人源化抗cd20单克隆抗体的制作方法

专利名称：：人源化抗cd20单克隆抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗CD20单克隆抗体。
背景技术：
：CD20是不含糖链的蛋白质，其在人B淋巴细胞的细胞表面表达。CD20除了在外周血、脾、扁桃腺和骨髓的正常B细胞中表达之外，还在很多恶性肿瘤的B细胞中表达。已报道CD20单克隆抗体所结合的表位表现出极高的可变性和多种多样的生物学反应。另外，有很多关于识别CD20的单克隆抗体的报告。具体而言，利妥西单抗(rituximab)是源自通过免疫SB细胞林(一类人B细胞)而得到的鼠抗体2B8的嵌合鼠/人单克隆抗体(C2B8)(请参阅WO94/11026小册子和美国专利第5J36，137号)。利妥西单抗以Rituxan⑧之名作为治疗药物用于治疗低度恶性非霍奇金淋巴瘤(NHL)。后来报告Rituxan对于很多与B细胞有关的免疫病有效。举例而言，Rituxan已经显示出对以下疾病有功效恶性胂瘤，例如慢性淋巴细胞白血病(CCL);涉及致病性自身抗体的自身免疫病，例如自身免疫溶血性贫血和原发性血小板减少性紫癜(ITP);和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎(RA)和多发性硬化症(请参阅CoiffierB等，Blood1998;92:1297-32;EdwardJC等，Rheumatology(Oxford)2001;40:205-11;ZajaF等，Heamatologica2002;87:189-95;和PerrottaS等，BrJHaematol2002;116:465-7)。业已报道，人补体结合已与淋巴B细胞结合的利妥西单抗，导致通过补体依赖性细胞毒性(CDC)而溶解淋巴B细胞系(请参阅Reff等，Blood1994;83:435-445)。利妥西单抗在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验中也表现出活性，并在氚标记胸腺嘧咬核苷掺入试验中表现出诱导的细胞凋亡和生长抑制活性(请参阅Maloney等，Blood1996;88:637a)。自不同类型动物嵌合的分子具抗原性，因此通常作为治疗药物并不理想。然而，包括利妥西单抗在内的抗CD20抗体不具抗原性，因为其靶向包括正常细胞在内的所有B细胞然后消失。然而，业已报道，在治疗期间诱导出中和抗体(尽管只有百分之几)，且剂量水平和治疗周期提高诱导中和抗体的概率。另外，治疗目标从B细胞淋巴瘤转换到RA、IT和MS。因此，焦点更集中在与抗原性相关的问题上。因而近来需要人抗体或含有接近于人序列的序列的人源化抗体。嵌合抗体存在着在血液中半寿期相对短的问题。包括利妥西单抗在内的鼠/人嵌合抗体的p半寿期((31/2)不超过3-4天。已报道利妥西单抗对抗低度恶性NHL的临床试验功效小于50%(请参阅IDECPharmaceuticalsCorporation杀斤闻稿，1998年12月8日)。A匕夕卜，貝无然作为CD20抗体的利妥西单抗解离常数(Kd值)为5.2nM,并相应的结合亲和力不很高，那么就存在提高NHL治疗中所需剂量的问题(请参阅MitchellER等，Blood1994;82:435-445)。
发明内容考虑到上述问题，本发明主要目的是提供表现适合作为药物的生物学活性的抗CD20单克隆抗体。为了达到上述目的，本发明人认真地研究了对天然存在的人CD20分子表现出高结合亲和力的单克隆抗体的制备，以得到具有优良特性的抗CD20单克隆抗体。结果，本发明基于这样一种认识，即通过将免疫原例如被认为含有高密度CD20抗原的B细胞林-SB细胞或Raji细胞、与用遗传重组修饰以在细胞膜上表达大量CD20的非人类动物细胞联合应用，可得到表现出优良生物学活性的高亲和力单克隆抗体。本发明人成功地确定选择有效抗人CD20人源化抗体的新颖方法。应用该选择方法使得可从本发明人源化抗CD20单克隆抗体选择出用作有效治疗药物的候选者。换言之，本发明提供下列各项(1)人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表达人CD20抗原的人B细胞林和用人CD20DNA转化的细胞林，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(i)该抗体对于人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于大约9.5nM，对B细胞的CDC活性等于或高于2B8抗体的CDC活性；(2)人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表iiACD20抗原的人B细力&昧和用人CD20DNA转化的细胞林，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(a)该抗体对于人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于大约9.5nM，对Raji细胞(悬浮细胞)或SU-DHL4细胞的CDC活性等于或高于2B8抗体的CDC活性；(3)人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表达人CD20抗原的人B细胞林和用人CD20DNA转化的细胞林，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(ii)该抗体对于人CD20抗原的Kd值范围为大约9.5nM-大约13nM，对B细胞的细胞凋亡活性和CDC活性的总和等于或高于2B8抗体的细胞凋亡活性和CDC活性的总和；(4)人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表iiACD20抗原的人B细胞林和用人CD20DNA转化的细胞林，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(b)该抗体对于人CD20抗原的Kd值范围为大约9.5nM-大约13nM,对WiL2细胞或RCK8细胞的细胞凋亡活性和CDC活性的总和等于或高于2B8抗体的细胞凋亡活性和CDC活性的总和；(5)上述1或2的人源化抗CD20单克隆抗体，其包含SEQIDNo:18所示的L链和SEQIDNo:22所示的H链的组合；(6)上述(1)或(2)人源化抗CD20单克隆抗体，其包含SEQIDNo:18所示的L链和SEQIDNo:24所示的H链的组合；(7)上述(3)或(4)的人源化抗CD20单克隆抗体，其包含SEQIDNo:19所示的L链和SEQIDNo:22所示的H链的组合；和(8)用于治疗B细胞介导的疾病的治疗药物，其包含作为活性成分的上述(l)-(7)中任一项的人源化抗CD20单克隆抗体。本发明提供人源化抗CD20单克隆抗体，其对CD20抗原的胞外表位表现出高结合亲和力并且表现出高细胞毒性活性例如CDC。这些抗体作为用于与B细胞有关的疾病的治疗药物极为有效。附图详述图l是显示用于表达转化抗体的载体pNOW-Ab结构的限制酶图谱。图2是表示用于显达蛋白质的载体pNOW结构的限制酶图镨。图3a是显示细胞凋亡试验结果的图表。图3b是显示细胞凋亡试验结果的图表。图3c是显示细胞凋亡试验结果的图表。图3d是显示细胞凋亡试验结果的图表。图4a是显示抗体浓度与ADCC关系的图表。图4b是显示抗体浓度与ADCC关系的图表。图4c是显示抗体浓度与ADCC关系的图表。图4d是显示抗体浓度与ADCC关系的图表。图5a是显示E:T比率与ADCC关系的图表。图5b是显示E:T比率与ADCC关系的图表。图5c是显示E:T比率与ADCC关系的图表。图5d是显示E:T比率与ADCC关系的图表。图6a是显示CDC试验结果的图表。图6b是显示CDC试验结果的图表。图6c是显示CDC试验结果的图表。图6d是显示CDC试验结果的图表。图7a是显示使用鼠抗体的凋亡试验结果的图表。图7b是显示使用鼠抗体的凋亡试验结果的图表。图7c是显示使用鼠抗体的凋亡试验结果的图表。图7d是显示使用鼠抗体的凋亡试验结果的图表。图8a是显示使用人源化抗体的凋亡试验结果的图表。图8b是显示使用人源化抗体的凋亡试验结果的图表。图8c是显示使用人源化抗体的凋亡试验结果的图表。图8d是显示使用人源化抗体的凋亡试验结果的图表。图9a是显示使用人源化抗体的早期凋亡比率试验的图表。图9b是显示使用人源化抗体的早期凋亡比率试验的图表。.图9c是显示使用人源化抗体的早期凋亡比率试验的图表。图9d是显示使用人源化抗体的早期凋亡比率试验的图表。图10a是显示人源化抗体的解离常数与细胞毒性(诱导细胞凋亡活性和CDC活性)之间关系的图表。所用细胞为Raji细胞。白方块表示CDC活性(％)，黑圆表示细胞凋亡活性(％)。图10b是显示人源化抗体的解离常数与细胞毒性(诱导细胞凋亡活性和CDC活性)之间关系的图表。所用细胞为SU-DHL4细胞。白色方块表示CDC活性(°/。)，黑色圓表示细胞凋亡活性(％)。图10c是显示人源化抗体的解离常数与细胞毒性(诱导细胞凋亡活性和CDC活性)之间关系的图表。所用细胞为WiL2细胞。白色方块表示CDC活性(％),黑色圆表示细胞凋亡活性(％)。图10d是显示人源化抗体的解离常数与细胞毒性(诱导细胞凋亡活性和CDC活性)之间关系的图表。所用细胞为RC-K8细胞。白色方块表示CDC活性(％)，黑色圆表示细胞凋亡活性(％)。图lla是显示人源化抗体和嵌合抗体的CDC活性的图表。所用细胞为Raji细胞。图llb是显示人源化抗体和嵌合抗体的CDC活性的图表。所用细胞为SU-DHL4细胞。图llc是显示人源化抗体和嵌合抗体的CDC活性的图表。所用细胞为WiL2细胞。图lld是显示人源化抗体和嵌合抗体的CDC活性的图表。所用细胞为RC-K8细胞。图12a是显示人源化抗体浓度和ADCC关系的图表。Raji细胞c图12b是显示人源化抗体浓度和ADCC关系的图表。SU-DHL4细胞。图12c是显示人源化抗体浓度和ADCC关系的图表。