专利名称：用于治疗和预防子宫颈癌的包含hpv多肽和免疫增强肽的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及 一种用于受试者的包括人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7融 合多肽、用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽和免疫增强肽的融合蛋白； 编码所述融合蛋白的多核苷酸；包含所述多核普酸的载体；包含所述融合 蛋白或载体的药物组合物；以及使用所述药物组合物治疗由人乳头瘤病毒 引起的疾病的方法。
背景技术：
子宫颈癌已成为第二最主要的癌症死亡的原因，全世界每年引起 250,000人死亡。已知子宫颈癌主要由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起(zur Hausen， H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78)。在数百种类型 的HPV中，HPV16被认为是子宫颈癌的首要原因(Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964)。在HPV蛋白中，E6和E7蛋白在因致癌基 因引起的子宫颈癌的出现中起关键作用，并且已报导它们是在约99%的由 HPV引起的肺瘤中表达的主要蛋白。结果，E6和E7蛋白已成为在治疗和 预防子宫颈癌的疫苗的制备中的主要靶抗原(von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992， 51; 831-834)。 E6通过诱导肿瘤抑制蛋白p53的分解而阻止 细胞凋亡，而E7与作为细胞肿瘤抑制因子的成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)结 合以使该蛋白失活，然后诱导细胞进入细胞周期的S期(Cobrinik et al.， Trends Biochem Sci 1992， 17:312-5)。
为了治疗子宫颈癌，使用表达核酸碱基序歹'J(同时表达HPV16 E6和 E7蛋白)的组合物进行临床试验，但其疗效并不显著(Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326)。此外，国际专利公开WO 2004/030636披露了 一种包括E6和E7的融合多肽(其中E6位于氨基末端或羧基末端)，以 及编码该融合多肽的多核苷酸。然而，该文献中公开的多肽在治疗由HPV 引起的子宫颈癌方面仍具有限制。
因此，本发明人已经发现包括与分泌肽和免疫增强肽结合的 HPVE6/E7融合多肽的融合蛋白促进免疫应答，并有效治疗和预防由HPV 引起的肿瘤，从而完成本发明。
发明内容
技术方案
本发明的一个目的是提供一种非常有效地治疗和预防由HPV引起的 疾病的融合蛋白。
本发明的另 一 目的是提供编码所述融合蛋白的多核芬酸。 本发明的再一目的是提供包含所述多核苷酸的重组载体。 本发明的还一目的是提供包含所述融合蛋白和重组载体的药物组合物。
本发明的还 一 目的是提供在受试者中使用所述药物组合物治疗或预 防由HPV引起的疾病的方法。
图1为显示通过在C57BL/6小鼠模型中接种表达Mock、 E6C°、 E7C°、 E67和E67c°、 ffi67c°、 tFc°E67Cc^。 tE67c°Lc°的质粒DNA产生的E7特异 性CD8+ T细胞应答的比较结果的图。
图2为显示通过在C57BL/6小鼠模型中接种Mock、 E6C°、 E7C°、 E67 和E67"、 tE67c°、 tFC。E67C。和tE67C。LC。产生的E6特异性CD8+T细胞应 答的比较结果的图。图3为显示在用Mock、 E6C°、 E7C。、 E67和E67c。、 tE67c。、 tFc。E67c。 和tE67"LG。接种的C57BL/6小鼠中对皮下注射TC-1肺瘤细胞的预防性抗 肺瘤作用的比较结果的图，，该作用通过肺块体积的增加来指示。
图4为显示通过在患TC誦1肿瘤的C57BL/6小鼠中用mock、 tE67Co、 tFc°E67c°和tE67c°Lc。治疗产生的E7特异性CD8+ T细胞应答的比较结果 的图。
图5为显示通过在患TC-1肺瘤的C57BL/6小鼠中用mock、 tE67Co、 tF"E67C。和tE67"LC。治疗产生的E6特异性CD8+ T细胞应答的比较结果 的图。
