抗肥胖致免疫杂交多肽及含有所述多肽的抗肥胖疫苗组合物的制作方法

专利名称：抗肥胖致免疫杂交多肽及含有所述多肽的抗肥胖疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种致免疫杂交多肽，其中将载脂蛋白B-100的B细胞 表位的模拟肽、狂犬病病毒辅助T细胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原辅 助T细胞表位以及小鼠载脂蛋白CII的C末端肽片段或载脂蛋白B-100 的B细胞表位的模拟肽以从该致免疫杂交多肽的N末端到C末端方向的 顺序相互融合。此外，本发明涉及一种用于预防和治疗肥胖病的疫苗组 合物，其包含所述致免疫杂交多肽作为活性成分。进一步地，本发明涉 及编码所述致免疫杂交多肽的多聚核苷酸、携带该多聚核苷酸的重组表 达载体、由该重组表达载体转化的宿主细胞以及通过培养由该重组表达 载体转化的宿主细胞来制备所述致免疫杂交多肽的方法。
背景技术：
近来，由于向西方饮食习惯的转变，导致在韩国糖尿病、动脉硬化 和冠状动脉粥样硬化疾病(CAD)逐渐增多，其不仅对人而且对于宠物 如狗或猫均是如此。引起这些疾病的血脂包括胆固醇、甘油三酯(TG)、 游离脂肪酸和磷脂。这些血脂形成具有载脂蛋白的脂蛋白，并且通过血 流输送。其中，极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)输送 大部分甘油三酯和胆固醇的功能以及LDL-胆固醇水平的变化是疾病预 后的指标。成人脂类代谢相关疾病的主要因素LDL-胆固醇结合于每种组 织中细胞质膜的LDL受体上，并在组织中保存并利用。选择性地，由清 除细胞吸收LDL-胆固醇并将其水解，然后将游离胆固醇转化为HDL， 与载脂蛋白E (apoE)脂蛋白一起在肝中再循环，或者将其转化为胆盐 释放。在该过程中，载脂蛋白表现出维持脂蛋白结构性体内稳态的重要 功能，充当酶脂蛋白脂肪酶的辅助因子，并且在与质膜上特定受体的结 合中起重要作用。
载脂蛋白B-100(载脂蛋白B-100)是低密度脂蛋白的主要蛋白组分， 并且还存在于中密度脂蛋白(IDL)和VLDL中。因此，当将血液中的 抗体诱导识别载脂蛋白B-100时，由吞噬细胞来清理LDL就容易发生了。
5在这方面，某些最新研究集中于利用疫苗来降低血桨LDL-胆固醇水平并
减少动脉硬化的发生。由这种抗胆固醇疫苗疗法诱导的抗体是IgM型， 其被认为结合于VLDL、 IDL和LDL，并且该策略暗示了研制疫苗用于 预防和治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化的可能性(Bailey等人， Cholesterol vaccines, Science 264， 1067-1068， 1994; PalinskiW等人， Proc Natl Acad Sci U.S.A. 92， 821-5， 1995; Wu R, de Faire U等人， Hypertension. 33， 53-9， 1999)。此外，载脂蛋白B-100是巨大的蛋白 分子，其由4560个氨基酸残基组成，包含24个氨基酸残基的信号肽并 具有超过500kDa的分子量(Elovson J等人，Biochemistry, 24:1569-1578， 1985)。因为载脂蛋白B-100主要由肝脏分泌，并且是两性分子，所以 其可与血浆脂蛋白的脂类组分和水相环境相互作用(Segrest J. P等人， Adv. Protein Chem.， 45:303-369， 1994)。载脂蛋白B-100稳定LDL颗 粒的大小和结构，并且在通过结合于其受体来控制血浆LDL-胆固醇的体 内平衡中起关键作用(Brown MS等人，Science, 232:34-47， 1986)。
本发明人所发表的韩国专利号10-0639397公开了一种用于载脂蛋白 B-100的表位的模拟肽，其显示对于肥胖病的抑制作用； 一种致免疫杂交 多肽(B4T)，其中上述模拟肽融合于辅助T细胞表位，以及含有致免 疫杂交多肽的抗肥胖病组合物。但是，由于在免疫相关物质和代谢中的 差异，不能预期由载脂蛋白B-100的B细胞表位的模拟肽与辅助T细胞 表位融合所产生的杂交多肽对于动物的预防和治疗如同在人类中同样有 效。另外，虽然在一个群体之内具有免疫性，但是因为其折叠稳定性较 低，所以依照个体而言，融合的多肽引起免疫应答具有很大程度的偏差。
另一方面，做了很多努力将半抗原与载体蛋白融合以增强半抗原的 免疫原性，但是未能获得一致的增强效果。特别地，如本发明的B细胞 表位和T细胞表位的线性连接导致依表位方向、每个表位类型等的免疫 原性的丧失(Francis, M. J.等人，Nature 330:168-170， 1987)，并且连 接子的存在导致抗原性减低(Partidos, C.等人，Mol. Immunol. 29:651-658， 1992)。也就是说，没有一常不变的规律可适用于肽疫苗设 计，并且设计的疫苗的效力也是不可预知的。基于同样的理由，当载脂 蛋白B-100的B细胞表位的高度疏水性模拟肽与狂犬病病毒辅助T细胞
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表位、乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表位或载脂蛋白CII融合时， 抗原区域可以内化到融合蛋白中，导致其诱导抗体应答的能力降低。

发明内容
为了得到本发明，本发明人对适用于动物(例如狗、牛等以及人) 并能在个体中引起一致的抗体反应的稳定的抗肥胖病疫苗进行了充分而 彻底的研究。
因此，本发明人令人惊讶地发现本发明的杂交多肽除了显示极好的 免疫刺激作用以外，可以有效地用于预防或治疗动物以及人的肥胖病，
所述杂交多肽包含载脂蛋白B-100的B细胞表位的四聚体模拟肽(B4)、 狂犬病病毒辅助T细胞表位(R)或乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞
表位(T)以及载脂蛋白cn的c末端肽片段(cn)或载脂蛋白B-ioo
的B细胞表位的二聚体模拟肽(B2)以从该致免疫杂交多肽的N末端的 顺序融合，从而完成本发明。
因此，本发明的一个目的在于提供了一种致免疫杂交多肽，其中将 载脂蛋白B-100的B细胞表位的四聚体模拟肽、狂犬病病毒辅助T细胞 表位或乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表位以及载脂蛋白CII的C末 端肽片段或载脂蛋白B-100的B细胞表位的二聚体模拟肽以从该致免疫 杂交多肽的N末端的顺序相互融合。
本发明的另一目的在于提供了一种用于预防或治疗肥胖病的疫苗组 合物，其包含致免疫杂交多肽。
本发明的又一目的在于提供了一种编码所述致免疫杂交多肽的多聚 核苷酸。
本发明的又一目的在于提供了一种包含该多聚核苷酸的重组表达载体。
本发明的又一目的在于提供了一种用该重组表达载体转化的宿主细胞。
本发明的又一目的在于提供了一种通过培养用该重组表达载体转化 的宿主细胞来生产所述致免疫杂交多肽的方法。


