专利名称：一种用于男性免疫避孕的多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术，具体涉及免疫避孕技术，尤其是男性免疫避孕技术。
背景技术：
目前，男性避孕可选方法少，不能很好地满足很多男性愿意参与避孕的热情(参 见Hoesl et al. ， 2005)，免疫避孕由于多方面的优点而被研究者们关注和研究。但总体上 看来，目前还没有一种理想的免疫避孕制剂，主要包括以下方面不足①避孕药物不同于疾 病治疗药物，人们对避孕药物效果的要求是接近100%。而就目前所研究的靶点来看，单独 针对一种抗原进行免疫避孕，最高有效率(完全不孕或不育)为80%左右，还不够理想(刘 以训，2004);②以一些在各组织广泛表达的抗原为靶点产生的抗体，会产生一些毒副作用。 所以，要研发免疫避孕制剂并被人们所接受，提高免疫避孕的避孕效果并减少其可能的毒 副反应是很有必要的。目前，研究者们主要从两方面来解决免疫避孕的这些不足从免疫技 术和途径等方面着手，致力于提高免疫对生殖的干扰作用并避免或减轻其毒副作用；另一 方面则是寻找避孕效果好而毒副作用小的新靶点。
目前用于免疫避孕研究的靶点主要有三大类
①激素(Delves， 2004)，如P -HCG， LHRH， GnRH等； ②精子特异性抗原(Frayne and Hall， 2004)，如fertilization antigen-1， sperm protein (SP)_10， SP_17， sperm-associated antigen 9， protein A_kinase anchoring protein, testis-specific antigen— l等； ③卵子透明带抗原(zona pellucida， ZP) (Gupta et al. ， 2004)，该抗原用于免疫
避孕研究较多，目前主要在确定效果更好而副作用小的B细胞表位，提高免疫避孕的效果等。 精子特异性抗原是免疫避孕的一类靶点，尤其是在精子生理功能中起重要作用的 膜蛋白。CatSperl是精子尾部主要钙离子流IeatSpCT的通道，与精子运动密切相关，是超活化 所必需的，并在受精的多个环节起作用，对该靶点进行免疫避孕，应该有很好的避孕效果； 而且CatSperl仅表达于睾丸和精子，其毒副作用比促性腺激素类及其他广泛表达的抗原 靶点要小。 尽管目前已经有一些避孕方法可供选用，但世界人口增长的趋势仍在继续，现已 经超过65亿(World POPClock Projection, online available from URL :http: //www-census, gov/main/www/卿clock. html/),并按10亿/10年的速度在增长，其中95%的人 口增长在发展中国家，人口的迅猛增长造成了许多难以克服的生态学、经济学问题(Naz et al. ，2005)。我国人口约占世界人口的21%，人口过多仍是首要问题，成为制约国民经济和 社会发展、安全的关键问题(刘以训，2004)。计划生育工作艰巨而重要，"控制人口数量，提 高人口素质"是我国的一项基本国策。另外，不管在哪个国家，在当前的避孕方法和条件下， 非意愿妊娠对人类健康和经济的损害仍是不可忽视的问题。全世界每天约有91万次受孕 发生，其中50%是未计划的，有15万例以堕胎而告终，其中有500例堕胎妇女以死亡为代价
3(郭应禄，钟辛成，2002)。所以，不管是发达国家，还是发展中国家，都需要一种很好有效的 避孕方法。寻找新的避孕途径及方法，尤其是男性避孕，既是目前国内外避孕研究的关键与 发展趋势，在我国也有很大的社会意义和价值。 免疫避孕是以在精子发生、受精、着床等过程中起重要作用的物质(多为蛋白或 多肽)为抗原，免疫产生相应抗体后通过干扰生殖过程用于避孕的方法。印度已有避孕疫 苗通过临床实验，也表明了免疫避孕用于避孕的实际可行性。而且，免疫避孕除了具备避孕 的基本条件外，如作用可逆，使用方便等，还有着较好的优势和发展前景①可能是女用，也 可以是男用。现存的男子避孕方法非常有限，目前已有的可行途径有输精管结扎术和使用 避孕套。而避孕是男女双方共同的责任，男子不仅仅能与配偶分享利益，也应该共同承担计 划生育的风险。