图6为显示通过在作为治疗模型的患TC-1肿瘤的C57BL/6小鼠中用 mock、 tE67c°、 tF"E67"和tE67"L"治疗产生的治疗性抗肺瘤作用的比 较结果的图。
具体实施例方式
根据本发明的一个技术方案，提供了一种用于受试者的融合蛋白，该 融合蛋白包括人乳头瘤病毒(HPV)的E6和E7融合多肽、用于将多肽分泌 到细胞外的信号肽和免疫增强肽。
构成本发明的融合多肽的E6和E7是源于16型、18型、31型、33 型、45型和51型人乳头瘤病毒(HPV)的抗原蛋白，并且它们优选为源于 16型(HPV16)或18型(HPV18)人乳头瘤病毒的E6和E7抗原蛋白。
在本发明中，"人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽，，这种表述指其中 E6和E7各为天然氨基酸序列或者E6和E7中任一为天然氨基酸序列的氨 基酸突变型的多肽的融合蛋白。本文中所用术语"突变型"指一种多肽， 该多肽通过使至少一个氨基酸残基经过缺失、插入、保守性置换或这些的 组合而使其具有与天然氨基酸序列不同的氨基酸序列，但其具有与天然E6和E7多肽基本相同的免疫原性，并且能够天然或人造产生。在一个实 施方式中，例如，突变型为SEQIDNO: 4,其中在编码16型人乳头瘤病 毒(HPV16)的E6多肽的氨基酸序列中，第63位和106位的半胱氨酸被甘 氨酸替换；SEQ ID NO: 6，其中在编码HPV16的E7多肽的氨基酸序列中， 第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸被甘氨酸替换；SEQ ID NO: 10， 其中在编码HPV18的E6多肽的氨基酸序列中，第65位和第108位的半 胱氨酸被甘氨酸替换；或者SEQIDNO: 12，其中在编码HPV18的E7多 肽的氨基酸序列中，第27位的半胱氨酸和第29位的谷氨酸被甘氨酸替换。
本发明的人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽可以是E6/E7融合多肽的 形式，其中相对于E7， E6位于氨基末端，就是说，E7接着E6 (E6/E7融 合多肽)；或者其中相对于E7， E6位于羧基末端，就是说，E6接着E7 (E7/E6 融合多肽)。在具体实施方式
中，例如，融合多肽可为SEQ ID NO: 8的 HPV16 E6/E7融合多肽或者SEQ ID NO: 14的HPV18 E6/E7融合多肽。
本发明中，术语"信号肽"指由约20 30个氨基酸组成的肽，该肽将 在细胞内表达的蛋白，尤其是包含E6/E7融合多肽的蛋白分泌到细胞外面。 用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽及编码该肽的核酸序列被称为"分泌 信号序列"。本发明的E6和E7抗原是在已被病毒感染并因此具有弱免疫 性的细胞的核内表达的蛋白(核蛋白)。因此，由分泌信号序列表达的信号 肽能够诱导E6和E7抗原分泌到细胞外面，以增强抗原特异性体液免疫应 答和细胞免疫应答。因此，就本发明的信号肽而言，可以使用tPA、HSVgDs 及生长激素等的分泌信号序列，但不限于此。优选地，可使用在包括哺乳 动物的高等真核细胞中所用的信号肽，更优选tPA (组织型纤溶酶原激活 物)。
本文中所用术语"免疫增强肽"指激活参与免疫应答的细胞(例如树 突状细胞等)以增强免疫应答的肽。免疫增强肽的实例包括CD40配体、Flt3配体、鞭毛蛋白和OX40。本发明中，至少一种免疫增强肽可选择使用以 上所列的肽，并且优选该肽可选择单独使用。在本发明的具体实施方式
中， CD40配体和Flt3配体单独或组合使用。本发明的"Flt3配体"是一种因 子，该因子诱导树突状细胞(DC)的增殖与成熟，经抗原增强免疫应答，以 及在与肿瘤抗原融合时非常有效地使肿瘤减小。本文中所用术语"CD40 配体，，是与存在于如树突状细胞的抗原递呈细胞(APC)表面上的CD40相 互作用以激活树突状细胞等的配体。
本文中所用"受试者，，包括如人、猴、鼠、猪、母牛和兔的哺乳动物， 但不限于此。