图1 (a)是在每孔2pl负载的TBE缓冲系统的2%琼脂糖凝胶上电 泳载脂蛋白CII基因的PCR产物(在道2中)以及25/100bp混合DNA 梯(在道1中)之后的照片。
图1 (b)是显示将目的多聚核苷酸片段插入转化到大肠杆菌JM109 中的重组载脂蛋白CII (ApoCn) /pQE30载体中的照片。
图2 (a)是在每孔2pl负载的TBE缓冲系统的2%琼脂糖凝胶上电 泳RVNP基因的PCR产物(在道2中)以及100bp梯度(Bioneer)(在 道1中)之后的照片。
图2 (b)是显示Sal I消化片段以适当的方向插入转化到大肠杆菌 JM109中的重组B4RCII/pQE30载体中的照片。
图2 (c)是显示Sal I消化片段以适当的方向插入转化到大肠杆菌 JM109中的重组B4RB2/pQE30载体中的照片。
图2 (d)是显示Sal I/Hind III消化片段以适当的方向插入转化到大 肠杆菌JM109中的重组B4TB2/pQE30载体中的照片。
图3是说明制备表达B4RCII融合多肽的重组表达载体的方法示意图。
图4是说明制备表达B4RB2融合多肽的重组表达载体的方法示意图。
图5是说明制备表达B4TB2融合多肽的重组表达载体的方法示意图。
图6显示pB4RCII的核苷酸序列及由其编码的氨基酸序列，所述核 苷酸序列通过DNA测序来确定。
图7显示pB4RB2的核苷酸序列及由其编码的氨基酸序列，所述核 苷酸序列通过DNA测序来确定。
图8显示pB4TB2的核苷酸序列及由其编码的氨基酸序列，所述核 苷酸序列通过DNA测序来确定。
8图9 (a)是显示B4RCII的表达随时间变化的SDS-PAGE照片，其 中将在IPTG诱导之后1 4小时，从大肠杆菌M15/pB4RCII中获得的 B4RCII在道2 5中与标记(NEB)在道M中、非IPTG诱导的大肠杆 菌M15/pB4RCII在道1中一起进行电泳。
图9 (b)是显示B4RB2的表达随时间变化的SDS-PAGE照片，其 中将在IPTG诱导之后2 5小时，从大肠杆菌M15/pB4RB2中获得的 B4RB2在道2 5中与标记(NEB)在道M中、非IPTG诱导的大肠杆 菌M15/pB4RB2 —起进行电泳。
图9 (c)是显示B4TB2的表达随时间变化的SDS-PAGE照片，其 中将在IPTG诱导之后3 5小时，从大肠杆菌M15/pB4TB2中获得的 B4TB2在道2 3中与标记(NEB)在道Ml中、非IPTG诱导的大肠杆 菌M15在道1中、总可溶蛋白在道4中以及由8M尿素溶解的总蛋白在 道5中一起进行电泳。
图9 (d)是通过利用兔抗PB14多克隆抗体的Western印迹分析显 示B4RCII存在的照片。
图IO显示根据在图(a)和SDS-PAGE照片(b)中的线性咪唑浓度 梯度从树脂结合的B4RCII中洗脱B4RCII (Ml: NEB预先染色标记，
道l:非诱导细胞粗提物，道2: 4小时诱导细胞粗提物，道3:总可溶 蛋白；道4:(在树脂结合之前)由8M尿素溶解的总蛋白，道5:上样 流穿(flow-through)，道6:冲洗部分(50mM咪唑)以及道7:洗脱部 分(500mM咪唑)，7.5pl/孔负载)。
图IO显示根据在图(c)和SDS-PAGE照片(d)中的线性咪唑浓度 梯度从树脂结合的B4RB2中洗脱B4RB2 (道1: Elpis预先染色蛋白标 记，道2:总可溶蛋白，道3:(在树脂结合之前)由8M尿素溶解的总 蛋白，道4:上样流穿，道6:洗脱部分(500mM咪唑)，3|^1/孔负载)。
图IO显示根据在图(e)和在SDS-PAGE照片(f)中的线性咪唑浓 度梯度从树脂结合的B4TB2中洗脱B4TB2 (道1: Elpis预先染色蛋白标 记，道2:总可溶蛋白，道3:(在树脂结合之前)由8M尿素溶解的总 蛋白，道4:上样流穿，道5:冲洗部分(50mM咪唑)，道6:洗脱部分(500mM咪唑)，道7:洗脱部分(500mM咪唑)，7.5nl/孔负载)。
图11是显示在由红色箭头指示的时间点上，用B4RCI1、 B4RB2禾口 B4TB2免疫的C57BL/6小鼠组的体重增加的图，由蓝色箭头指示饮食诱 导的肥胖病(DIO)的起始点。
图12是显示对于用B4RCII 、 B4RB2和B4TB2免疫动物，抗B4抗 体的滴度随时间的变化图。图13是显示在用本发明的疫苗第三次加强之后一周的动物(16周 龄)的血脂水平的图。
具体实施例方式
根据其一个方面，本发明涉及一种致免疫杂交多肽，其中将载脂蛋 白B-100的B细胞表位的模拟肽、狂犬病病毒辅助T细胞表位或乙型肝 炎病毒表面抗原辅助T细胞表位以及载脂蛋白CII的C末端肽片段或载 脂蛋白B-100的B细胞表位的二聚体模拟肽以从该致免疫杂交多肽的N 末端的顺序相互融合。
本文所用的术语"表位的模拟肽"指模拟表位最小部分的肽，其是 与天然表位足够相似使得其可被对天然表位具有特异性的抗体所识别的 表位、或能促进抗体与天然表位交联的表位。模拟肽也称为模拟位。这 种模拟肽是有利的，因为其在体内被识别为是"非自我的"，并因此克 服免疫应答中自体耐受性的问题。由特异性结合于载脂蛋白B-100的抗 体识别载脂蛋白B-100的B细胞表位的模拟肽。特异结合于载脂蛋白 B-100的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体及其片段，所述抗体特异性识 别并结合于载脂蛋白B-IOO，例如Fc、 Fab和F(ab')2。其中，优选单克 隆抗体，更优选MabB9和MabB23。
根据本发明的载脂蛋白B-100的B细胞表位的模拟肽包括选自由序 列编号1、序列编号2和序列编号3所组成的组的氨基酸序列。本发明人 使用文库生物淘筛从噬菌体展示肽文库中分离了可由抗载脂蛋白B-100 的单克隆抗体MabB9或MabB23识别的模拟肽(序列编号1、 2和3)。 载脂蛋白B-100的表位的模拟肽，其包括选自由序列编号l、序列编号2 和序列编号3所组成的组中的氨基酸序列，可处于由具有上述任一序列编号的氨基酸序列的单拷贝组成的单体形式，或者为了进一步增强模拟
肽的免疫原性，可为多聚体形式，其中将具有上述任一序列编号的氨基
酸序列的两个或多个，优选三至八个，更优选三至六个拷贝进行连接。
最优选是四聚体，其中将四个拷贝进行连接。当模拟肽为多聚体形式时， 每个构成单体的氨基酸序列可直接或者经由连接子共价连接。当氨基酸
序列经由连接子连接时，连接子可由一至五个氨基酸残基组成，所述氨 基酸残基选自例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰 胺、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸。优选的用于连接子的氨基酸可包括缬氨 酸、亮氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。更优选地，考虑 到易于进行基因操作，可将选自缬氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸等的两个 氨基酸连接并用作连接子。通过连接子将选自序列编号1、 2和3的氨基 酸序列的两个或多个拷贝连接来制备优选的模拟肽。
本文所用的术语"T细胞表位"指能够以适当的效率结合于MHCII
