一种免疫避孕核酸疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种免疫避孕核酸疫苗，其包含编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列，其中所述编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表达载体中。所述真核表达载体可以为pCAGGS。本发明还提供了所述免疫避孕核酸疫苗的制备方法。所述核酸疫苗免疫小鼠后能诱发机体产生高滴度的特异性抗小鼠Izumo抗体，降低小鼠的生殖能力。此外，核酸疫苗免疫小鼠产生的特异性抗体能与小鼠精子蛋白发生特异性反应，也能有效的抑制小鼠的精卵结合。
【专利说明】一种免疫避孕核酸疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫避孕核酸疫苗及其制备方法，其中该免疫避孕核酸疫苗包含小鼠精子特异表达的精卵融合关键膜蛋白Izumo的核酸。本发明提供的免疫避孕核酸疫苗可用于小鼠的生育控制。
【背景技术】
[0002]鼠及其它有害哺乳动物，每年对全球的农林牧业造成严重的损失。目前，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界有老鼠170亿只以上，我国有老鼠40亿只以上，全世界由于鼠害造成粮食损失最高可达到收获量的15%_20%，相当于25个贫穷国家国民收入总值，够1.5亿人全年的口粮。在我国每年近千万亩森林和十亿亩草场被破坏成为沙漠或荒洲，损失超过30亿人民币。此外，鼠及其它有害哺乳动物能传播出血热、鼠疫等多种人畜共患传染性疾病，给人类身体甚至生命造成严重威胁。因此，研究低毒、无害、不污染生态环境的特异灭鼠技术和药品具有非常重要的意义。
[0003]免疫避孕是通过免疫与生殖相关的蛋白质或多肤分子，激活机体免疫系统，产生特异性体液免疫和/或细胞免疫，以中和或阻断相关分子的功能，从而影响正常生殖过程达到避孕的效果。精子在哺乳动物受精过程中必不可少，其对于雌雄性个体都具有免疫原性，但是精子本身不能作为避孕疫苗直接用于实践，这是因为精子表面和内部都存在大量与体细胞同源的抗原，如果直接免疫精子可能会导致其它组织或器官的免疫病理疾病。所以，用于避孕疫苗的理想精子抗原应该具备的特性有:精子表面特异性表达，较强的免疫原性，与生殖过程或人类免疫不孕相关，很少或没有不良反应等。2005年，日本学者Inoue发现了一种精子特异性膜蛋白Izumo，它属于免疫球蛋白超家族，在精卵融合过程中起关键作用。敲除了 Izumo基因的雄性小鼠完全不育；进一步的实验证实，这些不育小鼠的精子外观正常并能够结合和穿过卵透明带但却完全丧失了与卵膜融合的能力。因此，针对小鼠Izumo进行免疫抗生育研究，将为其作为免疫避孕候选抗原在控制老鼠及其他有害野生动物种群数量中发挥作用提供研究资料及科学依据。
[0004]核酸疫苗是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗，它是指将编码某种抗原蛋白的外源基因直接转移到动物体内，通过机体的表达系统合成抗原蛋白，诱导机体对该抗原蛋白产生免疫应答。与前两代疫苗相比，具有很多明显的优势，比如可诱导机体同时产生细胞免疫和体液免疫，应答持续时间长，表达的抗原其构像和抗原性与天然抗原相同，没有潜在致病危险等。近十年来，核酸疫苗在防治疾病、控制动物繁殖等方面的研究也引起世界各国的高度关注。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种免疫避孕核酸疫苗，其包含编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列。其中所述精子特异膜蛋白Izumo可以是任意哺乳动物的精子特异膜蛋白Izumo，包括大鼠、小鼠、牛、羊、马、猪、灵长类动物等。在一个实施方案中，所述精子特异膜蛋白Izumo是人的精子特异膜蛋白Izumo。在一个优选的实施方案中,所述精子特异膜蛋白Izumo是小鼠精子特异膜蛋白Izumo。在一个实施方案中，所述编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表达载体中,优选地,所述真核表达载体为pCAGGS。
[0006]本发明另一目的是提供该免疫避孕核酸疫苗的制备方法及用途。
[0007]在一个实施方案中，所述精子膜蛋白Izumo为小鼠精子膜蛋白Izumo，其编码基因位于小鼠的第7号染色体上,核苷酸序列号为XM_133424,全长1194bp,编码397个氨基酸。同源性分析显示小鼠Izumo的氨基酸序列与人类的存在57%的同源性。