本发明的融合蛋白对抗原特异性免疫应答以及抑制肿瘤的发生和生 长非常有效。确实，人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽诱导E6和E7特 异性CD8+T细胞应答并显示出比E6或E7更强的抗肿瘤作用。另外，发 现一种融合蛋白导致非常有效的抗原特异性免疫应答并且抑制肺瘤的发 生和生长，在该融合蛋白中，人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽与信号肽 和免疫增强肽结合。在具体实施方式
中，发现一种融合蛋白与人乳头瘤病 毒的E6和E7各自相比对抗原特异性免疫应答、抑制肿瘤的发生和生长以 及抑制胂瘤大小非常有效，在该融合蛋白中，人乳头瘤病毒的E6和E7 融合多肽与作为信号肽的tPa和作为免疫增强物的Flt3配体和/或CD40配 体结合。因此，本发明的融合蛋白可用于肿瘤的治疗和预防。 本发明的另 一实施方式涉及编码所述融合蛋白的多核苷酸。 本发明的多核苷酸可通过化学合成方法或遗传工程技术而制备。化学 合成方法为本领域技术人员已知的，并且可使用任何方法。此外，其可以 从商用合成者或制造商购买。在通过遗传工程技术制备的情况下，例如通 过分别编码已知商用的E6和E7融合多肽、信号肽和免疫增强肽的核酸片 段以及连接这些片段以符合读框而制备。制得核酸片段的方法为本领域已知的，并且本领域技术人员可以将其通过适当的限制酶连接。在本发明的具体实施方式
中，公开了通过化学合成法制备多核香酸的方法。 本发明的还一实施方式涉及包含所述多核苷酸的重组载体。
本文中所用术语"载体"指包括外源DNA的遗传结构，所述外源DNA 已被插入到编码多肽的基因组中。本文中所用术语"表达载体，，指一种载 体，在该载体中将编码分泌信号序列的核酸序列、编码人乳头瘤病毒的 E6和E7融合多肽的核酸序列以及编码免疫增强肽的核酸序列等插入到基 因组中，并且其实例包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体、酵母载体和病毒 载体(如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺伴随病毒载体)。
本文中所用术语"分泌信号序列，，指编码将在细胞内表达的肿瘤抗原 分泌到细胞外面并使其被免疫细胞识别的肽的核酸序列，并且其实例包括 如tPA、 HSVgDs和生长激素的分泌信号序列。优选地，可以使用哺乳动 物的高等真核细胞中所用的分泌信号序列，更优选tPA (组织型纤溶酶原激 活物)。此外，本发明的分泌信号序列可在用在宿主细胞中具有高表达频 率的密码子替换之后使用。
本文中所用表述"编码免疫增强肽的核酸序列"指编码通过激活参与 免疫应答的细胞(例如树突状细胞等)而增强免疫应答的肽的核酸序列。免 疫增强肽的实例包括CD40配体、Flt3配体、鞭毛蛋白和OX40。本发明 中，可选4奪使用至少一种这些免疫增强肽，并且优选可选择使用每个肽。 在本发明的具体实施方式
中，CD40配体和Flt3配体单独或者组合使用。 编码免疫增强肽的核酸序列可在用在宿主细胞中具有高表达频率的密码 子替换之后使用。
本发明的重组载体中包含的多核苷酸可用在宿主细胞中具有高表达 频率的密码子替换。本文中所用表述"用在宿主细胞中具有高表达频率的 密码子替换"或"密码子最优化"指当宿主细胞中DNA转录和翻译成蛋有更高偏爱性的密码子替换在一些宿 主中具有高偏爱性的密码子，从而增强由核酸编码的氨基酸或蛋白的表达 效率。本文中，术语"宿主细胞"包括原核细胞或真核细胞，并且真核细 胞包括如真菌和酵母的低等真核细胞以及如哺乳动物的高等真核细胞。
除了密码子最优化之外，本发明的重组载体中包含的编码人乳头瘤病
毒的E6和E7融合多肽的多核苦酸可用一些编码E6和E7的核酸序列替 换以避免产生致癌性。
就本发明的人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽而言，与使用单独表达 的E6和E7作为免疫原相比，使用以融合多肽表达的E6和E7作为免疫 原更加有效地诱导抗肺瘤作用。此外，用在宿主细胞中具有高表达频率的 密码子替换的编码E6和E7融合多肽的核酸序列与未经替换的相比更加有 效地诱导抗原特异性免疫应答。此外，即使出现了使E6和E7的一些核酸 序列缺失以避免致癌性的突变，也可有效诱导免疫应答。在具体实施方式
中，在SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 13中，描述了最优化和突变密码子 的HPV16 E6和E7或者HPV18 E6和E7融合的E6/E7融合多肽的核酸序 列。此外，与E6/E7融合多肽单独表达相比，E6/E7融合多肽与由分泌信 号序列产生的信号肽以及免疫增强肽的共表达提高抗原特异性免疫应答 的效率，并且抑制肿瘤的大小和发生。