类分子并刺激T细胞或以与MHCII类分子复合体结合于T细胞上的氨基 酸序列。在这种情况下，T细胞表位由在T细胞上呈递的特异性受体所 识别，并且其功能在于提供B细胞分化成抗体产生细胞所需要的信号并 诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)来破坏靶细胞。就本发明的目的而言， 辅助T细胞表位优选用作特异性受体的识别靶点。其中，发现狂犬病病 毒辅助T细胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表位得到更好的 效果。
狂犬病病毒传染给家畜和野生动物以及宠物例如狗和猫，导致急性 脑炎。人及其它动物可通过接种疫苗预防狂犬病。对于本发明，使用通 过基因操作从狂犬病病毒核糖核蛋白基因(NCBI基因ID; AF406695) 中制备包含宿主的辅助T细胞表位的58个氨基酸长的肽片段(R)，其 氨基酸序列如序列编号6所示(Ertl， H.C丄等人，Journal of Virology, 63(7)， 2885-2892， 1989)。
乙型肝炎病毒(HBV)的基因组长度是3.2kb，具有四种重要蛋白的 信息并包含四个开放阅读框架，S基因(表面抗原蛋白)、C基因(核心 蛋白)、P基因(DNA聚合酶)和X基因。将S基因分成编码HBsAg
11的S区和preS区。将preS区分成根据HBV菌株的、编码108或119个 氨基酸的preSl和与亚型无关的编码55个氨基酸的preS2。在体内免疫 应答期间，HBVpreS2蛋白活化辅助T细胞，从而刺激抗HBV抗体的形 成。序列编号7表示HBV辅助T细胞表位的氨基酸序列。
在致免疫杂交多肽的C末端区域设置有小鼠载脂蛋白CII的C末端 肽片段或载脂蛋白B-100的B细胞表位的模拟肽。
由79个氨基酸残基组成的、分子量为8，800Da的小鼠载脂蛋白CII (Hoffer， M丄等人，Genomics 17(1)， 45-51， 1993)主要在小肠和肝中 产生，并可在乳糜微粒、VLDL和HDL中发现，起到作为载脂蛋白脂酶 (LPL)的酶活性的必需辅助因子的作用(Storjohann, R.等人，Biochimica et Biophysica Acta， 1486， p253 264， 2000)。在本发明的优选实施例 中，将负责控制LPL活性的、由载脂蛋白CII的33个C末端氨基酸残 基组成的肽从小鼠载脂蛋白CII基因(NCBI基因ID; NM009695)中克 隆，并由序列编号8所示。
提供给本发明致免疫杂交多肽的C末端区域的载脂蛋白B-100的表 位的模拟肽包含选自由序列编号1、序列编号2和序列编号3所组成的组 的氨基酸序列。载脂蛋白B-100的表位的模拟肽，其包括选自由序列编 号1、序列编号2和序列编号3所组成的组的氨基酸序列，可为由其单拷 贝组成的单体形式。为了进一步增强其免疫原性，模拟肽可为多聚体形 式，其中将氨基酸序列的两至四个拷贝进行连接，更优选由两个拷贝组 成的二聚体形式。就多聚体形式而言，每个构成单体的氨基酸序列可直 接或经由连接子共价连接。
本文所用的术语"免疫原性"指诱导细胞免疫应答和体液免疫应答 来使身体防御异物的能力。诱导这些免疫应答的物质称为免疫原。在根 据本发明的融合多肽中，将载脂蛋白B-100的B细胞表位、狂犬病病毒 辅助T细胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表位和载脂蛋白 CII的C末端肽片段用作免疫原。
当将B细胞表位和T细胞表位进行融合形成致免疫多肽，如同本发 明的多肽，已知B细胞表位应该暴露于多肽折叠结构的外面，且T细胞
12表位位于内部，以便诱导有效的免疫应答(Partidos C等人，Eur J Immunol., 22 ( 10) : 2675-80， 1992)。除了现有技术中B4T融合蛋白 的结构以外，其中仅将载脂蛋白B-100的B细胞表位的模拟肽和T细胞 表位进行连接，按照本发明，将载脂蛋白CII的片段或载脂蛋白B-100 的B细胞表位的模拟肽连接到T细胞表位的C末端。发现产生的融合多 肽在蛋白折叠结构的稳定性方面有改进，并且在全部个体中诱导出一致 的抗体反应，这是由于T细胞表位进一步被B细胞表位包围，最小限度 的暴露在外面。
本文所用的术语"多肽"是包括全长氨基酸链的术语，其中包括两 个或多个氨基酸残基由共价肽键相连接，包括二肽、三肽、寡肽和多肽。 特别地，在本发明中，多肽指两个或多个肽彼此连接在一起的杂交多肽， 其中所述的两个或多个肽是几个至几十个氨基酸共价相连的肽。含有所 述多肽的每个肽序列包括对应于上述表位的序列，并可以进一步包括接 近上述表位的序列。这些肽可由L-氨基酸或D-氨基酸构成，或可为两种 不同构型的氨基酸的不同组合。
本文所用的术语"杂交多肽"通常指具有不同来源的异质肽 (heterogeneous peptides)相连接的肽。在本发明中，杂交多肽是这样的 肽，其中B细胞表位、狂犬病病毒辅助T细胞表位或乙型肝炎病毒表面 抗原辅助T细胞表位以及载脂蛋白CII的C末端肽片段或载脂蛋白B-IOO 的B细胞表位的模拟肽以从该致免疫杂交多肽的N末端到C末端的顺序 排列并相互连接。
在根据本发明的优选实施方式中，所述杂交多肽是多肽(B4RCn)， 其中序列编号1的氨基酸序列的四个拷贝(B4)、狂犬病病毒辅助T细 胞表位(R)和小鼠载脂蛋白CII的C末端肽片段(CII)从N末端向C 末端顺序连接(序列编号9)。在本发明的另一优选实施方式中，所述杂 交多肽是多肽(B4RB2)，其中序列编号1的氨基酸序列的四个拷贝(B4)、 狂犬病病毒辅助T细胞表位(R)和序列编号1的氨基酸序列的两个拷 贝(B2)从N末端向C末端顺序连接(序列编号10)。在本发明的又 一优选实施方式中，所述杂交多肽是多肽(B4TB2)，其包含序列编号1 的氨基酸序列的四个拷贝(B4)、乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表
13位(T)和序列编号1的氨基酸序列的两个拷贝(B2)从N末端向C末端顺序连接(序列编号11)。根据本发明，所述杂交多肽可完全由致免疫部分和其相邻的序列组成，并可选择性地进一步包含附加序列，所述致免疫部分包括B细胞表 位、狂犬病病毒辅助T细胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表 位、载脂蛋白CII的C末端肽片段。然而，优选使所述附加序列抑制整 体免疫性的下降。所述附加序列包括连接子序列。当使用连接子经由其 连接表位区域时，必须对它们进行选择，以使对免疫应答的诱导不产生 负影响。在另一方面，本发明涉及一种重组载体，所述重组载体包含编码所 述致免疫杂交多肽的多聚核苷酸；包含该多聚核苷酸的重组表达载体； 用该重组表达载体转化的宿主细胞；以及通过培养用该重组表达载体转 化的宿主细胞来生产所述致免疫杂交多肽的方法。可通过化学合成或基因重组来生产本发明的致免疫杂交多肽。详细 来说，由基因重组来生产本发明致免疫杂交多肽的方法包含以下四个步 骤第一步是将编码所述杂交多肽的基因插入到载体中来构建重组载体。导入外来DNA的载体可为质粒、病毒、装配型质粒等。重组载体包括克隆载体和表达载体。