[0008]为本发明的目的，所述核酸疫苗所用的真核质粒载体框架如图1所示，除具有真核表达载体基本元件外，还包含有编码小鼠精子蛋白Izumo的DNA序列。在一个优选的实施方案中，在所述编码小鼠精子蛋白Izumo的DNA序列起始端加入了 Kozak序列,增加真核表达载体的表达效率。在另一个实施方案中，同时在所述编码小鼠精子蛋白Izumo的DNA序列末端加入了 Flag标签序列，以便于该蛋白表达的检测。
[0009]在本发明的另一方面，提供了该免疫避孕核酸疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤:
[0010]1.精子Izumo基因的RT-PCR扩增
[0011]利用天根公司的动物组织总RNA提取试剂盒提取BALB/c附睾组织总RNA，以Oligo (dT)为引物进行cDNA第一链的合成。针对Izumo的cDNA设计了特异性PCR扩增引物。利用高保真酶Pfu进行目的基因Izumo的扩增，纯化回收目的基因片段进行测序，结果证明扩增的Izumo基因与报道的序列完全一致。
[0012]2.真核表达载体pCAGGS-1zumo构建
[0013]将扩增的Izumo基因(1194bp)利用EcoRI和XhoI酶切位点插入到真核表达载体pCAGGS中，构建了重组真核表达载体pCAGGS-1zumo。
[0014]3.真核表达载体pCAGGS-1zumo质粒的大量制备
[0015]将构建的重组真核表达载体pCAGGS-1zumo转化大肠杆菌DH5 α (菌种保藏:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。菌种保藏号为=CGMCC N0.6937，微生物(株):pCAGGS-1zumol号)，保藏日期:2012年12月7日，大量培养后利用大量高纯度无内毒素质粒提取试剂盒对质粒DNA进行提取，获得用于免疫用的质粒DNA纯品。
[0016]在一个实施方案中，所述精子Izumo基因为小鼠的精子Izumo基因。其中，在步骤
(I)中使用的扩增Izumo基因DNA序列的引物对序列如序列表SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2所示。
[0017]将纯化的小鼠精子Izumo核酸疫苗真核表达载体质粒直接免疫小鼠，通过宿主细胞的翻译系统在机体内表达出小鼠精子Izumo蛋白，激发机体的免疫应答，产生高滴度的特异性抗小鼠Izumo抗体，阻断小鼠正常的生殖功能，使小鼠的生殖能力下降65%。
[0018]另一方面，本发明还提供了编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列在制备免疫避孕核酸疫苗中的用途，其中包括将所述编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表达载体，构建重组真核表达载体的步骤。
[0019]在本发明的其他方面，本发明还提供了所述核酸疫苗的用途，例如用于对小鼠的生育控制，将为小鼠精子蛋白Izumo作为免疫避孕候选抗原在控制老鼠及其他有害野生动物种群增长中发挥作用提供研究资料及科学依据。
【专利附图】
【附图说明】:
[0020]图1.真核表达载体pCAGGS-1zumo的结构框架图
[0021]图2.小鼠精子Izumo基因的RT-PCR扩增结果
[0022]图3.真核表达载体pCAGGS-1zumo在HEK293T细胞中表达的Westernblot检测结果
[0023]图4.真核表达载体pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清抗体滴度检测结果
[0024]图5.真核表达载体pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清抗体与小鼠精子反应的检测结果
[0025]图6.真核表达载体pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清抗体抑制小鼠精卵结合的检测结果
[0026]图7.真核表达载体pCAGGS-1zumo免疫小鼠睾丸和附睾组织病理学检测结果【具体实施方式】:
[0027]下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
[0028]实施例1精子 特异表达的精卵融合关键膜蛋白Izumo的生物信息学分析