以在宿主细胞中适于表达编码本发明的融合蛋白的核酸的形式，本发 明的重组载体可包含编码融合蛋白的核酸。就是说，本发明的重组载体包 括至少一个基于宿主细胞选择的用于表达的调控序列，并且将调控序列与 要表达的核酸序列有效连接。表述"有效连接"指将核苦酸序列与调控 序列连接以表达(例如，在体外转录/翻译系统中或者在宿主细胞中)。术语 "调控序列"包括启动子、增强子及其他调控元件(例如多腺苦酸化信号)。 调控序列包括在许多宿主细胞中定向组成型表达目的核酸的调控序列和仅在特异性宿主细胞中定向表达目的核酸的调控序列(例如组织特异性调 控序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可根据如要转化的宿 主细胞的选择和目的蛋白的表达水平的因素而改变。本发明的表达载体可 引入宿主细胞中以表达融合蛋白。
例如，本发明的载体可通过标准重组DNA技术制备，并且标准重组 DNA技术包括，例如，平端和粘端连接，用限制酶处理以提供适当的末 端，通过用碱性磷酸酶处理除去磷酸基以避免非特异性结合，以及通过 T4 DNA连接酶酶连接。通过化学合成方法或遗传工程技术制得的编码信 号肽、人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽和免疫增强肽的各DNA可与包 含适合调控序列的载体重组以提供本发明的载体。包含调控序列的载体可 商购或制备，并且在本发明中，其使用pGX10而制备，该载体为在第 2003-47667号韩国专利申请公开中披露的用于制备疫苗的载体。
本发明的还一实施方式涉及包含所述核酸序列的重组载体，所述核酸 序列编码SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13的E6/E7多核香酸，其具有密 码子最优化和编码一些氨基酸的核酸的替换。
包含本发明的SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13的核酸序列的重组载 体可进一步包含分泌信号序列和编码免疫增强肽的氨基酸序列。分泌信号 序列的实例包括tPA、 HSV、 gDs和生长激素的分泌信号序列，优选在如 哺乳动物的高等真核生物中所用的分泌信号序列，并且更优选tPa (组织型 纤溶酶原激活物)。编码免疫增强肽的上述序列的实例包括编码CD40配 体、Flt3配体、鞭毛蛋白和OX40的氨基酸序列。至少一种免疫增强肽可 使用选自上述所列的肽，且优选可选择单独使用所述肽。在本发明的具体 实施方式中，CD40配体和Flt3配体单独或组合使用。此外，分泌信号序 列和编码免疫增强肽的核酸序列优选用在宿主细胞中具有高表达频率的 密码子替换。在具体实施方式
中，tPa包含SEQ ID NO: 1的核酸序列，Flt3配体包含SEQ ID NO: 15的核酸序列，以及CD40配体包含SEQ ID NO: 17 的核酸序列。
另 一 实施方式中，本发明的重组载体可用于制备本发明的融合蛋白， 作为基因治疗的基因转移的载体，或者作为向受试者施用的药物活性成 分。
本发明的还一实施方式涉及在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤 病毒引起的疾病的药物组合物，该药物组合物包含本发明的融合蛋白和可 药用载体。本发明中，受试者的实例包括如人、猴和鼠的哺乳动物，但不 限于此。由病毒引起的疾病的实例包括子宫颈癌、尖锐湿疣和瘰粒。
本发明的组合物中所用的可药用载体的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、 山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钩、硅酸4丐、 纤维素、曱基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯曱酸曱 酯、羟基苯曱酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。该组合物可额外包含润 滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