克隆载体包含复制原点，例如质粒、噬菌体 或装配型质粒的复制原点，其为"复制子"，在该"复制子"处，与其连接的外源DNA片段开始复制。开发了表达载体用于蛋白合成。重组载 体用作将外来DNA片段插入其中的载体，其一般指双链DNA片段。本 文所用的术语"外来DNA"指来源于不同物种的DNA，或来自同族物 种的天然DNA的实质上的修饰体。此外，外来DNA包括在正常情况下 不在细胞中表达的未经修饰的DNA序列。在这种情况下，外源基因是要 转录的特定靶核酸，其编码多肽。重组载体包含可操作连接于转录和翻 译表达调控序列的靶基因，其在所选宿主细胞中发挥作用以便增加转染 基因在宿主细胞中的表达水平。重组载体是包含主要调节元件的基因构 建体，基因插入片段可操作地连接于所述主要调节元件从而在个体的细14胞中表达。利用标准的重组DNA技术来制备这种基因构建体。只要载体在包括原核细胞和真核细胞的各种宿主细胞中表达耙基因并能生产耙蛋 白，那么就不特别限定重组载体的种类。然而，优选能够大量生产与天 然形式相似的形式的外源蛋白、同时具有强启动子来实现靶蛋白的强表 达的载体。重组载体优选至少包含启动子、起始密码子、编码耙蛋白的 基因、终止密码子和终止子。重组载体可进一步适当地包含编码信号肽的DNA、增强子序列、靶基因的5'-和3'-非翻译区、选择标记区、复制 单位等。第二步是用重组载体转化宿主细胞，并且培养宿主细胞。通过 Sambrook, J.等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74， 1989所述的方法将重组载体导入宿 主细胞来产生转化体，该方法包括磷酸钙或氯化钙/氯化铷方法、电穿孔 法、电子注射法、化学处理(例如PEG处理法)以及基因枪法。可通过 在营养培养基中培养表达重组载体的转化体来大规模生产和分离有用的 蛋白。可根据宿主细胞适当地选择通用的培养基和培养条件。应该保持 培养条件(包括温度、培养基的pH和培养时间)适合于细胞生长和目的 蛋白的大量生产。能够用被本发明的重组载体转化的宿主细胞包括原核 细胞和真核细胞。 一般使用具有高DNA导入效率和具有导入的DNA的 高表达水平的宿主细胞。宿主细胞的实例包括已知的原核细胞和真核细 胞，例如埃希氏菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌和酵 母；昆虫细胞例如草地夜蛾(Sf9);以及动物细胞例如CHO、 COSl、 COS 7、 BSC1、 BSC40禾卩BMT 10。优选使用大肠杆菌。第三步是诱导杂交多肽表达和积聚。在本发明中，将诱导物IPTG用 于肽表达的诱导，调节诱导时间来获得最大的蛋白产量。最后一步是分离并纯化杂交多肽。 一般来说，可从培养基或细胞裂 解物中回收重组生产的肽。当肽处于膜结合形式时，可使用适当的表面 活性剂溶液(例如Triton-XlOO)或通过酶裂解来从膜中释放。可通过 各种物理或化学方法例如反复冻融、超声处理、机械破坏或细胞破裂剂 来破坏用于表达杂交肽的细胞，并且可通过通常使用的生物化学分离技 术来分离和纯化杂交肽(Sambrook等人，Molecular Cloning: A laboraroryCold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M.， Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego， CA， 1990)。生物化学分离技术的非限制性实 例包括电泳、离心、凝胶过滤、沉淀、透析、色谱(离子交换色谱、亲 和色谱、免疫吸附亲和色谱、反相高效液相色谱、凝胶渗透高效液相色 谱)、等电聚焦及其变形和组合。在本发明的优选实施方式中，将编码B4的C末端区域的基因与编 码包含T细胞表位的狂犬病病毒核蛋白的基因的一部分(R片段)连接， 然后与小鼠载脂蛋白基因的一部分(CII片段)连接来构建B4RCII基因 (图3)，所述的B4为显示抗肥胖病活性的载脂蛋白B-100的模拟肽的 四聚体形式， 一种包含B细胞表位但无T细胞表位的功能性肽。用于本发明的是B4片段，其公开于韩国专利号10-0639397。利用 RT-PCR获得载脂蛋白CII和RVNP(包含辅助T细胞表位的狂犬病病毒 核蛋白)基因。选择pQE30作为B4RCII的表达载体，因为其从其内在 的起始密码子随同六个组氨酸残基一起开始蛋白表达以便于蛋白纯化， 其后是肠激酶酶切位点。发现基于其氨基酸分子量计算，如此表达的蛋 白约为21KDa大小；按照SDS-PAGE测定，约为22KDa大小。按照时 间采取的样品进行的SDS-PAGE证明了目的蛋白的表达(图9)。另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗肥胖病的疫苗组合物， 所述组合物包含致免疫杂交多肽。没有一常不变的规律可适用于肽疫苗设计，并且设计的疫苗的效力 也是不可预知的。由于同样的理由，当将高度疏水性PB14肽与异质肽T 细胞表位融合时，抗原区域可以被内化到融合蛋白中，导致其诱导抗体 应答的能力下降。根据结果难以解释的上述背景，构建杂交多肽，显示 其具有抗肥胖病的免疫原性，所述杂交多肽中，载脂蛋白B-100的B细 胞表位的模拟肽、狂犬病病毒辅助T细胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原 辅助T细胞表位以及载脂蛋白CII的C末端肽片段或载脂蛋白B-100的 B细胞表位的模拟肽以从该致免疫杂交多肽的N末端向C末端的方向的 顺序融合。使用通过基因重组表达和纯化的本发明的致免疫杂交多肽对大鼠进 行免疫，并且通过研究(a)体重增加、(b)血清抗体滴度和(C)血脂 水平的变化，从而确定抗原的高效形式，评价抗原对于诱导免疫应答的作用。结果与对照组相比，用杂交多肽(B4RCI1、 B4RB2和B4TB2) 接种的组显示抑制体重增加、抗模拟肽的抗体的高滴度和延长保持、以 及TG和LDL-胆固醇血清水平的降低。详细来说，将纯化的B4RCII 、 B4RB2和B4TB2各50吗/150pl按照两周的定期间隔重复三次腹膜内注射给6周龄的ICR大鼠后，观察大鼠 体重变化并绘制成图(图12)。在初级加强之后，向大鼠供给高脂肪饮 食以引起DIO (饮食诱导的肥胖病)。直到初次注射和加强为止，各组 中小鼠个体在体重上相似，均在22-23g的范围内。但是，从DIO开始， 发现对照(肥胖病)体重增加，而注射B4RCI1、 B4RB2或B4TB2的组 显示体重仅有轻微增加。当其为14周龄(在初次注射之后8周)时，对 照和B4RB2注射组在体重上大约有8g的差别，表明由初次注射诱导的 弱免疫应答通过二次注射而加强，达到足以抑制体重增加的程度。在第 三次注射之后，测定体重增加保持在预期的偏差范围之内。另外，应用间接酶联免疫吸附法在7、 10、 12、 14、 16和18周龄时 研究预防接种组中ICR小鼠的抗体滴度(图12)。就血液中的脂类水平 而言，发现预防接种组在总血胆固醇(TC)、甘油三酯(TG) 、 HDL 胆固醇和LDL胆固醇脂类水平上比对照更低(图13)。总的来说，这些结果证明根据本发明的杂交多肽B4RCI1、 B4RB2 和B4TB2可用作有效的抗肥胖病疫苗。