近来公众对男子参与避孕的兴趣显著提高，有相当比例的成年男性有参与 避孕的热情(郭应禄，钟辛成，2002)。②一次免疫的避孕作用时间比现在常用的避孕药物 长，所以使用间隔时间较长，不需要很频繁的使用，更容易被人们所接受。DNA疫苗的成功研 制更是能延长免疫避孕的使用间隔时间。③体内的免疫反应能用简单可靠的检测方法来监 测。④免疫避孕不仅可用于人类的计划生育，还能用于控制动物的数量。如欧洲兔子和澳 大利亚赤狐的数量控制。⑤国内外近期的研究如嵌合肽、DNA疫苗、利用新的分子佐剂(如 C3d)等的研究，成功解决了免疫避孕中的一些缺陷，我国在这些方面都有成功的经验可以 借鉴。 但是，目前免疫避孕还存在一些不足之处。最受关注的就是免疫避孕的有效率，单 独针对一种抗原进行免疫避孕，目前最高有效率(完全不孕或不育)为80%左右，还不够理 想(刘以训，2004)。而且，目前免疫避孕的靶点，尤其是被证实在体内有较好避孕效果的靶 点很少(刘以训，2004)。所以，研究新的、效果好而副作用小的免疫避孕靶点是免疫避孕研 究的一大趋势。 CatSperl与精子运动直接相关，是精子超活化及穿过透明带所必需的；也是雄性 生育所必需的钙离子通道，敲除CatSperl的雄性小鼠完全不育(Ren et al. ，2001 ;Calson etal. ，2003)。研究(Kirichok et al. ，2006)表明，CatSperl是精子尾部的主要f丐离子流 的通道，CatSperl基因敲除小鼠精子尾部的主要钙离子流消失，所以这种钙离子流被命名 为Lc，这种钙离子流也是精子超活化运动所必需的。②特异性表达于睾丸组织和成熟精 子尾部主段，在其他器官没有发现表达。正由于CatSperl这两大特点，CatSperl在被克隆 时被命名为"cation channel of sperm"，意为"精子特异性阳离子通道"。也是基于这两大 特点，有关CatSperl的研究几乎都提出了以下诱人的研究前景是开发副作用小而有效的 避孕药具的耙点，而且这种避孕药具可以是男性使用，也可能是女性使用。CatSperl基因敲 除小鼠的研究结果更支持了这一观点精子尾部的钙离子流I^^r消失(Kirichok etal.， 2006)，精子活力差，获能后无"鞭打"样运动，丧失穿过透明带的能力，完全不育；且其他系 统未见异常，睾丸组织无病理改变，有精子发生，精子中其他已知钙离子通道分布也未受影 响。 但如何以CatSperl为靶点进行避孕呢？目前尚未见报道，也没有特异性的拮抗 剂，近期的研究(Kirichok et al. ， 2006)表明L型钙离子通道拮抗剂如尼莫地平、硝苯 地平等对CatSperl的功能并无明显的阻断作用。作为在精子功能及精卵结合方面起重 要作用，且定位于精子膜上的精子特异性抗原，我们推测免疫避孕可能成为可行有效的途径。虽然目前还未见以精子离子通道进行免疫避孕的报道(主要有两个方面原因一方面 是由于精子的形状和运动性，使常用的研究离子通道的方法不便使用；另一方面则是目前 所发现的离子通道中，被敲除后能致动物完全不育的离子通道罕见)，但离子通道自身免疫 性疾病(Langand Vincent, 2003)却表明，用针对离子通道的抗体阻断其功能是有效可行 的。如神经突触前抗钾离子通道自身抗体引起神经性肌强直(NMT)，抗钙离子通道自身抗 体引起朗-爱二氏肌无力综合症(LEMS)，肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)，心肌病等。基于 CatSperl在精子功能中的特殊作用及其表达的高度特异性，免疫避孕的实际可行性，结合 免疫避孕的发展趋势，本发明试验观察抗CatSperl跨膜区及胞外段的抗体在体外对人精 子功能和小鼠精子体外授精能力的影响，探讨CatSperl跨膜区及胞外段用于免疫避孕的 可能性。
发明内容
本发明的任务是提供一种用于男性免疫避孕的多肽。
实现本发明的技术方案是 本发明提供的这种用于男性免疫避孕的多肽，具有序列表中序列1所示的氨基酸
序列，或为与序列表中序列1所示氨基酸序列有79%以上同源性的氨基酸序列。 序列表中序列1所示的氨基酸序列序，或与序列表中序列1所示氨基酸序列有
79%以上同源性的氨基酸序列，配以制药学上可接受的佐剂，即为用于男性免疫避孕的药