本发明的组合物可通过包括静脉内、肌内、经口、经皮、经皮肤、鼻 内、气管内和皮下施用的任何各种途径向受试者施用，但不限于此。本发 明的组合物可通过施用组合物至体外培养细胞中然后施用该培养细胞至 受试者体内而间接向受试者施用。本发明的组合物可系统地或局部地施 用。
本发明的组合物可制成包括但不限于粒剂、粉剂、溶液、片剂、胶嚢、 干糖浆剂等的口服给药剂型，或者包括血管注射剂的非肠道给药剂型。本 发明的组合物优选以溶液或血管注射剂的给药剂型。
本发明的融合蛋白作为活性成分的有效量可在约0.05~500 mg/kg体 重，优选0.5 50 mg/kg体重的范围内，并且可以单次剂量或分^f分剂量施用。 然而，应当理解，施用活性成分的量应根据包括治疗条件、患者的年龄和体重以及患者症状的严重程度的各种相关因素确定；并因此以上剂量不应 以任何方式用来限制本发明的范围。
本发明的还一实施方式涉及在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤 病毒引起的疾病的药物组合物，该药物组合物包含本发明的重组载体和可 药用载体。本发明中，受试者的实例包括如人、猴和鼠的哺乳动物，但不 限于此。由病毒引起的疾病的实例包括子宫颈癌、尖锐湿疣和瘰粒。
本发明的组合物中所用的可药用载体的实例包括乳糖、右旋糖、蔑糖、 山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸4丐、硅酸4丐、 纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯曱酸曱 酯、羟基苯曱酸丙酯、滑石、硬脂S吏镁和矿物油。该组合物可额外包含润 滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
本发明的组合物可通过包括静脉内、肌内、经口、经皮、经皮肤、鼻 内、气管内和皮下施用的任何各种途径向受试者施用，但不限于此。本发 明的组合物可通过施用组合物至体外培养细胞中然后施用该培养细胞至 受试者体内而间接向受试者施用。本发明的组合物可系统地或局部地施用。
本发明的组合物可制成包括但不限于粒剂、粉剂、溶液、片剂、胶嚢、 干糖浆剂等的口服给药剂型，或者包括血管注射剂的非肠道给药剂型。本 发明的组合物优选以溶液或血管注射剂的给药剂型。
本发明的融合蛋白作为活性成分的有效量可在约0.05~500 mg/kg体 重，优选0.5~50 mg/kg体重的范围内，并且可以单次剂量或分份剂量施用。 然而，应当理解，施用活性成分的量应根据包括治疗条件、患者的年龄和 体重以及患者症状的严重程度的各种相关因素确定；并因此以上剂量不应 以任何方式用来限制本发明的范围。本发明的还一实施方式涉及用于在受试者中治疗由人乳头瘤病毒引 起的疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组 合物的步骤。
本发明的药物组合物、该组合物的功效、施用方式和施用量如上所述。 本发明的方法中，受试者的实例包括如人、猴、鼠、猪、母牛和兔的哺乳 动物，但不限于此。
在下文，将参照实施例描述本发明。但是，提供的实施例仅用来说明 本发明，并且本发明的范围并不限于实施例。 实施例
实施例1: pGX 10/tE67c° DNA的构建 本发明的实施例中所用缩写的定义如下 "Co"表示最优化密码子的核酸序列；"tPa，，或"t"表示组织型纤溶 酶原激活物的分泌信号序列；"F，，表示Flt3配体；以及"L，，表示CD40配体。
化学合成包含SEQIDNO: 1的核酸序列的最优化密码子的tPa分泌信 号序列。向末端加入EcoRI-KpnI (5')和Eco47III-Nhel (3')位点。化学合成 包含SEQ ID NO: 7的核酸序列的最优化密码子的HPV16E6E7，向末端加 入Eco47III-Nhel(5')和AscI-XhoI(3')位点以便于插入到载体中。此外，向 E6和E7的接头加入BamHI位点。为了排除由致癌性引起的性质，在E6 中，用甘氨酸替换第63位密码子(半胱氨酸)；并且用指示甘氨酸的密码子 替换第106位密码子(半胱氨酸)(SEQIDNO:3)。在E7中，用甘氨酸替换 第24位密码子(半胱氨酸)；并且用指示甘氨酸的密码子替换第26位密码 子(谷氨酰胺)(SEQ ID NO: 5)。用EcoRI与Nhel酶处理用于制备DNA疫 苗的载体，pGX10(第2003-0047667号韩国专利申请公开)，从而使用连接酶连接合成的分泌信号序列tPa。使用Nhel与Xhol酶酶切生成物以使用 连4妄酶连接HPV16E6E7， /人而制备pGX10/tE67c°。 实施例2: pGX10/tFc°E67G°DNA的构建