与常规的杂交多肽B4T相比，本 发明的杂交多肽能诱导出更一致和稳定的免疫应答，因此其可用于制备 有效的抗肥胖病疫苗组合物。本发明的抗肥胖病疫苗由抗原、药学上可接受的载体、适当的辅料 及其它常见的原料所组成，并且以免疫上有效的量来给药。本文所用的 术语"免疫上有效的量"指对于肥胖病足以发挥治疗和预防作用而不引 起副作用或严重或过度免疫应答的量。精确的剂量可根据给药的特异性 免疫原而改变，并可应用测定免疫应答进展的已知方法由本领域技术人17员来测定。此外，剂量可依据给药形式和途径、接受者的年龄、健康状 态和体重、症状的性质和程度、目前接受治疗的种类以及治疗频率而改 变。载体为本领域已知的，包括稳定剂、稀释剂和缓冲剂。适当的稳定 剂包括碳水化合物例如山梨醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖和 葡萄糖；以及蛋白质例如白蛋白或酪蛋白。适当的稀释剂包括盐水、Hanks，平衡盐溶液和林格液(Ringer's solution)。适当的缓冲液包括碱金 属磷酸盐、碱金属碳酸盐和碱土金属碳酸盐。疫苗还可包含一种或多种 辅料来增加或强化免疫应答。适当的辅料包括肽；氢氧化铝；磷酸铝； 氧化铝；以及组合物，所述组合物由矿物油(例如Marco152)或植物油 以及一种或多种乳化剂或表面活性物质(例如溶血卵磷脂、多聚阳离子 和多聚阴离子)所组成。可将本发明的疫苗组合物作为单一治疗剂给药 或与另一种治疗剂结合给药，并且可与常规治疗剂顺次或同时共同给药。 可通过已知的给药途径给予疫苗组合物。给药方法包括口服、皮内、肌 内、腹腔内、静脉内、皮下和鼻内途径，但不限于此。此外，可使用特 定装置给予药物组合物，所述装置可以将活性物质传递到靶细胞。通过以下所列的、用于举例说明的实施例可更好地理解本发明，但 并不对本发明构成限制。实施例1试验材料和试验动物的制备DNA小量提取试剂盒和用于从凝胶中提取DNA的试剂盒购自 Nucleogen;Bacto胰蛋白胨、Bacto酵母提取物、琼脂等来自Difco(Detroti， MI);限制酶来自Takara; T4 DNA连接酶来自NEB。使用pBluescript II SK (Stratagene) 、 PCR 2.1 (Invitrogen， Carlsbad， CA)和pQE30 (Qiagen) 载体以及大肠杆菌JM109和M15菌株(Qiagen)。用于诱导蛋白生产的 IPTG购自Sigma;用于纯化表达的蛋白的Ni-NTA树脂来自Novagen; 用于SDS-PAGE、 Western印迹、ECL等的预先染色标记来自NEB。用 于使蛋白变性的尿素购自Duchefa;用于蛋白纯化的咪唑来自USB。用 于透析的膜是购自Spectrum的MWCO3，500;用于预防蛋白凝集的试剂 是来自Amresco的CHAPS。用于酶联免疫吸附法的抗体是来自Amresco 的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗大鼠IgG。用于Western印迹和ECL 的底物溶液是来自Sigma的BCIP/NBT; ECL Plus Western印迹检测试剂购自Amersham。使用的辅料是弗氏佐剂(Freund's adjuvant, Sigma) 和氢氧化铝(Reheis)。通过Pierce's BCA蛋白法和Biorad's Bradford法
来确定蛋白浓度。
6周龄雌性ICR小鼠购自韩国的Central Lab.Animal Inc.。用正常饮 食(Samtako Inc.,天然蛋白18%或更高，粗脂肪5.3%，粗纤维4.5%， 矿物质8.0%)饲养ICR小鼠直到免疫应答加强为止，然后用高脂肪的饮 食(60%kCal脂肪，D12492， Research Diets Inc.， New Brunswick, NJ)。
实施例2小鼠ApoCII基因克隆
2-1从鼠肝组织中分离总RNA
用TRIzol (Invitrogen)进行总RNA的分离。将所有用于RNA分离 的溶液用0.1%焦碳酸二乙酯处理过的水(DEPC-dH20)处理以抑制核糖 核酸酶(RNase)活性。将50mg来自小鼠的肝组织与2ml TRIzol混合， 然后匀浆。将匀浆置于冰上20分钟，然后在4。C下、以14,000rpm离心 15分钟。将上清液转入新管中，从管中小心除去所有的蛋白。将20(^1 的氯仿(Merck)加入管中，然后涡旋30秒。再次在冰上另外反应20分 钟，随后在4"C下、以14,000rpm离心15分钟。仅将上清液转入新管， 然后与等体积的苯酚/氯仿和0.2M醋酸钠(pH 5.2)混合后，涡旋5秒钟。 将其置于冰上20分钟之后，将混合物在4。C下、以14，000rpm离心15分 钟。将上清液与等体积的异丙醇(Merck)混合，并在-7(TC下保存1小 时，随后在4'C下、以14,000rpm离心10分钟以形成RNA团块。在-70。C 保存前，用lml的75%乙醇冲洗、干燥，并悬浮于DEPC-dH20中。通过 在1%琼脂糖凝胶(0.5%TAE)上进行电泳来鉴定由此获得的RNA，而 使用GeneQuantII (Pharmaciabiotech)来测定RNA浓度。
2-2从总RNA合成cDNA
利用cDNA环化TM试剂盒(cDNA cycle kit, Invitrogen)实现cDNA 合成。将400ng的RNA置于PCR管中，将其与DEPC-dH20混合得到 11.5pl的最终体积。其与lpl的寡-dT引物充分混合，并在65'C的水浴中 反应10分钟，然后在室温下反应2分钟。将核糖核酸酶抑制剂1.(^1、 5XRT缓冲液4.0pl、 100mM的脱氧核苷三磷酸(dNTP) 1.0^1、 80mM的焦磷酸钠l.Opl和AMV反转录酶0.5iil的混合物加入管中，然后将其 轻敲，置于42'C水浴中1小时，然后在95t:下放置2分钟，立即保存于 冰上。在添加1.0|il的0.5MEDTA (pH8.0)和20^1的苯酚-氯仿后，将 混合物涡旋并在4"C下、以14,000rpm离心15分钟。将由此形成的上清 液转入新管中，加入22ial乙酸铵和88|^175%的乙醇，通过涡旋混合，然 后在-7(TC下保存过夜。接着在4'C下、以14,000rpm离心15分钟，将产 生的团块重悬在20pl的去离子水中。通过在1%琼脂糖凝胶(0.5% TAE 缓冲液)上进行电泳来鉴定cDNA。
2-3小鼠载脂蛋白CII的C末端片段的PCR
将DNA扩增仪480 (DNA Thermal Cycler 480)用于在本实施例中 所有的PCR。为了在PCR中扩增包括小鼠载脂蛋白CII的脂肪酶活化区 域的99个基因，合成了一组ApoCII-正义引物(5'-tc aga GTC GAC gat gag aaa etc agg gac國3')禾口 ApoCII -反义弓l物(5'-tat AAG CTT ggg ctt gcc tggcagcagctac-3')。首先，向PCR管中，加入ApoCII-正义引物和ApoC II-反义引物(2pmol/Vl)各以及2pl的实施例2-2中合成的cDNA。 最后，制备包含5)al 10X缓冲液、8(ildNTP和TaqDNA聚合酶(Takara) 的50^1 PCR溶液。在94'C下进行预变性5分钟以开始PCR，然后在98°C 变性30秒、56'C下退火30秒、72'C下延伸30秒，共进行30个这样的 循环，随后在72'C下延伸5分钟。通过在1.5%琼脂糖凝胶(0.5% TAE 缓冲液)上进行电泳来鉴定PCR产物(图lb)。