WiL2细月包。图12d是显示人源化抗体浓度和ADCC关系的图表。RC画K8细胞。图13a是显示人源化抗体的E:T比率和ADCC关系的图表。所用细月包为Raji细力包。图13b是显示人源化抗体的E:T比率和ADCC关系的图表。所用细胞为SU-DHL4细胞。图13c是显示人源化抗体的E:T比率和ADCC关系的图表。所用细胞为WiL2细胞。图13d是显示人源化抗体的E:T比率和ADCC关系的图表。所用细胞为RC-K8细胞。缩写说明Pcmv:巨细胞病毒启动子所用细l包为所用细月包为所用细月包为所用细月包为PAbgh:牛生长激素基因的含polyA的信号Psvd:增强子缺陷型猿猴病毒40的启动子DHFR:鼠二氢叶酸还原酶cDNAPAsv:猿猴病毒40的含polyA的信号PBR322ori:大肠杆菌(五.co")复制起点Amp、大肠杆菌中的选择标记(氨千青霉素抗性)Neo':哺乳动物细胞的选择标记(G418抗性)INrbg:兔卩球蛋白的内含子SP1:抗体轻链的信号肽VL:抗体轻链可变区的cDNACk:抗体k轻链恒定区的cDNASPh:抗体轻链的信号肽Vh:抗体轻链可变区的cDNACyl:抗体y1重链恒定区的cDNA本发明最佳实施方式在本说明书中，"抗体"不仅指全抗体，还指对抗原表现出与全抗体相等的结合亲和力的片段，例如包括含有原始全抗体的可变区的片革爻(Fab、F(ab，)2)。本发明单克隆抗体是对人CD20抗原表现出高亲和力并具有优良生物学活性的单克隆抗体，除其嵌合变体和人源化变体之外，还包括鼠源单克隆抗体。第一优选实施方案的单克隆抗体对表itACD20抗原的细胞具有生长抑制活性，对人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于源自利妥西单抗的鼠抗体2B8的1/2,优选Kd值为1.7-3.39nM并且对人CD20抗原具高亲和力。对于测量解离常数(Kd值)的方法没有特别限制，只要该方法能测量对于提呈到细胞上的抗原的Kd值即可。然而，在本说明书中，解离常数通过采用下文实施例中所述方法来得到。对表ilACD20抗原的细胞的生长抑制活性应该优选高于2B8的活性。所述生长抑制活性优选为对于体外在缺乏外周血单核细胞时培养的表iiACD20抗原的细胞的生长抑制活性。更优选所述生长抑制活性诱导细胞凋亡。业已报道某些抗CD20抗体与CD20的结合可增加B细胞中钙离子(Ca")浓度，由此诱导由Src激酶介导的细胞凋亡。可用在MiyamotoT,MinW,LillehojHS.AvianDis.2002Jan画Mar;46(1):10-6中所述方法来实施以上生长抑制活性测量。除其嵌合变体或人源化变体之外，本发明第一实施方案的单克隆抗体的具体实例为鼠源单克隆抗体，其中L链可变区的氛基酸序列和H链可变区的氨基酸序列分别为SEQIDNo:l和9、SEQIDNo:2和10、或SEQIDNo:3和11。才妾照例如阐述于例如IshidaT,ImaiK，NipponRinshoVol60，No3:2002-3:439-444中的已知方法，通过将来自鼠源单克隆抗体的可变区氨基酸序列与人免疫球蛋白恒定区氨基酸序列融合，可产生嵌合抗体。例如，可以^接照例》口阐述于IshidaT，ImaiK,NipponRinshoVol60:No3,2002-3:439-444;EduardoA.Padlan，MolecularImmunology,Vol.28-4/5,第489-498页，1991;EduardoA.Padlan等，TheFASEBJournal,vol.9，第133-139页和TaiteWu,ElvinA.Kabat,MolecularImmunology,Vol.29-9,ppl141-1146,1992中的已知方法，用来自鼠源单克隆抗体的可变区CDR氨基酸序列和人免疫球蛋白M酸序列来实施人源化。当产生嵌合抗体或人源化抗体时，来自多种鼠单克隆抗体L链可变区的氨基酸序列可以任意方式与来自H链可变区的M酸序列组合。实例包括联合SEQIDNo:9-11所示鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的嵌合H链和SEQIDNo:l-3中任一个所示鼠源单克隆抗体可变区M酸序列的嵌合L链的嵌合抗CD20单克隆抗体，和联合SEQIDNo:9-ll中任一个所示鼠源单克隆抗体可变区CDR序列的人源化H链和SEQIDNo:l-3中任一个所示鼠源单克隆抗体可变区CDRj^^列的人源化L链的人源化抗CD20单克隆抗体。本发明第二优选实施方案的抗体为对人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于或等于2B8的1/8的鼠源嵌合或人源化单克隆抗体。众所周知，当对人CD20抗原具高亲和力的抗体，特别是含有人IgGl或IgG3或其工程化人Fc序列形式(包括鼠源嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体)的抗体，结合细胞膜上的CD20时，经由NK细胞上的Fcr/RIII(CD16)诱导效应细胞活性，导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。众所周知，当对人CD20抗原具高亲和力的抗体，特别是含有人IgGl或IgG3或其工程化人Fc序列形式(包括鼠源嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体)的抗体，结合细胞膜上的CD20时，抗体诱导补体活性并引起补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，预期本发明第二优选实施方案的抗体表现出ADCC或CDC。本发明第二实施方案抗体的具体实例为其中L链可变区的氨基酸序列和H链可变区的氨基酸序列分别为SEQIDNo:4和12、SEQIDNo:5和13、SEQIDNo:6和14、SEQIDNo:7和15、或SEQIDNo:8和16的抗体。可通过与第一实施方案相似的方法产生嵌合抗体或人源化抗体。来自多种鼠源单克隆抗体L链可变区的氨基酸序列可以任意方式与来自H链可变区的M^齡列组合。实例包括联合SEQIDNo:12-16中任一个所示鼠源单克隆抗体可变区M酸序列的嵌合H链和SEQIDNo:4-8中任一个所示鼠源单克隆抗体可变区M酸序列的嵌合L链的嵌合抗CD20单克隆抗体，和联合SEQIDNo:12-16中任一个所示鼠源单克隆抗体可变区CDR序列的人源化H链和SEQIDNo:4-8中任一个所示鼠源单克隆抗体可变区CDR氨基酸序列的人源化L链的人源化抗CD20单克隆抗体。本发明第三优选实施方案的抗体为一组不受关于2B8的具体解离常数(Kd值)所限制的人源化单克隆抗体，包括对于利妥西单抗对其无效的细胞有效的人源化单克隆抗体。这样抗体的实例包括以下组合的人源化抗CD20单克隆抗体SEQIDNo:18所示的L链和SEQIDNo:24所示的H链；SEQIDNo:18所示的L链和SEQIDNo:22所示的H链；SEQIDNo:19所示的L链和SEQIDNo:22所示的H链；和SEQIDNo:19所示的L链和SEQIDNo:23所示的H链。此外，本发明人基于抗体对人CD20抗原的亲和力与CDC活性及诱导细胞凋亡活性之间的关系，已对通过本发明获得的人源化抗CD20单克隆抗体分类，并基于该分类选择出用作抗体药物的单克隆抗体(请参阅实施例4)。换言之，本发明人认识到，高亲和力抗体不能独立诱导细胞凋亡，为了诱导细胞凋亡需要第二抗体交联。另一方面，本发明人认识到，低亲和力抗体能独立地诱导细胞凋亡。此外，通常发现高抗体亲和力与高CDC活性相关联。结果，尽管低亲和力抗体在没有第二抗体存在时能诱导细胞凋亡，但有低CDC活性的倾向。因此，这些观察结果导致形成了作为治疗药物有效的候选抗体的两种选择标准不能独立诱导细胞凋亡、但对人CD20抗原表现出极高亲和力和CDC介导抗癌作用的抗体；或除了作为表现出因细胞凋亡和CDC所致的抗癌作用的抗体之外，还能独立诱导细胞凋亡并对人CD20抗原具高亲和力的抗体。在前一选择标准中，优选选择对人CD20抗原具高亲和力并具有高CDC活性(在Kd值和CDC活性之间表现出反相关关系)的抗体。尽管满足前一选择标准的克隆不能独立诱导细胞凋亡，但这样的克隆具有高亲和力优势并因此可能通过CDC活性促进细胞清除。本发明人出人意料地发现大部分满足前一选择标准的抗体对于人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于大约9.5nM。在后一选择标准中，优选选择CDC活性和细胞凋亡活性的总和高并对人CD20抗原具高亲和力的抗体。尽管满足后一选择标准的克隆不能表现出高亲和力，但这样的克隆具有高细胞凋亡活性的优势，并因此可能通过CDC和诱导细胞凋亡的协同作用促进细胞清除。本发明人出人意料地发现，大部分满足后一选择标准的抗体对于人CD20抗原的解离常数(Kd值)在大约9.5nM-大约13nM范围内。优选用数字表示该选择标准。因此可能如下表示选择标准(i)对人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于大约9.5nM并对B细胞的CDC活性等于或高于2B8抗体的CDC活性的抗体；或(ii)对人CD20抗原Kd值在大约9.5nM-大约13nM范围内并对B细胞的CDC活性和细胞凋亡活性总和等于或高于2B8抗体的所述活性总和的抗体。本文中"等于，，指在比较时数字大约±10%范围内的值。本发明人进行的实验导致意想不到的结果优选应用基于B细胞类型的选择标准。更具体地说，考虑到下文所述实施例4所得到的结果，有可能限定在(a)中更详细描述的选择标准(i),和(b)中的选择标准(ii)。(a)对人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于大约9.5nM并对Raji细胞(悬浮细胞)或SU-DHL4细胞的CDC活性等于或高于2B8抗体的CDC活性的抗体；或(b)对人CD20抗原的Kd值范围为大约9.5nM-大约13nM并对WiL2细胞或RCK8细胞的CDC活性和细胞凋亡活性总和等于或高于2B8抗体的所述活性总和的抗体。