以连接的形式化学合成包含SEQ ID NO: 1的核酸序列的最优化密码 子的tPa分泌信号序列和包含SEQ ID NO: 15的核酸序列的最优化密码子 的Flt3L。向末端加入Kpnl(5')与EcoRV(3')位点以便于插入到载体中。用 Kpnl与Eco47IH酶处理实施例1中制备的pGX10/tE67c°，并且仅除去分 泌信号序列tPa。然后，使用连接酶连接tFC。以制备pGX10/tFC。E67C。。
实施例3: pGX10/tE67c°Lc°DNA的构建
化学合成包含SEQ ID NO: 17的核酸序列的最优化密码子的CD40L。 向末端加入Ascl (5')和Xhol (3')位点以便于插入到载体中。用Ascl与Xhol 酶处理实施例1中制备的pGX10/tE67c°，并且使用连接酶连接CD40LC° 以制备pGX10/tE67c°Lc°。
实施例4: pGX10/tE67c°、 pGX10/tFC。E67C。和pGX10/tE67C。LC。预防子 宫颈癌的作用的证实
为了证实pGX10/tE67c°, pGX10/tFc°E67Cc^p pGX10/tE67c°Lc°预防子 宫颈癌的作用，将其每隔三周两次以50吗的量分别肌内注射至C57BL/6 小鼠中，以及在同样的间隔以相同的量将pGXIO 、 pGX10/E6c° 、 pGX10/E7c°、 pGX 10/E67c°和pGX 10/E67肌内注射作为对照组。在最初肌 内注射之后的6.5周取出小鼠的脾，并且将1 x 106个细胞与IL-2及E6或 E7 CD8 T细月包表^f立(E6格57; EVYDFAFRDL, E749.57; RAHYNIVTF， Peptron, Korea)—起置于已用50 pL的3吗/ml的抗鼠IFN-y抗体(BD Pharmingen, Sandiego， CA)包被的平板。在37。C和5% C02的培养箱(Forma, Minnesota, CA)中培养24小时。用PBST洗涤该平板，然后向其中加入50 |iL含有2 |ag/mL悬垂生物素的IFN-y才企测抗体(BD Pharmingen, Sandiego, CA)，并且将其在环境温度下培养约3小时。其后，将其用PBST洗涤，并且将50 (iL 已稀释至1:2000的链霉抗生物素蛋白-AKP (碱性磷酸酶)加入其中，并且 在环境温度下培养该生成物1小时。将其用PBST洗涤，然后向该生成物 中加入50 的在10 mL碱性磷酸盐緩沖液中的66 jaL NBT (Promega， Madison， WT)与33 BCIP (Promega, Madison， WT)的混合物以使其相互 反应。为了通过反应得到清楚颜色的呈现，将产物置于37。C的培养箱中大 约30分钟，且用蒸馏水(D. W)洗涤，并且通过计数器对产生的斑点计数 (见图1和2)。
利用ELISPOT使用E6 CD8 T细胞表位和E7 CD8 T细胞表位测量 E6/E7-特异性T细胞免疫应答，结果是，发现pGX10/E67C。比pGX10/E67 诱导更高程度的抗原特异性免疫应答，这说明密码子最优化对增强抗原特 异性免疫应答更加有效。进一步，发现pGX10/tE67C。比pGX10/E67C。诱导 更高程度的CD8 T细胞免疫应答，这说明分泌信号序列，tPa，对改进抗 原特异性免疫应答也是有效的。进一步，发现pGX10/tE67"L"比 pGX10/tE67"诱导较低程度的E6特异性免疫应答，但与其他对照组相比， 诱导基本相同程度的E7特异性应答，这说明其对增强免疫应答是有效的。 已证实，pGX10/tFE67"对E6和E7特异性免疫应答的诱导是最有效的。
在最初注射之后的6.5周，将表达HPV16 E6和E7的肺瘤细胞TC-1 以5 x 105个细胞皮下注射至受试者中，并且测量肺瘤细胞体积的增加(见 图3)。特别是，在E6和E7特异性免疫应答中，与E6"和E7"各自相比， 融合产物，E67"诱导较低程度的免疫应答(见图1和2)，但对注射的TC-1 肿瘤细胞呈现出较高的抗癌作用。这说明，因为E67融合产物能够针对两 种肺瘤抗原E6和E7同时诱导免疫应答，而不是单独针对其一(即使该应 答很强)诱导免疫应答，所以其具有较好的抗癌作用。已观察到注射胂瘤 细胞后直到24天为止在已一皮注射了 pGX10/ffi67c°、 pGX10/tFc°E67c。和pGX10/tE67G°Le°的小鼠中未出现肿瘤，但在其他对照组中，注射肿瘤细 胞后从第9天的时间点肿瘤体积急剧增力口。因此，可以证实，pGX10/tE67C。、 pGX10/tFG。E67"和pGX10/tE67"L"具有较高的预防子宫颈癌的能力。