物制剂.3本发明实验资料一、材料与方法(一)试剂抗CatSperl多克隆抗体3Santa Cruze (CA， USA)FITC标记羊抗兔IgGSanta Cruze (CA， USA)Ham z s F-10Biosource(CA， USA)SpermRinseVitrolife(AB， Sweden)IVF-30Vitrolife(AB， Sweden)孕马血清(PMSG)杭州动物药品厂(杭州，中国)人促绒毛膜性腺激素(HCG)杭州动物药品厂(杭州，中国)矿物油Sigma (St. Louis， USA)考马斯亮蓝G250Sigma (St. Louis， USA)叠氮钠Sigma (St. Louis， USA)PBS(O. 01M， pH 7. 4)自备(与抗CatSperl多克隆抗体的储存液相同pH 7.4，含0. 1%叠氮钠和0. 1%明胶)0. 22%考马斯亮蓝G250溶液自备称取0. 22g考马斯亮兰G250颗粒，加入100ml 3.5% (V/V)的高氯酸水溶液中，混匀溶解，过滤，备用a :抗体编号为SC-33153,免疫动物所用抗原为人CatSperl的跨膜区及胞外段(481 780aa)，见图l，抗体能与人和鼠的CatSperl结合
(二)主要仪器低速自动平衡离心机(LDZ5-2型) 北京医用离心机厂5
5% C02培养箱(MC0-15AC型)日本三洋公司恒温水浴箱(DK-S22型)上海精宏实验设备厂操净工作台(FLC-3型)哈尔滨市东联公司计算机辅助精液分析系统北京伟力新世纪科技发展有限公司(JY9000型)电子天平(AE-240型)上海梅特勒_托利多仪器有限公司荧光显微镜(BX-41型)日本奥林巴斯倒置显微镜(XDS-1B型)重庆光电仪器有限公司解剖显微镜(SZll型)日本奥林巴斯解剖显微镜(SZ-1145型)日本奥林巴斯(三)实验对象1.精液标本人精液标本均取自同济医学院附属同济医院生殖医学中心，按世界卫生组织标准(WHO, 1999)选取正常精液标本。
2.实验动物 本实验选用10 12周龄的雌雄性BALB/c小鼠，雄鼠体重26士3g，雌鼠体重 21±2g。购自湖北省卫生防疫站动物中心，分笼饲养。动物自由摄食饮水，控制动物房温度 20 25t:，按白天/黑夜各12h的规律予以日光灯照明。 [OO51](四)实验方法 1.抗CatSperl多克隆抗体与人、小鼠精子结合特异性观察 小鼠精子取自12周龄雄性BALB/c小鼠附睾尾部取附睾尾部置生理盐水中洗涤 后放入lml 37"预热的SpermRinse中，无菌眼科剪纵向剪2_3下，置37°C ， 5% C02培养箱 中孵育15min使精子游出。 人精子和小鼠精子4%中性甲醛固定30min后涂片，间接荧光免疫组织化学方法 观察抗CatSperl多克隆抗体与人、小鼠精子结合的特异性，一抗浓度为1 : 200。
2.人精子优化(上游法) 精液37t:液化30min后，参照文献(WHO， 1999)用上游法优化精子。操作在操净工 作台上进行(室温25 30°C )，主要步骤为 (1)在液化精液中加入等体积37t:预热的Ham' s F_10，用一次性巴斯德(无菌) 吸管充分混匀； (2)室温500g离心15min ; (3)弃上清，留约为沉淀3倍液体； (4)用200 iil吸头反复吹打，充分混匀沉淀； (5)取300iU已混匀沉淀置一 10ml尖低离心管底部，沿管壁缓慢加入1.5ml 37t:预热的SpermRinse ; (6)将离心管缓慢斜放于一烧杯内(离心管与水平面成45。角)，小心将烧杯放入 5% C02培养箱内； (7)45-60min后小心拿出烧杯，取交界处云雾状部分即为优化精子； (8)用计算机辅助精液分析系统分析(带37t:保温台)优化精子的活力(即WHO定义的a+b级精子)和密度，在本试验中，要求优化精子活力大于70%，并用37t:预热的SpermRinse调整密度为5 10个/高倍(目镜40X)视野。
3.人精子体外培养及处理 在两EP管中加入等体积的优化精子，每管50-100 iU，再分别加入等体积的抗CatSperl多克隆抗体(终浓度为50 y g/ml，浓度由预实验确定)和0. 01M PBS(与抗CatSperl多克隆抗体的储存液相同；pH 7. 4，含0. 1 %叠氮钠和0. 1 %明胶)，分别定为抗CatSperl多克隆抗体处理组和对照组。在EP管盖上用无菌眼科剪尖扎一小孔，EP管放入37 °C ， 5 % C02培养箱内培养。