本文中"等于，，指在比较时数字的大约±10%范围内的值。当应用上述(i)或(a)中的选择标准时，优选选择对人CD20抗原的Kd值低于大约9.5nM、具有尽可能低的Kd值并具高CDC活性的抗体。优选选择对Raji细胞(悬浮细胞)或DHL4细胞的CDC活性等于或高于2B8抗体的CDC活性的抗体。通常具较低Kd值的抗体往往具较高抗体CDC活性，有可能简单地选择具低Kd值(对人CD20抗原有高亲和力)的抗体。由于满足选择标准(i)或(a)的抗体对CD20抗原具有极高亲和力以及极高CDC活性，因而这样的抗体表现出优良的抗癌作用。然而，满足选择标准(i)或(a)的抗体不能独立诱导细胞凋亡，为了诱导细胞凋亡需要第二抗体。当应用上述(ii)或(b)中的选择标准时，优选选择对人CD20抗原具有大约9.5nM-大约13nM范围内的低Kd值并表现出细胞凋亡活性和CDC活性总和尽可能高的抗体。优选选择对WiL2细胞或RCK8细胞的细胞凋亡活性和CDC活性的总和并该总和等于或高于2B8抗体的所述活性总和的抗体。由于满足选择标准(ii)或(b)的抗体对CD20抗原具适度高的亲和力并能独立诱导细胞凋亡，因而这样的抗体由于细胞凋亡和CDC之间的协同作用可表现出优良的抗癌作用。优选选择其CDC活性和细胞凋亡活性总和等于或高于2B8抗体的所述活性总和的抗体。换言之，当期望抗体将具有极高CDC活性时可应用选择标准(i)或(a)。当期望抗体既具有CDC活性又具有细胞凋亡活性时可应用选择标准(ii)或(b)。按照本发明得到的满足选择标准(i)或(a)的人源化CD20单克隆抗体实例为联合SEQIDNo:18所示的L链和SEQIDNo:22所示的H链的人源化CD20单克隆抗体；和联合SEQIDNo:18所示的L链和SEQIDNo:24所示的H链的人源化CD20单克隆抗体。按照本发明得到的满足选择标准(ii)或(b)的人源化CD20单克隆抗体实例为联合SEQIDNo:19所示的L链和SEQIDNo:22所示的H链的人源化CD20单克隆抗体。明抗体所识别表位不同的表位的抗体(例如用不同于本发明方法得到的抗体)是可能的。因此，在另外实施方案中，本发明涉及选择抗癌抗体的方法和应用该方法选择出的抗体，所述抗体的特征为以下选择标准..不能独立诱导细胞凋亡、但对抗原表现出极高亲和力和CDC介导的抗癌作用的抗体；或除作为因细胞凋亡和CDC而表现出抗癌作用的抗体外，还能独立诱导细胞凋亡并对抗原具高亲和力的抗体。当应用选择标准(i)或(a)、或(ii)或(b)时，可用相关领域的任何已知方法测量对抗原的亲和力、CDC活性或细^^凋亡活性。通常通过用所测量的针对抗原的解离常数作为标准来测量对抗原的亲和力。通常用表达人CD20抗原的细胞作为标准，来测量人源化抗体对于人CD20抗体的解离常数。优选用不表nCD20抗原的细胞作为对照。可使用给人源化抗体连接上可检测标记或用对人抗体具特异性的标记抗体等方法来检测结合于细胞的人源化抗体。例如，可如下文实施例2所述来测量对CD20抗原的亲和力(或解离常数-Kd值)。将在下文阐述本发明人源化抗CD20抗体的分离和选择。可通过从用下文所述方法筛选产生的杂交瘤克隆中选择产生具有目标特性的单克隆抗体的克隆，来制备可用于制备本发明人源化抗CD20抗体的鼠源单克隆抗体。可从表达CD20的细胞SB细胞或Raji细胞以及例如通过重组技术用市购CD20DNA(或具有相同作用的片段)转化的在细胞膜上表达CD20的CHO细胞(CHO/CD20)得到致敏原(免疫原)。在首次免疫、附加免疫和最后免疫期间，应该用提呈致敏原并来源于与待免疫动物不同目的动物的细胞抹，或用由于遗传重组而在细胞表面膜上提呈致敏原并来源于与待免疫动物相同目的动物的细胞抹，在首次免疫和附加免疫期间实施至少一次免疫。在最后免疫期间使用其它细胞林。其它条件可与用于制备生产单克隆抗体的杂交瘤的方法的正常条件相同。通过例如以下已知方法制备生产单克隆抗体的杂交瘤(1)免疫待免疫的动物；(2)从已免疫动物制备淋巴细胞；(3)制备亲代细胞；(4)实施淋巴细胞和亲代细胞的细胞融合；和(5)筛选并克隆(参见Monokuronarukotai，SeikagakuJikkenho(MonoclonalAntibody,BiochemicalExperimentMethod),由AilsaM.Campbell编辑，ToshiakiOSAWA、TokyoKagakuDojin翻译(1989))。用克隆杂交瘤制备单克隆抗体的方法可采用用本发明产生杂交瘤的方法制备的杂交瘤，或可使用被广泛地采用的制备单克隆抗体的方法。例如可通过细胞培养的方法或生产鼠腹水的方法实现大规一莫生产。通过产生编码嵌合抗体或人源化抗体的基因，将该基因插入表达载体并在合适细胞中表达该表达载体，可产生嵌合或人源化抗体。例如，用人免疫球蛋白L链和H链(K)恒定区基因并联合CHO细胞高表达载体，可以嵌合L链和H链的可变区基因。尽管可使用用于生产重组抗体的市购载体系统，但也可以使用含有多克隆位点(MCS)、基于哺乳动物细胞用高表达载体的、用于L链和H链的二聚体高表达载体pNOW-ab(特许第3,582,965号公报)。显示载体结构的限制酶图语示于图l和2中。用含有嵌合抗体基因的表达载体来转染CHO细胞，然后分离高生产性克隆。用已知方法从这些克隆生产抗体。本发明第一实施方案的抗体与利妥西单抗比较表现出相对高的结合亲和力并且表现出生长抑制活性。由于所述抗体表现出诱导细胞凋亡的高活性，因此优选所述嵌合抗体或人源化抗体可用作针对涉及B细胞的疾病和针对B细胞恶性肿瘤的治疗药物的活性成分。此外，认为本发明第二和第三实施方案的抗体对表达人CD20抗原的细胞表现出补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，因此可用作针对涉及B细胞的免疫病和针对B细胞恶性肿瘤的治疗药物的活性成分。因此，本发明还提供针对涉及B细胞的疾病的治疗药物，该药物具有作为活性成分的本发明嵌合抗体或人源化抗体。用上述(i)或(a)中或(ii)或(b)中的选择标准，可以选择出本发明人源化抗CD20单克隆抗体。满足这些标准的抗体对涉及B细胞的免疫病和B细胞恶性肿瘤高度有效，尤其适合用于药物应用。因此，本发明提供用于B细胞介导的疾病的治疗药物，该药物含有作为活性成分的满足上述选择条件(i)或(a)、或(ii)或(b)的人源化抗CD20单克隆抗体。可联合本发明两种或多种类型的抗体。涉及B细胞的疾病不限于以下疾病，包括例如非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、自身免疫溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癥、系统性红斑狼痴、抗磷脂抗体综合征、干皮性骨化症、克罗恩病、真皮炎和多发性硬化。所述治疗药物可用已知技术生产，对加工各成分没有特别限制。剂量等等可参考关于Rituxan的已知剂量来确定。下文将就实施例进一步细述本发明。然而，本发明并不限于这些实施例。实施例1(l)制备用于使小鼠免疫致敏的免疫原体外培养表达CD10的B细胞株-SB细胞和Raji细胞。分别用特异性S1物hCD20-S-GK-Notaatgcggccgccaccatgacaacacccagaaattc(SEQIDNo:25)和hCD20-E-Xbagctctagattaaggagagctgtcattttc(SEQIDNo:26)克隆编码完整CD20分子的DNA(MultipleChoicecDNAhumanspleen,OrigeneTechnologies,Inc.6TaftCourt,Suite100,Rockville，MD20850)。将该DNA插入哺乳动物细胞高表达载体pNOW(图1),并用于转化CHO细胞。用FACS分析鉴定在细胞表面表现出高水平CD20表达的重组CHO细胞(CD20/CHO细胞)。用FITC-标记的CD20单克隆抗体进行染色，当细胞表达SB细胞的5倍或更高荧光强度时，选择所述细胞作为高表达细胞。(2)制备免疫原用补充10%FCS的RPM1640培养基培养SB细胞和Raji细胞。用补充800|ng/mlG418的CHO-S-SFMII培养基(Gibco，目录号12052-098)培养CD20/CHO细胞。以1,100rpm将这些培养物培养基离心5分钟，将细胞悬浮于Dulbecco，sPBS(-)并再次离心。再次进行该洗涤步骤，将生理盐水溶液加入细胞中，将所制备悬浮液(细胞数目l-3xl()7个/ml)用于免疫。(3)免疫将两种免疫原制剂腹膜内给予7-11周龄的雌性Balb/c小鼠。以不同天数的间隔给予2-3次SB细胞或CD20/CHO细胞后，用另外的细胞类型(CD20/CHO细胞或Raji细胞)实施最后免疫。对于任一种细胞类型而言所给予的细胞数目都为每小鼠1-3x107个细胞。所述免疫原组合示于表1中。(4)细胞融合在最终免疫后3天，从2只小鼠采集脾细胞，在PEG-1500存在下用在以下文献中所述的方法与鼠骨髓瘤(NS-1)融合Oi，V.T.和L.A.Herzenberg,1980，载于SelectedMethodsinCellularImmunology,B.Mishell和S.M.Shiigi编辑(FreemanandCo.SanFrancisco,CA)第351页。("初次筛选和再次筛选用其上附着有CD20/CHO细胞或CHO细胞(亲代4朱)的96孔板进行细胞ELISA测定，选择与CD20特异性反应的抗体的孔。用其上附性反应。选择与C2B8所针对的表位有相似反应的抗体(孔)。筛选结果如表l所示。(6)细胞ELISA在细胞ELISA测定中使用附于聚L-赖氨酸包被的96孔板(AsahiTechoglassCorporation,目录号11-023-018)上的CD20/CHO细胞或CHO细胞(亲代株)。将150pl封闭緩冲液(含0.2%明胶、0.5%BSA的PBS溶液)导入各孑L，使板在37。C静置1小时。