实施例5: pGX10/tE67c°、 pGX10/tFc°E67c°、 pGX10/tE67c。Lc°的子宫 颈癌的治疗作用的证实
为了证实pGX10/tE67C。、pGX10/tFC。E67C。和pGX10/tE67c°Lc°的子宫 颈癌的治疗作用，将TC-1肺瘤细胞以5 x 105个细胞分别皮下注射至 C57BL/6小鼠中，并且进一步在最初注射TC-1肿瘤细胞之后的第3天和 第8天以50吗的量肌肉注射。从注射肺瘤细胞的当天(第0天)起，到第 21天观察肿块体积的改变，并且在第22天取出小鼠的脾，并且以与实施 例4中所述的相同方式(ELISPOT)测量CD8 T细胞免疫应答(对E6和E7 抗原特异)的诱导程度。与作为对照组的pGX10相比，在用pGX10/tE67"、 pGX 10/tFc°E67c°和pGX 10/tE67c°Lc°处理的小鼠中诱导较高程度的抗原特 异性免疫应答，特别是，在用pGX10/tF"E67C。处理的小鼠中测量出最高 程度的免疫应答，这说明pGX10/tF"E67e。对诱导抗癌免疫应答具有高功 效(见图4和5)。
已发现，与作为对照组的用pGX10处理的小鼠相比，已用针对TC-1 肿瘤细胞的pGX10/tE67c°、 pGX10/tFC。E67C。和pGX10/tE67C。LC。免疫处理 过的小鼠的肿瘤体积显示了明显减小。此外，还发现，直到在注射肿瘤细 胞后的第12天肿瘤体积不断增大，然后该体积开始减小，特别是，发现 在已用pGX10/tFC。E67C。和pGX10/tE67C。LC。免疫处理的小鼠中，肿瘤体积 在第21天基本为零，这说明其具有子宫颈癌的治疗作用(见图6)。
权利要求
1、一种用于受试者的融合蛋白，该融合蛋白包括人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽、用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽和免疫增强肽。
2、 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述E6和E7融合多肽 源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)或18型人乳头瘤病毒(HPV18)。
3、 根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述E6和E7融合多肽 为SEQIDNO:8所述。
4、 根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述E6和E7融合多肽 为SEQIDNO: 14所述。
5、 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述信号肽为tPa、 HSV gDs或生长激素的分泌信号肽。
6、 根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述tPa为SEQIDNO:2所述。
7、 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述免疫增强肽为CD40 配体、Flt3配体、鞭毛蛋白或OX40。
8、 根据权利要求7所述的融合蛋白，其中，所述Flt3配体为SEQ ID NO: 16所述。
9、 根据权利要求7所述的融合蛋白，其中，所述CD40配体为SEQ ID NO: 18所述。
10、 编码权利要求1的融合蛋白的多核苷酸。
11、 根据权利要求10所述的多核苦酸，其中，编码E6和E7融合多 肽的序列源于16型人乳头瘤病毒(HPV16)或18型人乳头瘤病毒(HPV18)。
12、 根据权利要求11所述的多核普酸，其中，用哺乳动物的最优化 密码子修饰所述编码E6和E7融合多肽的序列，以提高基因表达率。
13、 根据权利要求12所述的多核苷酸，其中，所述E6和E7融合多 肽包含如SEQ ID NO: 8所述的氨基S交序列。