4.精子功能检测 精子凝集抗CatSperl多克隆抗体处理组和对照组精子体外培养2h后，轻轻摇动EP管，取8 ill置载玻片上，盖上盖玻片(18mmX 18mm)，在普通光学显微镜下观察有无精子凝集发生。 精子活力抗CatSperl多克隆抗体处理组和对照组精子体外培养lh、2h、4h后，用10 吸头轻轻吹打混匀精子悬液，取8 置载玻片上(37°C预热)，盖上盖玻片(18mmX 18mm)，用计算机辅助精液分析系统(带37。C保温台)分析精子活力(即WHO定义的a+b级精子)。 精子超活化运动参数抗CatSperl多克隆抗体处理组和对照组精子体外培养5h后，用lOiU吸头轻轻吹打混匀精子悬液，取5iU置一新的EP管中，用37t:预热的SpermRinse调整密度为1 2个/高倍(40X)视野。将计算机辅助精液分析系统物镜调为40X ，随机选取视野并捕获单个前向运动精子，分析其超活化运动参数，包括曲线速度(curvilinearvelocity， V(X)，直线速度(straight progressive velocity, VSU禾口平均路径速度(average path velocity, VAP) ， VSL与VAP的比值即为前向性(straightnessoftrajectory， STR)。每例标本获取20 30个精子的超活化运动参数，参照文献(Quillet al. ，2003)比较精子超活化运动参数的变化超活化运动精子的VCL和STR值分别定义为已液化而未进行上游的精子的第90X和第10X分位数值，这些精子用Ham' s F-IO洗涤后重悬于37t:预热的SpermRinse中，立即同以上方法检测精子的超活化运动参数。以VCL为纵作标，以STR为横作标，将各个精子的超活化运动参数做成散点图。以所定义的VCL和STR值确定各组超活化运动的精子数。 顶体反应抗CatSperl多克隆抗体处理组和对照组精子体外培养5h后，用10吸头轻轻吹打混匀精子悬液，取10iU精子悬液滴于载玻片上涂片晾干，用0. 22%考马斯亮兰G250染液浸染至少30min，双蒸水冲洗，晾干，高倍镜(目镜40X)下完整视野计数至少200个精子。精子顶体反应率计算参照文献(陆海一，等.，2002 ;Sato et al. ，2003)。
5.抗CatSperl多克隆抗体对小鼠精子体外授精能力的影响 间隔48h分别给雌性小鼠腹腔注射PMSG和HCG各10IU/只，于HCG注射后16h取出双侧输卵管于Ham' s F-10液滴内。用无菌针头剌破输卵管，可见卵丘细胞团流出，将细胞团移入已置37t:和5% C02平衡过夜的IVF-30液滴内，在37。C和5% C02条件下孵育30min以使卵丘细胞团散开。将散开的卵细胞分放于IVF-30液滴内(每液滴体积为40 y 1，放入5-8枚卵)，置37°C 、5% C02继续培养，备用。 用37"预热的SpermRinse调整小鼠附睾尾部精子密度为50 100 X 106个/ml。悬液根据精子是否经抗CatSperl多克隆抗体预处理分为两组(各30 yl):抗CatSperl多克隆抗体处理组的精子加入抗CatSperl多克隆抗体(终浓度50 y g/ml)，对照组的精子加入等体积0.01M PBS (与抗CatSperl多克隆抗体的储存液相同pH 7.4，含0. 1%叠氮钠和0. 1 %明胶)，于37°C 、5% C02条件下共孵育90min。从两组精子悬液中各取5 y 1加入含卵细胞的IVF-30液滴内，继续置培养箱中培养。24h后分别计数两组的受精卵数目。
卵细胞受精标准卵内有双原核；卵周隙有两个极体；或者见卵裂迹象。
6.统计学分析 活力及顶体反应数据以;ks表示，进行方差齐性检验，用配对t检验分析；体外受精试验结果及超活化运动精子数量用x2检验比较。所有统计结果以P < 0. 05(双侧)为差异有显著性。