用150nMNaCl、0.05%吐温20的水溶液洗涤该板5次，然后将100pl样品(培养物上清液的稀释溶液)导入各孔。在37。C进行1小时初次反应。洗涤后将100jal标记抗体(HRP标记的抗鼠IgG(H+L)兔抗体(JacksonLab.，编号315-035-003)或HRP标记的抗鼠IgG(Fc力兔抗体(JacksonLab，编号315-035-008))的稀释溶液导入各孔，在37。C进行1小时二次反应。在制备用于初次反应和二次反应的反应溶液时用同样的封闭液。洗涤后将100|il显色液(OPD)导入各孔，30分钟后加入50pl4NH2S04以终止反应。测量492nm处的吸光率。(7)细胞ELISA中的竟争性反应制备样品(培养物上清液的稀释溶液)和嵌合抗体(10-40ng/ml)的混合液。在实施上述关于细胞ELISA测定中的封闭反应后，将100pl该混合溶液导入各孔，在37。C进行1小时初次反应。洗涤后将100(il标记抗体(HRP标记的抗人IgG(H+L)兔抗体(JacksonLab.,编号309-035-082))的稀释溶液导入各孔，在37。C进行1小时二次反应。洗涤后将100|il显色液(OPD)导入各孔，30分钟后加入504NH2S04以终止反应。测量492nm处的吸光率。因为标记抗体仅与嵌合抗体反应，所以测量值的降低应当因于初次反应中加入样品中的抗体与嵌合抗体之间的竟争所致。(8)克隆使用有限稀释法。在将培养细胞分歉到96孔板后，对含单个克隆的孔的培养物上清液进^f于细胞ELISA测定，以便选择产生特异性抗体的克隆。(9)制备纯化抗体隆。当细胞密度达到大约5x105个/ml之值时，用无血清培养基ASF-104N(Ajinomoto)取代该培养基。2-4天后离心培养物溶液，回收培养物上清液并用蛋白G柱纯化抗体。用150mMNaCl透析单克隆抗体洗脱液。用0.2pm滤器进行除菌过滤以得到试-验抗体(抗人CD20鼠单克隆抗体)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>所选孔数-A:与CD20/CHO细胞反应并产生不与CHO细胞反应的抗体的孔所选孔数-B:A中所选择的孔中产生与参比抗体(C2B8)经历竟争性反应的抗体的孔产生单克隆抗体的8个代表性克隆的L链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:l-8)和H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:9-16)如下所示。1K0924的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:ll):QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYN()KFKGKATLTSDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARMSTMITGFDYWGQGTTLTVSS1K1228的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:16):QVQLQQPGAELVKPGASVKVSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLVWIGAIYPGNGDTSYNQKFRGKATLTADISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGYDAMDYWGQGTSVTVSS1K1422的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:9):QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCRASGYTFTNYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNRKFKGKATLTADTSSSTAYMQFSSLTSADSAVYYCARFTYYYGGTYGAMDYWGQGTSVTVSL1K1791的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:10):QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNFGVNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLEASANTAYLO画LKNDDMSTYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGTSVTVSS1K1712的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:12):QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNLHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNQQFKGKATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYCCARSAMISTGNWYFDYWGQGTTLTVSS1K1402的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:13):QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGGISMGAMDYWGQGTSVTVSS1K1736的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:14):QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNLHWVKQTPGQGLEWIGGINYEGTLDYWGQGTSVTVSS1K1782的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:15):QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARSGPYFDVWGAGTTVTVSS1K0924的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:3):QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSY画WYQQRPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYYFTISRVEAEDAATYYCQO丽SNPPTHGGGTKLEIK1K1228的H链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:8):EIILTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSYYLRWYQQKPGFSPKVLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGNTVPLTFGSGTKLEIK1K1422的L链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:l):QIVLTQSPPIMSASLGEEITLTCSASSRVSYMLWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWTSNPCTFGGGTKLEIK1K1791的L链可变区的氨基断列(SEQIDNo:2):STVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIYFASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTINTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELK1K1712的L链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:4):QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMDWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDTATYYCQQWT層PTFGSGTKLEIK1K1402的L链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:5):QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGAGTKLELK1K1736的L链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:6):QIVLSQSPAILSSSPGEKVTMTCRASSSVSYMLWYQQKPGSSPEPWIYATSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGGGTKLEIK1K1782的L链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:7):DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQNIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK实施例2测定得到的部分克隆的单克隆抗体基因可变区的碱基序列。对产生所述序列的单克隆抗体的抗体结合亲和力的测量和生物特性测-验如下所述。