2-4 ApoClI/pQE30的构建
用Sal I和Hind III消化ApoClI PCR产物。将相同的限制酶用于 pQE30。
在16'C、 T4DNA连接酶存在下，将CII消化物与线性的pQE30载 体连接过夜。设计表达载体pQE30来生产6个组氨酸标签蛋白，其可以 方便地进行蛋白纯化。将由此获得的重组质粒转化到JM109大肠杆菌中 并扩增。在从转化体中制备之后，用Sal I和Hind III处理质粒来鉴定其 中目的基因的插入。
实施例3人工RCII基因的构建3-1从狂犬病病毒菌株ERA中分离基因组DNA
用TRIzol (Invitrogen)进行总RNA的分离。将所有用于RNA分离 的溶液用0.1%焦碳酸二乙酯处理过的水(DEPC-dH20)处理以抑制核糖 核酸酶活性。为了用于分离总RNA，狂犬病病毒获自狂犬病病毒疫苗。 首先，将包含2.5MNaCl的20% (w/v)聚乙二醇-800溶液200^1加入到 1.2ml疫苗中，并置于冰上l小时，随后在4。C下、14,000rpm离心10分 钟。将由此获得的病毒团块与lml的TRIzol混合并用移液管充分吸移。 将匀浆置于冰上20分钟，并且在4。C下、以14,000rpm离心15分钟。将 上清液转入新管中，从管中小心除去所有的蛋白。将200)al的氯仿(Merck) 加入管中，然后将其涡旋30秒。再次在冰上另外反应20分钟，随后在4°C 下、以14,000rpm离心15分钟。仅将上清液转入新管，然后与等体积的 苯酚/氯仿和0.2M醋酸钠(pH 5.2)混合后，涡旋5秒钟。置于冰上20 分钟后，将混合物在4"C下、以14,000rpm离心15分钟。将上清液与等 体积的异丙醇(Merck)混合，并在-7(TC下保存1小时，随后在4'C下、 以14,000rpm离心10分钟以鉴定RNA团块。在-70。C保存前，用lml 75% 的乙醇冲洗、干燥，并重悬于DEPC-dH20中。通过在1%琼脂糖凝胶(0.5% TAE)上进行电泳来鉴定由此获得的RNA，而使用GeneQuant II (Pharmacia biotech )来测定RNA浓度。
3-2从基因组RNA合成cDNA
利用cDNA环化 试剂盒(Invitrogen)进行cDNA合成。将400ng 的RNA置于PCR管中，并与DEPC-dH20混合得到11.5|_U的最终体积。 将其与1W的随机六聚体充分混合，在65'C水浴下反应IO分钟，然后在 室温下反应2分钟。将核糖核酸酶抑制剂l.Opl、 5X RT缓冲液4.0^1、 100mM的dNTP 1.0|il、 80mM的焦磷酸钠1.0^1和AMV反转录酶0.5pl 的混合物加入管中，然后将其轻敲，置于42"C水浴中1小时，然后在95°C 下放置2分钟，然后立即保存于冰上。在添加1.0|il的0.5M EDTA(pH 8.0) 和20fil的苯酚-氯仿后，将混合物涡旋并在4"C下、以14,000rpm离心15 分钟。将由此形成的上清液转入新管中，加入22^1的乙酸铵和88^175% 的乙醇，通过涡旋混合，然后在-7(TC下保存过夜。接着在4t:下、以 14,000rpm离心15分钟，将产生的团块重悬于20|^1的去离子水中。通过
21在1%琼脂糖凝胶(0.5。/。TAE缓冲液)上进行电泳来鉴定cDNA。
3-3狂犬病病毒菌株ERA的核蛋白基因的PCR
为了扩增已知编码T细胞表位(2)的狂犬病病毒菌株ERA的174 个核蛋白基因，用一组RVNP-正义引物(5'-ATA CTC GAG GAC GTA GCA CTG GCA GAT G-3')和RVNP-反义引物(5'-ATA CTC GAG GTT TGGACGGGC ATGACG-3')进行PCR。首先，向PCR管中加入RVNP-正义引物和RVNP-反义引物(2pmol/pl)各1^1以及2pl实施例3-2中合 成的cDNA。最后，制备包含5jil 10X缓冲液、8jil dNTP和1^1 TaqDNA 聚合酶(Takara)的50plPCR溶液。在94。C下进行预变性5分钟以开始 PCR，然后在98'C变性30秒、54'C下退火30秒、72"C下延伸30秒，共 进行30个这样的循环，随后在72'C下延伸5分钟。通过在1.5%琼脂糖 凝胶(0.5。/。TAE缓冲液)上进行电泳来鉴定PCR产物。
3-4 RCII/pQE30的构建
用Xho I消化RVNP PCR产物，而用Xho I和Sal I处理 ApoC II/pQE30载体。
在16'C、 T4DNA连接酶存在下，将RVNPPCR消化物与线性化的 ApoCII/pQE30载体连接过夜。将产生的重组质粒转化到JM109大肠杆 菌中并扩增。在从转化体中制备之后，用Sal I和Hind III处理质粒来鉴 定其中在适当方向上存在的目的基因的插入。
实施例4。B4RCII载体的构建
如韩国专利号10-0639397公开的那样，通过用Xho I处理来获得插 入pQE30中的相同B14片段。另外，将携带RCII片段的pQE30载体用 Xhol酶切，并在16'C、 T4DNA连接酶存在下，与B14片段连接过夜， 得到重组BL4RCII/pQE30 (pB4RCI1)质粒。将300 500ng/|al的 pB4RC II委托Cosmo Co. Ltd.做DNA测序。在从固定有BL4RCII/pQE30 载体的大肠杆菌JM109中制备之后，用Sal I处理来鉴定在适当方向上基 因的插入(图2b) 。 B4RCII的氨基酸序列如序列编号9所示。
实施例5 。B4RB2载体的构建
用Sal I禾卩Xhol消化韩国专利号10-0472841公开的BX2/pQE30(pB2)载体。将实施例3所获得的R片段在16。C下、T4 DNA连接酶 存在下，与线性化的BX2/pQE30连接过夜，得到重组的RBX2/pQE30 (pRB2)质粒。
将可通过用Xho I酶切实施例4的pB4RCII获得的B4片段在16°C 下、T4DNA连接酶存在下，与之前也用XhoI处理过的pTB2连接15小 时，产生重组的B4RBX2/pQE30 (pB4RB2 )质粒。在从固定有 B4RBX2/pQE30载体的大肠杆菌JM109中制备之后，用Sal I处理来鉴定 在适当方向上基因的插入(图2c) 。 B4RB2的氨基酸序列如序列编号10 所示。
实施例6 pB4TB2载体的构建
用Sal I和Xho I消化韩国专利号10-0472841公开的BX2/pQE30 (pB2)载体。通过消化韩国专利号10-0639397公开的PCR 2.1载体来 制备T片段。将T片段在16'C下、T4DNA连接酶存在下，与线性化的 BX2/pQE30连接过夜，产生重组的TBX2/pQE30 (pRB2)质粒。
将通过用Sal I和Xho I酶切pBluescriptll SK 4获得的B4片段在16°C 下、T4DNA连接酶存在下，与之前也用SalI处理过的pTB2连接过夜， 产生重组的B4TBX2/pQE30(pB4TB2)质粒。在从固定有B4TBX2/pQE30 载体的大肠杆菌JM109中制备之后，用Sal I和Hind III处理来鉴定在适 当方向上基因的插入(图2d) 。 B4TB2的氨基酸序列如序列编号11所 示。