二、结果 —、抗CatSperl多克隆抗体与人、小鼠精子结合特异性 本发明实验所用的抗CatSperl多克隆抗体(SC-33153,克隆号H300)是以人CatSperl蛋白靠近C端的481 780氨基酸为抗原，见图l。 Santa Cruze公司提供的说明书介绍该抗体也能与小鼠、大鼠的CatSperl结合。本实验结果证实了这一点，该抗体与人和小鼠精子均结合于精子尾部主段，未发现非特异性结合，见图2。
二、抗CatSperl多克隆抗体对人精子功能的影响 精子凝集抗CatSperl多克隆抗体组和对照组精子体外培养2h后，显微镜下无精子凝集发生。 精子活力经上游法优化精子，与50 g/ml抗CatSperl多克隆抗体共孵育，lh后精子活力(即WHO定义的a+b级精子)即有显著下降，见图3a，经配对t检验统计分析，精子与50 g/ml抗CatSperl多克隆抗体共孵育lh、2h、4h后，活力下降，与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0. 005，见图3a)，且活力的降低主要表现为a级精子即快速前向运动精子减少，与对照组相比，各时间点的差异均有显著性意义(P < 0. 01或P < 0. 005，见图3b)。
精子超活化运动参数图4显示50 ii g/ml抗CatSperl多克隆抗体与人精子共孵育对精子超活化运动的影响，孵育5h后，超活化运动精子数很少，在所检测的来源于9例标本中的203个a级或b级精子中，仅1个精子运动参数达到所划定的超活化运动标准。对照组共检测了 181个精子，有11个精子运动参数达到超活化运动标准。50 ii g/ml抗CatSperl多克隆抗体对人精子超活化运动有明显的抑制作用(x2检验，P < 0. 05)。见图4
顶体反应50 g/ml抗CatSperl多克隆抗体与人精子共孵育5h后，顶体反应率与对照组差别无显著性意义(11. 7±4. 3vs. 12. 1±4. 0， P = 0. 61)。
三、抗CatSperl多克隆抗体对小鼠精子体外受精能力的影响，见图5。
图5显示两组受精卵与未受精卵数目的比较。其中，在授精前经50iig/ml抗CatSperl多克隆抗体预处理90min，受精率为45. 8% (77/168)，与对照组相(80.4%，123/153)比较，经x2检验，差异有显著性意义(P < 0. 05)。 由于免疫避孕的主要应用还是致力于人口控制，本发明实验首先观察了抗CatSperl抗体体外对人精子功能的影响。CatSperl蛋白在精子中主要位于细胞膜上，其N端和C端被认为是在细胞内的，所以我们选用了针对跨膜区和膜外段的抗体，是活体细胞中抗体所能到达并结合的区域。跨膜区和膜外段是离子通道的重要功能区，根据抗离子通道抗体所引起的自身免疫性疾病患者外周血中抗体所针对的位点研究，针对该区域的抗体能阻断离子通道的功能。 本发明实验结果表明，所用的抗CatSperl抗体体外对人精子功能的影响主要是对前向运动和精子超活化运动的显著性抑制作用，而且这种对精子运动的抑制作用不是由于引起精子凝集而导致的；抗CatSperl抗体体外对人精子顶体反应也没有影响。所以，抗CatSperl抗体在体外对人精子功能的影响是特异性的，而不是广泛地抑制精子的功能，与CatSperl敲除小鼠精子功能缺陷的方面是一致的主要表现为前向运动比野生型差，不能发生超活化运动而丧失授精能力(Ren et al. ，2001 ;Calson et al. ， 2003)。本实验还用荧光免疫组织化学方法观察了我们所选用的抗体与人和小鼠精子的结合部位，结果表明抗体结合在精子尾部主段，与CatSperl在人(Li et al. ，2006)和小鼠(Ren et al. ，2001)精子中的分布是一致的。所以，综合本发明实验所用抗体对人精子功能抑制的表现和抗体与人精子结合的部位，说明本实验所用抗体能特异性结合CatSperl，并能阻断该通道的功能。
