常人IgG (阴性对照)的情况中用hTNC-BSA包被的孔的吸光度(图23)。结果Y9A2 的 IC50 是 0. 053 μ g/ml (95 % CI :0. 032-0. 089)。K33N、ChK33N 禾口 HuK33N 的 IC50 分另Ij 是 0. 075μ Μ(0· 053-0. 106)、0· 090 μ g/ml (0. 063-0. 1 )、0· 084μ g/ ml (0. 055-0. 129)，指明测试抗体的IC50值与Y9A2的IC50值在相同水平上。7.保藏
本文中称为K33N的生成小鼠抗人α 9整联蛋白单克隆抗体的杂交瘤依照微生物保藏布达佩斯条约于2007年5月四日保藏于位于中心6，l-l-lHigashi，Tsukuba, Ibaraki (邮政编码305-8566)的国际专利生物体保藏中心(International Patent Organisms D印ository)，国家先进工业科学技术研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and iTechnology)，并记录为登录号 FERM BP-10830，通过提及而将其完整收入本文。8.工业实用性本发明的人源化单克隆抗体抑制α 9整联蛋白的功能以对癌症，例如癌细胞的生长或转移，和炎性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病、等等展现出治疗效果。9.序列表下文汇总了贯穿整个说明书所提及的序列。
权利要求
1.一种免疫特异性识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含(i)H链，该H链包含至少一种自人抗体的VH区衍生的FRH和至少一种自免疫特异性识别人α 9整联蛋白的非人抗体的至少一种⑶RH衍生的⑶RH ；或(ii)L链，该L链包含至少一种自人抗体的VL区衍生的FRL和至少一种自免疫特异性识别人α 9整联蛋白的非人抗体的至少一种⑶RL衍生的⑶RL ；或(iii)上文的⑴和( )两者。
2.权利要求1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述非人抗体是由保藏登录号 FERM BP-10830的杂交瘤生成的小鼠单克隆抗体。
3.权利要求1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的至少一种CDRH 包含选自氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6的氨基酸序列，且所述人源化抗体的至少一种 ⑶RL包含选自氨基酸序列SEQ IDNO 11、12和13的氨基酸序列。
4.权利要求2或3的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体的VH区包含自由 GenBank登录号DA980102的核苷酸序列(SEQ ID NO 18)编码的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，且所述人抗体的VL区包含自由GenBank登录号X7M41的核苷酸序列(SEQ ID NO 23)编码的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
5.一种免疫特异性识别人α 9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含H链和L链，该H链包含氨基酸序列SEQ ID NO :60，且该L链包含氨基酸序列SEQ ID NO :61。
6.一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO 60的核苷酸序列。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDNO :62。
8.权利要求6的核酸分子，其进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。
9.权利要求8的核酸分子，其中所述信号肽包含氨基酸序列SEQID Ν0:58。
10.一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO :61的核苷酸序列。
11.权利要求10的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDNO :63。
12.权利要求10的核酸分子，其进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。
13.权利要求12的核酸分子，其中所述信号肽包含氨基酸序列SEQIDNO 590
14.一种载体，其包含权利要求6或10或二者的核酸分子，其中所述核酸分子与一种或多种调节元件可操作连接。
15.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求14的载体。
16.一种用于制备人源化抗体或其抗原结合片段的方法，包括在使得该人源化抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养权利要求15的宿主细胞，并收集所表达的人源化抗体。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1、2或5中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段和药学可接受载体。
18.一种用于预防或治疗与α 9整联蛋白有关的病症或疾病的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量的权利要求5的人源化抗体或其抗原结合片段。
19.一种用于体内诊断与α 9整联蛋白有关的病症或疾病的方法，所述方法包括对要检查的受试者施用有效量的权利要求1或2的人源化抗体或其抗原结合片段。
全文摘要
本发明提供了免疫特异性识别人9整联蛋白的人源化抗体。这些抗体中的一些抑制9整联蛋白的生物学功能，由此对与9整联蛋白有关的各种病症或疾病(包括癌症，例如癌细胞的生长和转移，和炎性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病、等等)展现出治疗效果。
文档编号C07K16/28GK102333791SQ201080009550
公开日2012年1月25日 申请日期2010年3月10日 优先权日2009年3月10日
发明者S.库马, 原田达弘, 曹仲欣, 鹤下直也 申请人:株式会社遗传科技, 科研制药株式会社