实施例7重组B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的表达
将用作蛋白表达的宿主细胞的M15涂抹于包含氨苄青霉素和卡那霉 素的LB平板上，然后菌落出现。将其中之一在10ml的包含氨苄青霉素 (50吗/ml)和卡那霉素(50吗/ml) LB肉汤中培养过夜。将lml的培 养物接种到50ml的新鲜LB肉汤中以观察蛋白随时间的诱导。在37'C下 振荡培育培养物1.5小时至达到600nm吸光率为0.4 0.5，在此之后加 入IPTG至终浓度lmM，并且在培育期间每隔1小时抽样lml培养物， 如此进行5小时。在加入IPTG之前，取lml培养物并用作对照。将每 一培养物以14,000rpm离心1分钟，并在SDS-PAGE之前将由此获得的
23团块重悬于30pl2XSDS样品缓冲液中。对蛋白进行计算，B4RCII的大小为22kDa、 B4RB2的大小为21kDa以及B4TB2的大小为20kDa。图9(a) 9 (c)中给出SDS-PAGE结果，其显示蛋白随时间的表达。
实施例8用于重组肽B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的Western印迹
利用SDS-PAGE通过大小分析来鉴定B4RCII 、B4RB2和B4TB2肽，但是为了进一步确认表达的蛋白是否是B4RCI1、 B4RB2和B4TB2，使用两种能够识别B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的抗体进行Western印迹。作为B4RCI1、 B4RB2和B4TB2的Western印迹中的对照，用不包含B4RCII 、B4RB2和B4TB2片段的pQE30载体转化大肠杆菌M15。在IPTG诱导之前以及IPTG诱导之后四个小时收集样品。
将兔抗PB14多克隆抗体以1:10000稀释于PBS中，并用作第一抗体。作为能够识别第一抗体的第二抗体，在以1:10000稀释于PBS中之后，使用过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。利用ECL Plus Western Blotting试剂盒对产生的印迹进行显色。将印迹置于暗盒中，并将一张富士医用X线胶片置于印迹上。将印迹暴露于胶片10秒并显影。如图9 (d)所示，B4RCII得到正确表达。
实施例9在细菌细胞中重组B4RCI1、 B4RB2和B4TB2的鉴定
在将如实施例5中诱导蛋白表达的细胞培养物在4'C下、以9,000rpm离心30分钟之后，将团块在-2(TC下短时间冷冻，并在冰上解冻。将每一团块各lg重悬于5ml的超声处理缓冲液中，并且通过15个30秒超声处理循环来破碎，每一循环之间的间歇为l分钟。在4'C下、以9000rpm离心30分钟来产生上清液中的可溶蛋白(粗提物A)和团块中的不溶蛋白(粗提物B)。将每个样品与2X SDS缓冲液混合，并且就在SDS-PAGE之前，在95t下煮沸5分钟(图10)。
实施例10用于纯化重组B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的缓冲液的制备
如下制备缓冲液超声处理缓冲液5mM咪唑、0.5MNaCl、 20mMTris-Cl、 pH7.9;结合缓冲液5mM咪唑、0.5MNaCl、 20mM Tris-Cl、8M尿素、pH7.9;冲洗缓冲液50mM咪唑、0.5MNaCl、 20mMTris-Cl、8M尿素、pH 7.9;洗脱缓冲液400mM咪唑、0.5M NaCl、 20mM Tris-Cl、8M尿素、pH7.9。
实施例11重组B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的纯化
利用Ni-NTA树脂(Novagen)对于组氨酸标签蛋白进行肽纯化。该纯化是利用结合于树脂的Ni+和融合蛋白N末端的组氨酸六聚体之间相互作用的亲合层析方法。在将转化的大肠杆菌细胞在10ml的LB培养基中预培养过夜之后，将10ml培养物接种于500ml LB培养基中，并在37°C下培养直到600nm处OD达到0.4-0.5为止。然后，将lmM IPTG加入培养基中，然后将细胞进一步培养4小时。将细胞在9000rpm下离心30分钟，然后将细胞团块置于-2(TC下。在将冷冻细胞在冰上解冻之后，将其重悬于超声处理破碎缓冲液(5ml/g的湿细胞)中，然后超声处理。然后在4t:下、以9000rpm离心细胞裂解物30分钟。将团块重悬于与上清液体积相等的结合缓冲液中，超声处理三次来除去细胞碎片，然后在4'C下、以9000rpm离心30分钟。利用Ni-NTA树脂对于由此获得的上清液进行亲合层析。柱直径为1厘米，高度为15厘米，并且填装2ml树脂，以2ml/min的流速进行所有步骤。在将树脂装入柱后，用三至五倍柱容积的蒸馏水冲洗树脂，然后用五倍柱容积的Ix电荷缓冲液(50mM NiS04)使树脂带有N产，然后用结合缓冲液平衡，从而产生Ni-螯合的亲和层析柱。在将样品两次上样到柱之后，用结合缓冲液冲洗柱直到280nm处的吸光度达到1.0的基线为止，然后用冲洗缓冲液冲洗IO分钟。在柱完全平衡之后，仅将洗脱缓冲液通过柱并收集洗脱蛋白。因为洗脱肽溶于8M尿素中，所以在PBS中透析来除去尿素。用缓慢下降的尿素浓度来进行透析，以便精确地重折叠蛋白。在色谱分析中重折叠蛋白部分在280nm处的吸光度如图6 (a) 、 6 (c)和6 (e)所示。通过SDS-PAGE鉴定各步骤中获得的部分，如图10 (b) 、 10 (d)和10 (f)所示。
实施例12重组B4RCII 、 B4RB2和B4TB2的定量
因为B4RCII不聚集成沉淀物，所以虽然将其用缓慢下降的尿素浓度透析，但在这种条件下其量是确定的。利用BCA蛋白试验和紫外吸收法来进行蛋白的定量。通过将2.0mg/ml牛血清白蛋白(BSA)储备液稀释为1000、 500、 250、 125和62.5吗/ml来制备用于BCA蛋白法的BSA标准样品。将样品与50:1试剂A:试剂B的混合物在37t:下反应30分钟，然后测定562nm处的吸光度。使用标准曲线来测定蛋白浓度。就紫外吸收而言，通过将280nm的吸光度除以1.63来确定蛋白浓度，其中1.63是B4RCII的s值。
实施例13ICR小鼠的免疫
将ICR小鼠分为五组，包括阳性组(饮食诱导的肥胖病(DIO))、阴性对照(非DIO，正常组)、B4RCII免疫组、B4RB2免疫组以及B4TB2免疫组。将包含50pgB4RCn、 B4RB2或B4TB2的100nl溶液腹膜注射给6周龄的ICR小鼠。按照两周的定期间隔重复注射三次之后，监控体重并绘制出变化。在初级加强之后，供给高脂肪饮食来使小鼠患上DIO
(饮食诱导的肥胖病)。在初级加强之后一周以及二次加强之后一周、三周和五周，从尾部抽取血样。