本发明实验进一步观察该抗体对小鼠精子授精能力是否有影B向，虽然该抗体所用的抗原是人CatSper 1的跨膜区和膜外段，但小鼠和人CatSper 1在该区域的同源性很高(Ren et al. ，2001):跨膜区有81 %相同，93%相似，孔区有89%相同，100%相似，见图6，图7。 SantaCruze公司所提供的说明书也说明该抗体能与小鼠的CatSperl结合。体外受精实验结果表明，终浓度为50yg/ml的该抗体与小鼠精子体外孵育90min后，能抑制小鼠精子的体外授精能力，抑制率将近35% 。进一步表明针对CatSperl跨膜区和膜外段的抗体可以通过阻断该通道的功能，影响精子功能而抑制精子的体外授精能力，是用于免疫避孕的可选靶点。本发明实验所用的抗体是针对人CatSperl的跨膜区S2-S6、孔区及C末端，由于C末端在细胞内，所以，对于活体细胞，抗体所能接触并起作用的区域是S2-S6和孔区，因此，S2-S6和孔区是免疫避孕的有效部位，本发明实验说明，精子特异性阳离子通道抗原能用于免疫避孕。
图1为人CatSperl蛋白的一级结构及跨膜区、孔区的分布.Sl-S6代表六个跨膜区，P代表孔区，下划线部分(481-780aa)为本实验所用抗CatSperl多克隆抗体所针对的抗原，包括了跨膜区S2-S6及孔区。 图2为抗CatSperl多克隆抗体与人(a，b)、小鼠(e，f)精子的结合。结合于精子尾部主段，无非特异性结合.c， d为阴性对照间接荧光免疫组织化学方法X400
图3为抗CatSperl抗体体外对人精子活力(WHO定义的a+b级，图a)和快速前向运动(WHO定义的a级，图b)的影响.与对照组相比，# :P < 0. 005，* :P < 0. 01 (配对t检验，n = 9) 图4为抗CatSperl抗体(50 y g/ml)体外对人精子超活化运动的影响. 一个点代表一个精子.超活化运动精子的VCL和STR值分别定义为已液化而未进行上游的精子(图a)的第90%和第10%分位数值，在本实验中分别为89. 08和81. 02.图b、c分别为对照组和抗体处理组精子培养5h后精子活化运动情况 图5为抗CatSperl抗体对小鼠精子体外授精能力的影响.与对照组相比，* :P< 0. 05 (x2检验)，图5显示两组受精卵与未受精卵数目的比较。其中，在授精前经50 ii g/
9ml抗CatSperl多克隆抗体预处理90min，受精率为45. 8% (77/168)，与对照组相(80. 4%，123/153)比较，经x2检验，差异有显著性意义(P < 0. 05)。 图6为人和小鼠CatSperl的跨膜区、膜外段的同源性，有底纹氨基酸为相同的氨基酸。 图7为制备抗体所用抗原序列人CatSperl第481 670氨基酸与小鼠相应区域序列的同源性，a为人CatSperl第481 670氨基酸；b为小鼠CatSperl第385 576氨基酸，图中单下划线为跨膜区，双下划线为孔区，字体加粗氨基酸为与人相同的序列，二者的同源性为79. 69%。
具体实施例方式
实施例1 1.目的片段克隆 针对小鼠CatSperl (Genebank accesion number :AF407332)孔区至C末端设计引物，在引物中引入酶切位点。引物序列为 上游弓l物5，-cgctcaca|tatggctcggtacacctttgga-3，(竖线为Ndel酶切位点)；
下游弓l物5， _cgcact|cgagtcacttctgttgatgctgttcta-3，(竖线为Xhol酶切位点)。 PCR扩增PCR体系主要组分终浓度为10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl，2mmol/L MgC12， 200 ii mol/L dNTPs， 0. 5IU高保真DNA聚合酶(大连宝生物公司)，0. 4iimol/L引物，O. 2ii g小鼠cDNA。 94。C预变性8min后进入循环，前5个循环为98°C变性10sec，53。C退火10sec，72。C延伸80sec ;后30个循环为98。C变性10sec，58。C退火10sec，72t:延伸80sec。产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用Invitrogen公司凝胶回收试剂盒回收纯化产物，目的片段长度为1187bp。 产物经Ndel和Xhol双酶切后连入pET28a质粒(Novagen公司)中，用氯化f丐法转化大肠杆菌DH5a ，挑取白色菌落进行鉴定。 挑取白色菌落，用T7通用引物进行PCR鉴定，挑取能扩增出约1250bp的菌落，过夜培养后，以常规快速质粒提取法提取质粒，用Ndel和Xhol (大连宝生物公司)双酶切鉴定，挑取能酶切出1175bp片段的质粒，命名为pET28aCatl，以T7通用引物进行全自动序列测定，测序结果表明克隆到的CatSperlcDNA序列正确。