(l)结合亲和力测量使用源自在细胞表面表达目标抗原的人B细胞的悬浮Raji细胞和源自不表达CD20抗原的人T细胞的悬浮Jurkat细胞。细胞在C02培养箱(SANYOMCO-175M)中于37。C在5%<:02气氛中，用补充10%胎牛血清(FCS)(BIOLOGICALIND，目录号04-001-lA，批号815242,为了^吏补体组分失活在56-C预热30分钟的制品)的RPMI1640培养基(nacalaitesqueCo.,Ltd.，目录号30264-85，批号L4K2844)中培养。通过每周2次传代培养来保持细胞。用Burker-Turk血球计(ErmaInc.,目录号03-303-1)来测量细胞数目。将传代后3-4天的汇合细胞培养基以3000rpm在室温用多用途冷冻离心机LX-120(TOMYCo.，Ltd.)离心3分钟。除掉上清液，回收细胞。选择在该步骤中所用的旋转速度和时间，以便不管重复离心分离并除掉上清液多少次细胞数目不表现出变化。为了除掉培养基和残留在细胞表面的FCS(洗涤)，将回收的细胞悬浮在Dulbecco磷酸緩冲盐溶液(-)(无Ca和Mg，PBS(-)，(NaCl:Wako,目录号191-01665;Na2HP04:Wako，目录号197-02865,批号ASF2635;KC1:Wako,目录号163-0334T，批号CEQ7122;KH2P04:Wako,目录号169-0425、批号ELG7616))中，以3000rpm离心3分钟2次以除掉上清液。洗涤后将细胞悬浮在1。/。BSA(Wako目录号013-07492,批号PKH3483)-PBS溶液中，并调整细胞密度为5x106个细胞/1111。将作为测试抗体或阳性对照抗体(2B8)的第一抗体分別以15、30、50、75、100、125、150、200ng(1.5-5jal)份额注入1.5ml试管(BMEquipmentCo.,Ltd.，BM-环锁管(ringlocktube),目录号BM-15)中。同时准备四支不含抗体的试管。对每一测试抗体制备三份样品，与100^(5x105个细胞)1%BSA(Wako目录号013-07492，批号PKH3483)-PBS悬浮液充分混合，振摇并在室温反应1小时。反应后，以3,000rpm在室温用低温高速冷冻离心机LX-100(TOMY)离心3分钟。回收细胞后，将该细胞悬浮于200piPBS中以除掉保留在细胞表面未反应的第一抗体，然后以3,000rpm离心3分钟以除掉上清液。将该操作重复2次。加入相对于结合细胞的第一抗体而言过量(500ng)的FITC-标记的抗鼠IgG(H&L)第二抗体[缀合荧光素的山羊抗鼠IgG(H&L)，亲和纯化的第二抗体，Chemicon，目录号AP124F,批号24021014]和100|il1%BSA-PBS(500ng/100pl)。将该混合物在室温震荡1小时，同时避光，检测结合细胞的第一抗体。反应后将混合物以3,000rpm离心3分钟，回收细胞。将细胞悬浮在200(ilPBS中以除掉残留在细胞表面的未反应的FITC-标记的抗鼠IgG(H&L)抗体，然后以3,000rpm离心3分钟以除掉上清液。将该操作重复2次。将回收的细胞悬浮于100|ilPBS中，并转移到平底96孔板(SumitomoBakeliteCo"Ltd.，ELISA板目录号8496F)。用Typhoon9210图像分析仪(AmershamBioscience)在以下条件下测量第二抗体的荧光强度荧光模式600V,526SP/氯色(532nm);焦距底面+3mm。同时，用100pl补充0、12.5、25、50、75、100、125、150ng的FITC-标记的第二抗体的PBS,制备用于制备标准曲线的对照。在检测步骤后，用图像分析软件ImageQuant(AmershamBioscience)数字化处理图像，用Excel(微软)分析。测定板、PBS溶液和对细胞表现出非特异性结合的FITC-标记的第二抗体的本底值。然后得到只在细胞和FITC-标记的第二抗体之间反应的值。从各样品的荧光强度值中减去那四个点的平均值，以得到结合细胞的FITC-标记的第二抗体的荧光量。通过测量各种浓度的结合对照细胞的FITC-标记的第二抗体的荧光量来制备标准曲线。由此计算结合细胞的第二抗体的量(摩尔数或重量)。假定每一第一抗体和FITC-标记的第二抗体以1:2比率反应，计算结合细胞的第一抗体的量。通过从所加的量中减去结合细胞的量，计算悬浮液中的第一抗体。当以摩尔浓度来计算抗体浓度时，取单克隆抗体的分子量为150,000。当荧光强度达到恒定值时，证实了随着所加入的第一抗体的增加使得结合反应饱和。使用斯卡查德分析(Scatchardanalysis)来计算抗原数目和解离常数(Kd值)，请参阅Scatchard,G.;Ann.N.Y.Acad.Sci.,51:660-672，1949，NewCulturedCellExperimentalMethodsinMolecularBiologyResearch,YodoshaCo.,Ltd.,JikkenIgakuseparatevolume,BioManualUPSeries修订的第二版，第212-217页。数值为各样品的三个值的平均。8林单克隆抗体生产克隆的实例和阳性对照抗体(2B8)的测量结果如下表3所示。(2)生物学特性试验(a)细胞凋亡诱导试验用流式细胞术(AnnexinV/PI染色)测量试验抗体的细胞凋亡i秀导能力。使用阳性对照(2B8)和阴性对照(抗CD3单克隆抗体(BDPharMingen))。用MEBCYTO细胞凋亡试剂盒(MBL,目录号4700,批号20)实施试验。离心后，将Raji细胞悬浮于补充10。/oFBS(固定剂)(ICN，目录号2916754，批号8005C)的新鲜RPMI1640培养基(Sigma,目录号R8758,批号44K2416)中。将1ml浓度为5x105个细胞/ml的溶液导入12孔板的各孔。每一抗体使用12个孔，加入每一种抗体以使得终浓度为2pg/ml或4pg/ml(3孔x两种浓度x2次，共12孔)。在培养开始后的第一天和第二天，回收含约2xl()S个细胞的培养基，离心后用PBS洗涤细胞一次。然后将细胞悬浮于85^结合緩沖液中。在与10plAnnexinV-FITC和5plPI充分混合后，让该混合物在室温反应15分钟同时避光。实施流式细胞术测量(FACSCalibur,BectonDickinson),用CellQuest进4亍分片斤(BectonDickinson)。6株单克隆抗体生产克隆、阳性对照抗体(2B8)和阴性对照抗体(抗CD3)的测量结果如图3a-图3d中所示。尽管通常预期28B具有高细胞凋亡诱导能力，但当与2B8比较时，通过1K17系列(用CD20/CHO和Raji细胞免疫)细胞融合得到的克隆lkl791和通过1K14系歹ll(用SB细胞和CD20/CHO细胞免疫)细胞融合得到的克隆lkl422产生的单克隆抗体表现出高细胞凋亡诱导能力。(b)细胞生长抑制试验向细胞浓度为5x1(^个细胞/ml的Raji细胞中补加补充有10%FCS的RPMI1640。将得到的溶液以100(il/孔份额加入到96孔板并培养。24小时后，向各孔中加入50iil/孔各种抗体溶液以使抗体浓度为1pl/ml后继续培养。在加入抗体72小时后，以10jil/孔加入显色剂CellCountingKit-8(DoninKagaku,目录号343-07623，批号SG076),再继续培养4小时，然后于492nm处测吸光率。6抹单克隆抗体生产克隆、阳性对照抗体(2B8)和阴性对照的吸光率测量结果如下表2所示，其特性如表3所示。细胞生长抑制试验表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(c)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在本实验中，为了测量溶解淋巴瘤细胞系的能力，用抗CD20嵌合抗体的Fc区激活效应细胞。在补充10%灭活FCS的RPMI1640(培养基)中于37。C在5%C02气氛下培养和孵育源自人B细胞的四种类型的细胞Raji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8。在实-睑期间，用补充10%FCS的RPMI1640洗涤细胞。在于37°C反应期间，让未处理的细胞吸收15分钟钩荧光素，然后将细胞数目调整到4x105个细胞/ml。因为仅在具有正常细胞膜的细胞上发现钩荧光素，所以能够仅将正常细胞染色。用补充10%FCS的RPMI1640(lk0924、lkl402、lkl422、lkl712、lkl736、lkl791)调整为20pg/ml、4ng/ml和0.8pg/ml。将从健康对象采取血液，立即铺在Ficoll上并离心，以提取淋巴细胞级分，然后将其调整为5xl(^个细胞/ml、lx106个细胞/ml和0.2x1()6个细胞/ml。用25^调整了浓度的细胞、25^各种抗CD20嵌合抗体溶液(终浓度分别为5pg/ml、1jig/ml、0.2ng/ml)和50(al效应细胞以各种抗体浓度(E:T比率分别为25:1、5:1和l:l)构成总共100在96孔板中完全混合，并于37。C在5。/。C02气氛下在培养箱中反应4小时。为了计算细胞的自然溶解，制备了三种样品其中抗体溶液和效应细胞被补充10%FCS的RPMI1640所取代的样品；其中抗体溶液被补充10%FCS的RPMI1640所取代的样品，该样品用于计算不依赖于抗体存在的单独的效应细胞的活性；和其中抗体溶液被20°/。TritonX-lOO所取代的样品，该样品用于计算最大溶解。在反应后，因为当细胞溶解时，铞荧光素因细胞膜破裂而从细胞中排出，所以用Quencher来淬灭悬浮在反应溶液中的钙荧光素的荧光，然后用荧光分析仪来测量荧光。为了用以下公式计算各样品的溶解率，分析后用图像分析软件(AmershamBioscience)将图像数字化。公式1溶解率％=((自然溶解)-(样品)y((自然溶解)-(最大溶解))xioo当耙细胞数目对效应细胞例如NK细胞数目的比率(E:T比率)为25:1时，抗体浓度和和对各种细胞类型的细胞毒性之间的关系如图4a-图4d所示。