如图11所示，直到初次注射和加强为止，各组中小鼠个体在体重上相似，均在22-23g的范围内。但是，从饮食诱导的肥胖病开始，发现对照(肥胖病)体重增加，而注射B4RCI1、 B4RB2或B4TB2的组显示体重仅有轻微增加。当其为14周龄(在初次注射之后8周)时，对照和B4RB2注射组在体重上大约有8g的差别，表明由初次注射诱导的弱免疫应答由二次注射加强，达到足以抑制体重增加的程度。在第三次注射之后，测定体重增加保持在预期的偏差范围之内。
实施例14通过间接酶联免疫吸附法(ELASA)使用血清样品测定抗体滴度
将100(il (100ng)的PB14置于微量滴定板的每个孔中。将微量滴定板在4。C下培育过夜，然后在封闭液(PBS， 0.5%酪蛋白，0.02%NaN3)中于37。C培育1小时。用冲洗缓冲液冲洗每个孔三次。将从实施例10中收集的血清样品以1:1000到1:8000稀释于PBS中。将100^1每种稀释的血清样品加入到每个孔中，并且在37"C下培育1小时。用冲洗缓冲液冲洗每个孔三次，然后用1:1000稀释的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体进行培育。
如图12所示，B4RB2或B4TB2免疫组的抗体滴度一直增加到14周龄为止，但在该点之后降低；而B4RCII免疫组的抗体滴度一直增加到16周龄为止，并在该点之后降低。实施例15血脂水平的评估
如下测定甘油三酯和胆固醇的水平。将4^1血清样品与200^1显色试剂混合，然后在37。C下培育5分钟，然后测定505nm和500nm处的吸光度。为了测定HDL水平，将血清样品与沉淀剂以1:1的比例混合，使其在室温下放置10分钟，然后在超过3000 rpm下离心IO分钟。将4^1离心上清液与200^1显色试剂混合，在37。C下培育5分钟，然后测定555nm处的吸光度。利用EZ LDL胆固醇试剂盒(Sigma)和LDL校准器(Randox)测定LDL-胆固醇水平。根据制造商提供的说明书，将4^1血清样品与该试剂盒中含有的1,150(il试剂混合，在37。C下培育5分钟，补充250)al该试剂，再次在37。C下培育5分钟。然后，测定600nm处的吸光度。利用测定的吸光度来确定每种脂类的血清水平，利用标准溶液获得标准曲线。
就血液中的脂类水平而言，如图13所示，发现预防接种组在血液总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG) 、 HDL胆固醇以及LDL胆固醇脂类水平上比对照(肥胖病)更低。
工业实用性
如至此所描述的，可将根据本发明的致免疫杂交多肽用于哺乳动物动物，例如狗、猫、牛等，以及人。所述杂交多肽具有诱导更一致和稳定的免疫应答的能力，其用于预防和治疗动物以及人的肥胖病。
权利要求
1.一种致免疫杂交多肽，包含(i)具有选自由序列编号1、序列编号2和序列编号3所组成的组的氨基酸序列的肽的单体或多聚体；(ii)狂犬病病毒辅助T细胞表位，或乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表位；以及(iii)小鼠载脂蛋白C II的C末端肽片段，或具有选自由序列编号1、序列编号2和序列编号3所组成的组的氨基酸序列的肽的单体或多聚体，顺序是从所述致免疫杂交多肽的N末端到C末端方向。
2. 根据权利要求1所述的致免疫杂交多肽，其中上述(i)所述的 多聚体包含两至八个肽，每个肽具有选自由序列编号1、序列编号2和序 列编号3所组成的组的氨基酸序列。
3. 根据权利要求2所述的致免疫杂交多肽，其中所述多聚体包含四 个肽，每个肽具有选自由序列编号1、序列编号2和序列编号3所组成的 组的氨基酸序列。
4. 根据权利要求3所述的致免疫杂交多肽，其中所述多聚体包含四 个具有序列编号1的氨基酸序列的肽。
5. 根据权利要求4所述的致免疫杂交多肽，其中所述多聚体具有序 列编号5的氨基酸序列。
6. 根据权利要求l所述的致免疫杂交多肽，其中所述狂犬病病毒辅 助T细胞表位具有序列编号6的氨基酸序列。
7. 根据权利要求l所述的致免疫杂交多肽，其中所述乙型肝炎病毒 表面抗原辅助T细胞表位具有序列编号7的氨基酸序列。
8. 根据权利要求l所述的致免疫杂交多肽，其中所述载脂蛋白CII 的C末端肽片段具有序列编号8的氨基酸序列。
9. 根据权利要求1所述的致免疫杂交多肽，其中上述(iii)所述的 多聚体包含两至四个肽，每个肽具有选自由序列编号1、序列编号2和序列编号3所组成的组的氨基酸序列。
10. 根据权利要求9所述的致免疫杂交多肽，其中所述多聚体包含 两个肽，每个肽具有选自由序列编号1、序列编号2和序列编号3所组成 的组的氨基酸序列。
11. 根据权利要求IO所述的致免疫杂交多肽，其中所述多聚体包含 两个具有序列编号1的氨基酸序列的肽。
12. 根据权利要求1所述的致免疫杂交多肽，包含(i)具有序列编 号1的氨基酸序列的肽的四聚体；(ii)狂犬病病毒辅助T细胞表位；以 及(iii)小鼠载脂蛋白CII的C末端肽片段，顺序是从所述致免疫杂交 多肽的N末端到C末端方向。
13. 根据权利要求12所述的致免疫杂交多肽，具有序列编号9的氨 基酸序列。
14. 根据权利要求l所述的致免疫杂交多肽，包含(i)具有序列编 号1的氨基酸序列的肽的四聚体；(ii)狂犬病病毒辅助T细胞表位；以 及(iii)具有序列编号i的氨基酸序列的肽的二聚体，顺序是从所述致免疫杂交多肽的N末端到C末端方向。
15. 根据权利要求14所述的致免疫杂交多肽，具有序列编号10的 氨基酸序列。
16. 根据权利要求1所述的致免疫杂交多肽，包含(i)具有序列编 号1的氨基酸序列的肽的四聚体；(ii)乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表位；以及(iii)具有序列编号1的氨基酸序列的肽的二聚体，顺序 是从所述致免疫杂交多肽的N末端到C末端方向。
17. 根据权利要求16所述的致免疫杂交多肽，具有序列编号ll的 氨基酸序列。
18. —种用于预防或治疗肥胖病的疫苗，包含权利要求1至17之一 所述的致免疫杂交多肽作为活性成分。
19. 一种多聚核苷酸，编码权利要求1至17之一所述的致免疫杂交 多肽。
20. —种重组表达载体，包含权利要求19所述的多聚核苷酸。
21. —种宿主细胞，用权利要求20所述的重组表达载体转化。
22. —种用于生产权利要求1所述的致免疫杂交多肽的方法，包括 培养用权利要求20所述的重组表达载体转化的宿主细胞。
全文摘要
本发明公开一种预防和治疗肥胖病的致免疫杂交多肽，其中将载脂蛋白B-100的B细胞表位的模拟肽、狂犬病病毒辅助T细胞表位或乙型肝炎病毒表面抗原辅助T细胞表位以及小鼠载脂蛋白CII的C末端肽片段或载脂蛋白B-100的B细胞表位的模拟肽以从该致免疫杂交多肽的N末端到C末端方向的顺序相互融合。此外，公开了一种包含该致免疫杂交多肽的用于预防和治疗肥胖病的疫苗组合物、编码该致免疫杂交多肽的多聚核苷酸、携带该多聚核苷酸的重组表达载体、固定有该重组表达载体的宿主细胞，以及通过培养由该重组表达载体转化的宿主细胞来制备所述致免疫杂交多肽的方法。
文档编号C07K19/00GK101516915SQ200780035653
公开日2009年8月26日 申请日期2007年9月21日 优先权日2006年9月25日
发明者李禧宗, 金晓骏 申请人:Sj Biomed株式会社