2.诱导CatSperl表达、鉴定与纯化 将为重组质粒pET28aCatl和空质粒pET28a用氯化钙法分别转化大肠杆菌BL21。常规培养，用lmM IPTG i秀导CatSperl表达，加入IPTG 3h后，室温12000g离心菌液lmin，沉淀悬于1 X SDS上样缓冲液中，沸水浴3min，室温12000g离心lmin，取上清上样于10 %聚丙烯酰胺凝胶，电泳后经考马斯亮蓝染色和Western Blot鉴定。 产物纯化用Novagen公司的镍离子螯合层析柱，按说明书操作纯化表达产物。
3.免疫动物 经纯化蛋白用无菌生理盐水溶解，配制成50ii g/100iU。将每100iU uPA溶液与等体积Santa Cruz公司的福氏佐剂混匀乳化。首次免疫选用福氏完全佐剂，之后加强免疫用福氏不完全佐剂。
动物分组及免疫清洁级正常成年雄性昆明小鼠，体重25士5g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物中心提供。随机分两组，每组12只对照组，皮下多点注射100 生理盐水与等量福氏佐剂乳化液；实验组，皮下多点注射100 纯化蛋白与等量福氏佐剂乳化液。注射每两周一次，共三次，首次免疫使用完全福氏佐剂，后两次使用不完全福氏佐剂。
小鼠免疫三次后饲养一周，以乙醚麻醉后内眦静脉取血，用ELISA法进行抗体效价检测。采用比值法分析小鼠血清抗CatSperl抗体效价。在同一稀释度下，根据公式(实验组0D值-对照组0D值)/ (安慰剂对照组OD值-阴性对照组OD值)进行计算，比值>
2. 1判定为阳性，1. 5 <比值< 2. 1判定为可疑，比值< 1. 5判定为阴性。
4.避孕效果观察 交配实验于雄鼠免疫三次后开始，每日清晨以少量37t:温育后生理盐水对雌鼠进行阴道灌洗细胞涂片，X250倍显微镜下观察，结合外阴外观，判定雌鼠所处发情周期时程。选取处于发情前期与发情期的雌鼠，于晚上7时开始与相应编号雄鼠按照合笼，次日清晨7时检查雌鼠阴栓，未见阴栓者以少量37t:温育后生理盐水行阴道灌洗涂片显微镜下查精子。以雌鼠查见阴栓或镜下见精子判定为交配成功，记录后另笼饲养；合笼雌鼠未见阴栓及精子者继续观察发情周期安排再次合笼。交配成功的雄鼠休息1 2天再安排下次合笼，交配失败的雄鼠可以当日继续安排合笼。合笼四次均失败的雄鼠判定为不育，放弃交配。
雌鼠交配成功后另笼饲养，于交配成功后第l日开始计算，第14日脱颈椎处死，解
剖查看子宫状态和胎仔数目。 实验结果 1.目的片段克隆 重组质粒pET28aCatl，经测序证实克隆到的CatSperlcDNA序列正确。
2. CatSperl表达 重组质粒pET28aCatl转化大肠杆菌BL21后，经常规培养，加入IPTG 3h后，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后经考马斯亮蓝染色，与对照(空质粒pET28a)比较，出现约41kD蛋白条带，Western Blot鉴定为CatSperl 。产物纯化后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳扫描后分析，结果表明，目的产物占95.7%。
3.抗体效价 共做了 1 : 1280、1 : 2560、1 : 5120、1 : 10240四个稀释度，实验组每只小鼠血清在每个稀释度，与对照组0D值比值均大于2. l，即抗CatSperl抗体为阳性，可见实验组每只小鼠血清抗CatSperl抗体效价均达到1 : 10240以上。
4.避孕效果 实验组与对照组交配率均为100%，说明注射及其他处理对雄鼠交配能力无影响。对照组致孕率为100%，平均胎仔数为11，而实验组12只雄鼠中，仅1只雄鼠使1只雌鼠怀孕，胎仔数为13。 以下为人CatSperl第481 670氨基酸序列(序列l)和小鼠CatSperl第385
576氨基酸序列(序列2)的序列表。 序列表 〈110〉华中科技大学 〈120〉精子特异性阳离子通道抗原在免疫避孕中的应用