当抗体浓度为5pg/ml时，对各种细胞类型的细胞毒性和E:T比率之间的关系如图5a-图5d所示。如图4a-图4d所示，当E:T比率为25:1时，各细胞在加入抗体时表现出细胞毒性。换言之，抗体参与细胞毒性。此外，除WiL2-NS以外的细胞林在抗体浓度0.2pg/ml(0.2jig/ml时出现饱和)时表现出相当于1(ig/ml和5pg/ml的活性。活性达到最大值后就保持不变，在抗体量小于补体依赖性细胞毒性所需的抗体量时作用明显。如图5a-图5d所示，当抗体浓度为5吗/ml时，E:T比率对细胞毒性的作用为细胞毒性以依赖于E:T比率的方式增加。这表明细胞毒性因效应细胞作用而发生。(d)补体依赖性细胞毒性(CDC)在本实验中，测量了在含补体血清存在下抗CD20嵌合抗体溶解淋巴瘤细胞系的能力。在补充10%灭活FCS的RPMI1640(培养基)中于37。C在5%C02气氛下培养和孵育四种源自人B细胞的细胞Raji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC隱K8。在实验期间，用补充10%FCS的RPMI1640洗涤细胞，将细胞数目调整为2-3x1()6个细胞/ml。用补充10%FCS的RPMI1640,将作为抗CD20嵌合抗体的C2B8(利妥西单抗)和6种类型的嵌合抗体(lk0924、lkl402、lkl422、lkl712、lkl736、lkl791)调整为20jig/ml、4pg/ml和0.8jig/ml。将55(il调整了浓度的细胞、25pl各种抗CD20嵌合抗体溶液(终浓度分别为5pg/ml、1pg/ml、0.2pg/ml)和20pl采自五个健康对象的混合血清或其灭活形式构成总量lOO(il,用漩涡混合器充分混合，于37"C在5%C02气氛下于培养箱中反应2小时。制备其中25pl抗体溶液被补充10%FCS的RPMI1640所取代的样品，作为本底计算样品。反应后用PI(硤化丙啶)染色死细胞，用FACS(BectonDickinson)实施分析。数字结果使用不加修正的死细胞群并减去本底值和补充灭活血清的样品。抗体浓度和对各种细胞类型的细胞毒性之间的关系如图6a-图6d所示。如图6a-图6d所示，所有6种类型的抗体都在Raji、WiL2-NS和SU-DHL4中显示出活性。此外，尽管可证实存在浓度依赖性，但当以5(ig/ml浓度比较时，与其它抗体比较，lkl791显示特别高的活性。另外，lkl736、lkl422和lkl712显示高活性。在该浓度下lkl791与其它抗体相比较，对于WiL2-NS细胞诱导大约2倍的细胞毒性。然而，其它抗体也表现出等于或高于利妥西单抗的活性。利妥西单抗对其没有效果的RC-K8细胞在各种抗体之间显示出明显的差别。利妥西单抗、lkl402和lkl712显示没有活性或几乎没有活性。与此相反，lkl791显示极高的活性，在5(ig/ml浓度时显示细胞毒性大约为50%。在下文中lk0924显示细胞毒性大约为25%，lkl422和lkl736显示细胞毒性大约为10%。从上述可以确证，作为本试验对象的6种嵌合抗体表现出等于或强于利妥西单抗的CDC活性。实施例3(l)结合亲和力测量在C02培养箱中于37。C在5%C02气氛中用补充10°/。灭活FCS的RPMI1640培养基培养源自人B细胞的Raji细胞。将该细胞每周传代2次。将传代培养后3-4天的含有(大约1x106个细胞/1111)细胞的培养液以1，000在室温离心5分钟。回收细胞，悬浮于PBS(-)中并再以1，000rpm离心5分钟以除掉上清液。将该操作实施2次，然后洗涂细胞。通过使抗CD20抗体(阳性对照抗体抗体2B8、嵌合抗体和人源化抗体C2B8)与Raji细胞充分混合，并在室温让该混合物反应1小时，来实施第一抗体反应。抗CD20抗体各自的终浓度有12个值1.33、2.67、4.00、5.33、6.67、8.00、9.33、10.67、12.00、13.33、14.67、16.00nM。反应溶液为细胞数目为5x106个细胞的1。/oBSA-PBS溶液，将其注入1.5ml管中，终体积为100jil。每一测试抗体制备三个样品，准备4支不加抗体的试管作为本底计算样品。反应后，在室温以3,000rpm将混合物离心3分钟以除掉未反应的第一抗体，并回收细胞。在1%BSA-PBS溶液中将FITC-标记的第二抗体调整为浓度5昭/ml。以100pl份额加入该溶液，以使其就结合细胞的第一抗体而言过量。悬浮并避光后，让该溶液在室温反应1小时。当所用的FITC-标记第二抗体为鼠抗体时，该抗体为山羊抗鼠IgG(H&L)-FITC。当第二抗体为嵌合抗体或人源化抗体时，该抗体为山羊F(ab，)2片段抗人IgG(Fc力-FITC。反应后将混合物在室温以3,000rpm离心3分钟。除掉未反应的FITC-标记的第二抗体，收集细胞。将细胞悬浮在200plPBS中，再次离心并洗涤。将细胞悬浮于100^PBS中，并转移到平底96孔板。用Typhoon9210图像分析仪(AmershamBioscience)测量第二抗体的荧光强度。在检测步骤后，用图像分析软件ImageQuant(AmershamBioscience)数字化处理图像，用Excel(微软)分析。计算同一测试抗体的平均值，从测试抗体值中减去本底计算样品(仅与FITC-标记的第二抗体反应的细胞)的值。来源于与细胞、PBS溶液和板的非特异性结合的FITC-标记的第二抗体的本底值忽略不计。同时，通过测量仅有每100p10、12.5、25、50、75、100、125和150ng量的FITC-标记的第二抗体时的荧光量来制备标准曲线。如此计算结合细胞的第二抗体的摩尔数。假定每一第一抗体和FITC-标记的第二抗体以1:5比率反应，计算结合细胞的第一抗体的量。通过从所加的量中减去结合的量，计算悬浮液中的第一抗体。为了计算解离常数Kd值，使用这些值来实施斯卡查德分析。结果如下表4所示。(2)细胞凋亡诱导试验用AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒在以下两种条件下检测初始细胞凋亡抗CD20抗体独立诱导针对源自人B细胞林的细胞的细胞凋亡诱导(不交联)的条件，和通过加入识别抗CD20抗体Fc区的第二抗体诱导细胞凋亡的条件(交联)。气氛中孵育，培养源自人B细胞的四种细胞Raji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8。将所述细胞每周传代培养2次。将传代培养后3-4天的培养液(大约1x106个细胞/1111)以1,000rpm在室温离心5分钟，回收细胞。将抗CD20抗体(阳性对照抗体鼠抗体2B8，嵌合抗体和人源化抗体C2B8,阴性对照抗CD2单克隆抗体)与悬浮在新鲜培养基中的细胞充分混合，在培养箱中于37。C在5。/。C02气氛中反应。抗CD20抗体的终浓度为0.2、1和5pg/ml。将细胞浓度为1x106个细胞的培养基用作反应溶液，在1.5ml试管中至终体积250^进行反应。对每一测试抗体制备三个样品。反应后在室温以1,200rpm将混合物离心3分钟，除掉未反应的4元体，回J]欠细月包。在无交联的情况下，使用新鲜培养基，在有交联的情况下，以250pl份额加入5倍于CD20抗体量的识别Fc区第二抗体。充分混合后，让混合物在培养箱中于37。C在5。/。C02气氛下再反应三个小时。当所用的第二抗体为鼠抗体时，该抗体为山羊抗鼠IgGFq片段，而当第二抗体为嵌合抗体或人源化抗体时，该抗体为特异性山羊抗人IgGFcy片段。反应后将混合物在室温以3,000rpm离心3分钟。除掉未反应的第二抗体，收集细胞。将细胞悬浮在250plPBS中，再次离心并洗涤。使用来自MEBCYTOapoptosiskit(细胞凋亡试剂盒)-AnnexinV-FITC，PI-(MBL，目录号4700,批号21)的试验试剂。在将细胞悬浮于85pi结合緩冲液后，加入5plAnnexinV-FITC和5pl碘化丙啶(PI)(至终浓度为0.5mg/ml)并充分混合。让该混合物避光，使其在室温反应15分钟。用流式细胞术(EPICSALTRA:BECKMANCOULTER)测量总计数20,000个细胞并进行分析(Expo32:BECKMANCOULTER)。结果如图7a-图9d所示。(3)制备生产人源化抗体的细胞抹(a)DNA合成设计并合成基于SEQIDNo:17-24中的氨基酸序列而将密码子对CHO细胞优化的DNA。(b)制备构建体用pNOW作为表达载体，制备如下16类人源化1K1791表达构建体pNOW-aal791kgl、pNOW-afl791kgl、pNOW-asl791kgl、pNOW画avl791kgl、pNOW-fal791kgl、pNOW陽ffl791kgl、pNOW-fsl791kgl、pNOW腸fvl791kgl、pNOW-sal791kgl、pNOW-sfl791kgl、pNOW-ssl791kgl、pNOW-svl791kgl、pNOW-val791kgl、pNOW-vfl791kgl、pNOW画vsl791kgl、pNOW-vvl791kgl。(c)用化学试剂转染和选择用转染试剂将人源化1K1791表达构建体导入CHODG44cdB细胞。将含各自基因的1x106个CHODG44cdB细胞悬浮在100pl选择培养基中，分散在5块96孔板(200jil/孔)中，于37。C在二氧化碳气氛下培养3_4周。转染试剂Qiagen,Effectene转染试剂，目录号301427。选择培养基ISCHO画CDw/Hydrolysate/4mMGlutaMAX/0.8mg/mlG418。(d)高表达细胞林的选择1)从有克隆的孔中回收上清液，用斑点印迹测定法测量抗体产量。2)将表现出高抗体产量的克隆转移到24孔板，在培养大约5天后，回收上清液，用夹心ELISA测量抗体产量。3)选择两林表现出高抗体产量的克隆并转移到T75培养瓶中。(e)小规模培养让所选择的两林克隆在含有针对所述16类构建体的30pl选择培养基的T75培养瓶中培养。