14、 根据权利要求12所述的多核芬酸，其中，所述E6和E7融合多 肽包含如SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列。
15、 根据权利要求10所述的多核苦酸，其中，所述信号肽为tPa、 HSV gDs或生长激素的分泌信号肽。
16、 根据权利要求15所述的多核苷酸，其中，用哺乳动物的最优化 密码子修饰编码所述信号肽的序列，以提高基因表达率。
17、 根据权利要求16所述的多核苷酸，其中，所述tPa包含如SEQID NO:2所述的氨基酸序列。
18、 根据权利要求IO所述的多核苦酸，其中，所述免疫增强肽为CD40 配体、Flt3配体、鞭毛蛋白或OX40。
19、 根据权利要求18所述的多核苦酸，其中，用哺乳动物的最优化 密码子修饰编码所述免疫增强肽的序列，以提高基因表达率。
20、 根据权利要求19所述的多核苦酸，其中，所述Flt3配体包含如 SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
21、 根据权利要求19所述的多核苦酸，其中，所述CD40配体包含 如SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列。
22、 包含权利要求20或21的多核苷酸的重组载体。
23、 包含如SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13所述的核酸序列的重组 载体。
24、 根据权利要求23所述的载体，其进一步包含分泌信号序列和编 码免疫增强肽的序列。
25、 根据权利要求24所述的载体，其中，所述分泌信号序列为tPa、 HSV、 gDs或生长激素的分泌信号序列。
26、 根据权利要求25所述的载体，其中，所述分泌信号序列为最优 化密码子。
27、 根据权利要求26所述的载体，其中，所述tPa为SEQ ID NO: 1所述。
28、 根据权利要求24所述的载体，其中，所述免疫增强肽为CD40 配体、Flt3配体、鞭毛蛋白或OX40。
29、 根据权利要求28所述的载体，其中，所述序列为最优化密码子。
30、 根据权利要求29所述的载体，其中，所述Flt3配体为SEQ ID NO: 15所述。
31、 根据权利要求29所述的载体，其中，所述CD40配体为SEQID NO: 17所述。
32、 用权利要求22的载体转化的宿主细胞。
33、 用权利要求23的载体转化的宿主细胞。
34、 一种在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药 物组合物，该药物组合物包含权利要求1的融合蛋白和可药用载体。
35、 根据权利要求34所述的组合物，其中，所述疾病是子宫颈癌。
36、 一种在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药 物组合物，该药物组合物包含权利要求22的载体和可药用载体。
37、 根据权利要求36所述的组合物，其中，所述疾病是子宫颈癌。
38、 一种在受试者中用于治疗和预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的药 物组合物，该药物组合物包含权利要求23的载体和可药用载体。
39、 根据权利要求38所述的组合物，其中，所述疾病是子宫颈癌。
40、 一种在受试者中用于治疗或预防由人乳头瘤病毒引起的疾病的方 法，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求34、 36或38的任一项所述 的药物组合物的步骤。
41、 根据权利要求40所述的方法，其中，所述疾病是子宫颈癌。
全文摘要
本发明涉及一种用于受试者的包括人乳头瘤病毒的E6和E7融合多肽、用于使多肽分泌到细胞外面的信号肽和免疫增强肽的融合蛋白；编码所述融合蛋白的多核苷酸；以及包含所述多核苷酸的载体。本发明还涉及包含所述融合蛋白或载体的药物组合物；以及使用所述药物组合物治疗由人乳头瘤病毒引起的疾病的方法。
文档编号C07K19/00GK101421306SQ200680054273
公开日2009年4月29日 申请日期2006年4月19日 优先权日2006年4月19日
发明者延济仁, 徐相焕, 成永喆, 朴常勋, 陈炫卓 申请人:学校法人浦项工科大学校;格纳西尼有限公司