〈130>1〈160>2〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>190〈212>PRT〈213〉人类〈400>1MetAla LeuAspSerliePhePheCyslieTyrValValGluAlaLeu151015LeuLys lielieAlaLeuGlyLeuSerTyrPhePheAspPheTrpAsn202530AsnLeu AspPhePhelieMetAlaMetAlaValLeuAspPheLeuLeu354045MetGin ThrHisSerPheAlalieTyrHisGinSerLeuPheArglie505560LeuLys ValPheLysSerLeuArgAlaLeuArgAlalieArgValLeu65707580ArgArg LeuSerPheLeuThrSerValGinGluValThrGlyThrLeu859095GlyGin SerLeuProSerlieAlaAlalieLeulieLeuMetPheThr100105110CysLeu PheLeuPheSerAlaValLeuArgAlaLeuPheArgLysSer115120125AspPro LysArgPheGinAsnliePheThrThrliePheThrLeuPhe130135140ThrLeu LeuThrLeuAspAspTrpSerLeulieTyrMetAspSerArg145150155160AlaGin GlyAlaTrpTyrlielieProlieLeulielieTyrlielie165170175lieGin TyrPheliePheLeuAsnLeuVallieThrValLeu180185190〈210>2〈211>192〈212>PRT〈213〉鼠〈400>2MetVal LeuAspSerliePheLeuSerlieTyrValLeuGluAlaVal151015LeuLysLeulieAlaLeuGlyLeuGluTyrPheTyrAspProTrpAsn202530AsnLeuAspPhePhelieMetValMetAlaValLeuAspPheValLeu354045LeuGinlieAsnSerLeuSerTyrSerPheTyrAsnHisSerLeuPhe505560ArglieLeuLysValPheLysSerMetArgAlaLeuArgAlalieArg65707580ValLeuArgArgLeuSerlieLeuThrSerLeuHisGluValAlaGly859095ThrLeuSerGlySerLeuProSerlieThrAlalieLeuThrLeuMet100105110PheThrCysLeuPheLeuPheSerValValLeuArgAlaLeuPheGin115120125AspSerAspProLysArgPheGinAsnliePheThrThrLeuPheThr130135140LeuPheThrMetLeuThrLeuAspAspTrpSerLeulieTyrlieAsp145150155160AsnArgAlaGinGlyAlaTrpTyrlielieProlieLeuMetlieTyr165170175lieVallieGinTyrPheliePheLeuAsnLeuVallieAlaValLeu180185190
1权利要求
一种用于男性免疫避孕的多肽，具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
2. —种用于男性免疫避孕的多肽，其特征在于，该多肽具有与序列表中序列l所示氨 基酸79%以上的同源性。
3. —种用于男性免疫避孕的药物制剂，由权利要求1或2所述的多肽和制药学上可接 受的佐剂组成。
全文摘要
本发明提供了一种用于男性免疫避孕的多肽，该多肽具有与人CatSper1第481～670氨基酸序列79％以上的同源性，配以制药学上可接受的佐剂，即为用于男性免疫避孕的药物制剂。
文档编号C07K14/435GK101747424SQ20081023689
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者李红钢, 熊承良 申请人:华中科技大学