(4)人源化抗体生产抹的培养和纯化在含有补充4nMGlutaMax(Invitrogen,目录号35050-061)和200吗/mlG418(Sigma,目录号A1720-5G)的水解产物的ISCHO-CD/withHydrolysate(IrvineScientific,目录号91119)中，于37°C在5%C02气氛下于C02培养箱中培养生产抗体的细胞林(遗传重组的CHO-DG44细胞)。将该细胞每周传代2次。在传代培养后大约2周于室温以3,500rpm将细胞培养液离心5分钟。回收上清液，用0.45(im注射器滤器过滤，用50nMTris-HCl,pH7.0平衡。将上清液加到HiTrap蛋白质AHP柱(GEHealthcare,目录号17-0402-01)中，用50nMTris-HCl,pH7.0洗涤。用0.1M柠檬酸pH4.0得到洗出液。每次收集400(il并用40^(或10/1的量)1MTris-HCl,pH9.0中和。在用分子量3500渗滤杯(Bio-Tech，目录号212932)对100倍量的PBS透析2.5小时2次后，再进行一次15-18小时的透析。用于产生抗体的细胞株为CHO细胞hzl791-fV10、hzl791-ff34、hzl791-sf43和hzl791-ss32。这些细胞林在2006年3月1日按照布达佩斯条约的规定，分别以保藏号FERMBP-10543、FERMBP-10544、FERMBP-10545、FERMBP-10546保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(theInternationalPatentOrganismDepositary(IPOD),NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology(AIST)，TsukubaCentral6，1-1-1Higashi,Tsukuba，Ibaraki)。下文阐述了从上述细胞抹得到的人源化抗CD20单克隆抗体H链可变区和L链可变区的M酸序列(SEQIDNo:17-24)(下划线部分与相应的鼠抗体不同)。人源化lkl791序列L链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:20)FASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELKH链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:24)WINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLDASVSTAYLQ工SSLKAEDTSTYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGT工VTVSSL链可变区的M酸序列(SEQIDNo:17)fasnry旦gvpdrfsgsgygtdftltisslqaedvavyfcqqdysspltfgagtk:le王kH链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:21)abb1791:QIOLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFGVNWVRQAPGKGLgWMGWINTYTGEPSYAQGFTGRFVFSLDASVSTAYLQISSLKAEDTATYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGT工VTVSSL链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:19)sdr1791:STVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSNSNDVAWYQQKPGQSPKVLIYFASNRY旦GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLE工KH链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:23)sdr1791:qiqlvqsg旦elkkpg^vkysckasgytetnfgvnwv且qapgkg:lkwmgWINTYTGEPSYA巡FIGRF^FSI^ASY^TAYLQISSLKAEDTATYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGT工VTVSSL链可变区的^ij^酸序列(SEQIDNo:18)fra1791:STVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVL工YFASNRY工GVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLGAEDVAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLE工KH链可变区的氨基酸序列(SEQIDNo:22)fra1791:QIOLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTETNFGVNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYA22F^GRF^FSI^AS^TAYLQI^LK^D^TYFCTRRTNYYGTSYYYAMDYWGQGT工VTVSS在本实验中，通过关于来自由联合四类AbbL、FraL、SdrL、VenLx四类AbbH、FraH、SdrH、VenH所产生的16类序列的全部组合中各两抹克隆进行的实验来得到平均值。从以上结果看来，可能创造如表4所示基于Kd值的4组分类。从每组选择一种类型用于下述实验。对照c2B8I组Kd=>20nMII组Kd=10-20nMIII组Kd=8-10nMIV组Kd=<8nM人源化抗体结合解离常数表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>使用8种鼠抗体的细胞凋亡实验结果如图7a-图7d所示。我们成功地将8种鼠抗体和已知的CD20抗体2B8和2H7对于所述四种类型细胞分为2类(忽略某些例外)。A组m0924、m1422、m1791、m2B8B组m1228、ml402ml712、m1782、m2H7(然而，对于SU-DHL4细胞，m0924包括在B组内)。换言之，属于A组的抗CD20抗体表现出足够的独立诱导细胞凋亡的能力，即使是在与第二抗体交联的情况下也表现出大约同样的诱导细胞凋亡的能力水平。然而，在交联情况下B组表现出大大增加。此外，属于A组的抗体的亲和力等于2B8抗体的亲和力，而属于B组的抗体的亲和力则表现出比2B8更高的亲和力。因此，可以推断A组更适于用作药物，因为A组能独立诱导细胞凋亡，不需要存在第二抗体来诱导细胞凋亡。现在转向细胞类型，RAJI、WIL2-NS、RCK8的细胞凋亡比率在30-40%水平值上具有最大值。与此相反，SU-DHL4表现出超过80%的值。四类人源化抗体的结果如图8a-图9d所示。以和鼠抗体相同的方式，将四类人源化1791抗体对于四种细胞类型也分为2种类型。A组fV、ffB组sf、ss、C2B8亲和力等于C2B8亲和力的A组的抗体^、ff在没有交联的情况下几乎不显示细胞凋亡活性，而在交联情况下具有明显活性。B组的sf、ss抗体比A组抗体表现出更大的解离常数和更弱的亲和力。这些抗体独立表现出比C2B8更强的细胞凋亡活性。当抗CD20抗体对B细胞独立表现出足够的诱导细胞凋亡能力时，在交联情况下的比率基本上是一样的。然而，当抗CD20抗体由于抗体类型或缺乏亲和条件而不表现出足够的诱导细胞凋亡能力时，猜测在交联情况下细胞凋亡活性将增加。图9a-图9d是显示当不在实验当天加入抗体时其值为1的早期细胞凋亡(％)的图表。实施例4人源化抗体的结合解离常数(Kd值)和细胞生长抑制特性的关系在于实施例3中将人源化抗体分为A组和B组的J^5出上，对于表5中所示的各种hzl791克隆，检查了对人CD20抗原的Kd值(nM)与诱导细胞凋亡活性(5)和CDC活性(。/。)之间的关系。以与实施例2相同的方式测量Kd值。以与实施例2相同的方式测量CDC活性。(然而，在检查CDC活性和抗体量之间关系的实验中，所述抗体以下文所述方式制备)。以与实施例2相同的方式测量ADCC。以与实施例3相同的方式测量细胞凋亡活性。在实验中所用B细胞为Raji、SU-DHL4、WiL-2和RCK8。关于四4朱克隆fV、ff、sf和ss对各种细胞的数据如图10a-图10d所示。关于本实验中所用的所有细胞的细胞凋亡活性观察到同样的倾向。换言之，抗体的亲和力越高(Kd值越低)，诱导细胞凋亡活性则越低。抗体的亲和力越低(Kd值越高)，诱导细胞凋亡活性则越高。此外，当Kd值超过13nM时，细胞凋亡活性往往达到恒定值。表现出高亲和力的抗体并不独立表现出细胞凋亡活性，为了诱导细胞凋亡需要用第二抗体交联。表现出低亲和力的抗体独立表现出细胞凋亡活性。当用Raji和SU-DHL4细胞时，观察到随着亲和力(Kd值低)的增加CDC活性增加。与此相反，当用WiL-2和RCK8细胞时，Kd值表现出倾向于接近13nM时达到极高值。在以上观察结果的基础上，确定了以下两个选择标准以使得可以鉴别用作药物的候选抗体尽管抗体不能独立诱导细胞凋亡，但对CD20抗原的亲和力极高，并且该抗体可通过CDC活性表现出抗癌活性；抗体独立"i秀导细胞凋亡，并且在可通过CDC活性和细胞凋亡表现出抗癌活性的抗体中，该抗体对CD20抗原表现出高亲和力。于随着Kd值P争低CDC活性增加)的抗体时，前一选择标准为优选。因为在此基础上选择的抗体不能独立诱导细胞凋亡，所关心的就只有CDC活性值。满足前一选择标准的克隆不能独立诱导细胞凋亡，但具有极高的CDC活性和亲和力之值，因此，促进细胞消除。在后一标准中，优选选择其中抗体的细胞凋亡活性和CDC活性总和高并对CD20抗原具有高亲和力的抗体。因此，尽管满足后一标准的克隆不表现出高亲和力，但所述抗体具有高细胞凋亡活性，因此这些抗体经由诱导细胞凋亡和CDC的协同作用而促进细胞消除。为了确定以上两种选择标准的分界点，绘图表示给出四种细胞类型的细胞凋亡活性中点的Kd值(在图10a-图10d中的虚线)。在这四个图表中给出细胞凋亡活性中点的Kd值没有大的差别。Raji细胞的值为9.5nM，SU-DHL4细胞的值为8.5nM，WiL-2细胞的值为9.5nM，RCK8细胞为10nM。这些结果4吏得可将上述两个选择标准的分界点设为大约9.5nM的值。在后一选择标准中Kd值上限设为13nM，考虑到在WiL2细胞和RCK8细胞(图10c和图10d)中所见到的极高CDC活性值，该上限处于其中细胞凋亡活性和CDC活性总和尽可能大而且亲和力高(Kd值低)的范围内。因此，根据前一选择标准，选择克隆ff和fV作为对人CD20抗原的Kd值低于大约9.5nM、具有尽可能小的Kd值和高CDC活性的抗体(图10a和图10b)。根据后一选择标准，选择克隆sf作为对人CD20抗原的Kd值为大约9.5nM-大约13nM、细胞凋亡活性和CDC活性总和尽可能高并具有低Kd值的抗体(图10c和图10d)。通过从四种人源化克隆中选择^、ff、sf和ss并用Raji细胞、SU-DHL4细胞、WiL-2细胞和RCK8细胞来测量CDC活性和细胞凋亡活性。结果如表6和表7所示。利妥西单抗(C2B8)和克隆1791(cl791)形成对照。本发明人源化抗体的CDC活性表6<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表6中的结果显示，克隆ff和fV表现出等于或强于利妥西单抗活性的CDC活性。此外，sf对WiL2和RCK8细胞显示+及强的CDC活性。实施了调查CDC活性和抗体浓度之间关系的实验。所用抗体比按照实施例2处理的抗体的纯度更高。如下文所述来纯化。在含有补充4nMGlutaMax(Invitrogen,目录号35050-061)和200Hg/mlG418(Sigma,目录号A1720-5G)的水解产物的ISCHO-CD/w培养基(IrvineScientific,目录号91119)中，于37。C在5%C02气氛下于C02培养箱中培养生产抗体的细胞抹(遗传重组的CHO-DG44细胞)。将该细胞每周传代2次。在传代培养后大约2周于室温以3，500rpm将细胞培养液离心5分钟。回收上清液，用0.45阿注射器滤器过滤，用50nMTris-HCl,pH7.0平衡。在将培养基上清液加到HiTrap蛋白质AHP柱(GEHealthcare,目录号17-0402-01)后，用50nMTris-HCl，pH7.0洗涤。用0.1M柠檬酸pH4.0得到洗出液。每次收集400pl并用40jil(或10/1的量)1MTris-HCl,pH9.0中和。在用Slyde-A-Lyzer10K透析盒(PIERCECatNo.66453)对100倍量的PBS透析2.5小时2次后，再进^f亍一次15-18小时的透析。透析后用VIVASPIN50,000MWCOPES(VIVASCIENCE,目录号VS0231)浓缩样品。将样品加到用PBS平衡的HiLoad16/60superdex200制备级柱(GEHealthcare,目录号17-1069-0l)上。用0.22注射器滤器过滤样品，并用VIVASPIN50,000MWCOPES(VIVASCIENCE,目录号VS0231)浓缩。用BECKMANCOULTERDU530从A280值计算抗体浓度。嵌合抗体clkl79和人源化抗体fV、ff、sf、ss的浓度与针对Raji细胞、SU-DHL4细胞、WiL-2细胞和RCK8细胞的CDC活性之间的关系如图11a-图lld所示。在所有系列的实验中，5pg/ml或更大浓度下人源化抗体fV、ff、sf、ss的CDC活性等于或高于利妥西单抗(C2B8)的活性。因其对Raji细胞(悬浮细胞)的Kd值低于9.5nM而且作为具有高CDC活性的抗体，选择出克隆fV和ff(预期表现出CDC活性的克隆)。这些克隆在5(ig/ml或更高浓度下对所有细胞类型表现出比利妥西单抗更高的CDC活性。对于SU-DHL4细胞的CDC活性尤其高，对于Raji细胞和RCK8细胞的CDC活性也很高。作为对Raji细胞(悬浮细胞)的Kd值为大约9.5nM-大约13nM、细胞凋亡活性和CDC活性总和尽可能高并且Kd值低的抗体，选择出克隆sf(预期表现出CDC活性和细胞凋亡)。该克隆于5pg/ml或更高浓度下对所有细胞类型表现出比利妥西单抗更高的细胞溶解活性。对SU-DHL4细胞的细胞溶解活性尤其高，对WiL2细胞和RCK8细胞的细胞溶解活性也高。检查了fV、ff、sf和ss对Raji细胞、SU-DHL4细胞、WiL-2细胞和RCK8细胞的细胞凋亡活性，结果如表7所示。本发明人源化抗体的细胞凋亡活性<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>/人表7的结果中可看出，克隆sf具有等于或强于利妥西单抗的诱导细胞凋亡活性。无需第二抗体即可独立诱导足够的细胞凋亡活性。此外，对于实验中使用的所有细胞，克隆sf的CDC活性和细胞凋亡活性总和超过利妥西单抗的所述活性总和。具体而言，对于WiL2细胞和SU-DHL4细胞观察到高值(表6、图11a-图lid和表7)。检查了fV、ff、sf和ss对Raji细胞、SU-DHL4细胞、WiL-2细胞和RCK8细胞的ADCC活性。抗体浓度和ADCC之间的关系如图12a-图12d(E:T比率为25)所示。E:T比率和ADCC之间的关系如图13a-图13d(抗体浓度为1pg/ml)所示。在所有实验中fV、ff、sf和ss的ADCC活性都等于或高于利妥西单抗(C2B8)的活性。ADCC活性结果还证明了本实验中所选择的fV、ff、sf和ss的功效。这些结果表明，以上述方式选择的本发明人源化单克隆抗体表现出比利妥西单抗的细胞溶解活性更高的细胞溶解活性。因此，治疗功效，使其可作为药物使用工业应用性本发明提供人源化抗人CD20单克隆抗体及其选择方法，所述抗体表现出适合用作药物的生物学活性和对天然人CD20分子有高结合亲和力。这些抗体对于B细胞介导的疾病具有治疗功效，使得其可用作药物。SEQ.ID.NO.:17:人源化抗体abb1791L链V区序列SEQ.ID.NO.:18:人源化抗体fra1791L链V区序列SEQ.ID.NO.:19:人源化抗体sdr1791L链V区序列SEQ.ID.NO.:20:人源化抗体Ven1791L链V区序列SEQ.ID.NO.:21:人源化抗体abb1791H链V区序列SEQ.ID,NO.:22:人源化抗体fra1791H链V区序列SEQ.ID.NO.:23:人源化抗体sdr1791H链V区序列SEQ.ID.NO.:24:人源化抗体Ven1791H链V区序列SEQ.ID.NO.:25:引物SEQ.ID.NO.:26:引物权利要求1.人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表达人CD20抗原的人B细胞株和用人CD20DNA转化的细胞株，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(i)该抗体对于人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于大约9.5nM，对B细胞的CDC活性等于或高于2B8抗体的CDC活性。2.人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表iiACD20抗原的人B细胞抹和用人CD20DNA转化的细胞抹，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(a)该抗体对于人CD20抗原的解离常数(Kd值)低于大约9.5nM，对Raji细胞(悬浮细胞)或SU-DHL4细胞的CDC活性等于或高于2B8抗体的CDC活性。3.人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表iiACD20抗原的人B细胞抹和用人CD20DNA转化的细胞株，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(ii)该抗体对于人CD20抗原的Kd值范围为大约9.5nM-大约13nM，对B细胞的细胞凋亡活性和CDC活性总和等于或高于2B8抗体的所述活性总和。4.人源化抗CD20单克隆抗体，其对含有人CD20抗原的细胞具有生长抑制活性，免疫原是表i^人CD20抗原的人B细胞抹和用人CD20DNA转化的细胞林，后者为非人类细胞并来源于不同于待免疫动物的动物，该单克隆抗体满足以下选择标准(b)该抗体对于人CD20抗原的Kd值范围为大约9.5nM-大约13nM,对WiL2细胞或RCK8细胞的细胞凋亡活性和CDC活性总和等于或高于2B8抗体的所述活性总和。5.权利要求1或2的人源化抗CD20单克隆抗体，其包括SEQIDNo:18中所示的L链和SEQIDNo:22中所示的H链的组合。6.权利要求1或2的人源化抗CD20单克隆抗体，其包括SEQIDNo:18中所示的L链和SEQIDNo:24中所示的H链的组合。7.权利要求3或4的人源化抗CD20单克隆抗体，其包括SEQIDNo:19中所示的L链和SEQIDNo:22中所示的H链的组合。8.用于治疗B细胞介导的疾病的治疗药物，其包含作为活性成分的权利要求1-7中任一项的人源化抗CD20单克隆抗体。全文摘要本发明提供人源化抗人CD20单克隆抗体、其选择标准、用该标准选择并显示适合用作药物的生物活性的人源化抗体。文档编号C07K16/28GK101437956SQ20068005448公开日2009年5月20日申请日期2006年7月6日优先权日2006年3月7日发明者内山进,福井希一申请人:国立大学法人大阪大学