[0029]精子蛋白Izumo是在小鼠睾丸组织和精子中特异表达的I型膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，其编码基因位于小鼠第7号染色体上，核苷酸序列号为XM_133424。根据小鼠Izumo的全长mRNA序列分析可知,其编码基因全长1194bp,前体蛋白由397个氨基酸组成，氨基端(l_21aa)有信号肽序列,羧基端(320_340aa)有疏水性的跨膜区序列。小鼠Izumo可能的功能域是细胞外免疫球蛋白样结构域(161-251aa)。在此结构域中，Asn 204是潜在的N连接糖基化位点，Cysl82和Cys233形成分子内二硫键。同源性分析显示，小鼠Izumo蛋白的氨基酸序列与人类存在57%的同源性。
[0030]实施例2小鼠精子Izumo基因的PCR扩增
[0031]试剂及仪器:
[0032]Trizol Reagent (Invitrogen 公司，美国)
[0033]EcoRI和XhoI限制性内切酶，T4DNA连接酶、MLV逆转录酶、RNaseInhibitor均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司
[0034]克隆载体pBluescript II KS+ (Stratagene,美国)
[0035]高保真pfu DNA聚合酶(NEB公司，美国)
[0036]普通DNA凝胶回收试剂盒(博迈德科技有限公司，中国)
[0037]紫外分光光度计(Bio-Rad公司，美国)
[0038]DNA Engine Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad 公司，美国)
[0039]实验方法:
[0040]1.通过分析GenBank中发表的小鼠精子Izumo核苷酸序列(序列号为XM_133424),利用Primer Premier5.0软件在线设计了一对扩增小鼠精子Izumo编码区序列1194bp的特异性引物。为了克隆、表达需要在引物两端分别引入酶切位点EcoRI和Xhol，PCR引物序列为:
[0041]Pl:5，-ctgaattcGCCACCATGGGGCCGCATTTTACACT-3’ (EcoRI) (SEQ ID NO:1)
[0042]P2:5’ -tcctcgagTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTTTTCTGTTGCCTCGCT-3’ (XhoI)SEQ ID N0:2)。上述引物序列中的小写字母分别表示相应的酶切位点。所述引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
[0043]2.无菌采集正常BALB/c小鼠的新鲜睾丸组织,采用Invitrogen公司的Trizol试剂一步法提取总RNA，具体操作方法参照试剂盒说明书。经紫外分光光度计测定其浓度。以Oligo d(18T)为引物在MLV逆转录酶作用下合成cDNA第一链。具体方法如下:向提取的总RNA中分别加IOmM oligod(18T) Iul混合，70°C水浴lOmin，取出置于冰上，随后加5XRTbuffer 5ul, IOmM dNTP 2.5ul，40U/ul RNA 酶抑制剂 lul，200U/ul MLV 逆转录酶 Iul，补加无RNA酶水至总体积25ul，于42°C保温Ih进行反转录，再70°C水浴lOmin，所得cDNA_20°C保存备用。
[0044]3.取反转录产物 2 μ L，5 XPCR buffer 5 μ L、上、下游引物(IOpmol/μ L)及 IOmMdNTPs各0.5 μ L，高保真pfu DNA聚合酶0.25 μ L (2000U/mL)，加超纯水至25 μ L。具体反应条件如下:扩增Izumo基因为98°C预变性30s，98°C变性10s，60°C退火15s、72°C延伸30s，33个循环后72°C再延伸5min，最后冷却至4°C，结束反应。以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果，见图2。利用普通DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法参照试剂盒说明书。再以内切酶EcoRI和Xho I酶切Izumo基因及pBluescript II KS+载体，电泳回收各自目的片段，体外用T4连接酶16°C连接过夜，转化DH5a感受态细胞，挑取单菌落进行鉴定，获得含有小鼠Izumo基因的pBluescript-mlzumo载体质粒,并送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序测定。测 序结果表明扩增的小鼠Izumo基因与报道的序列完全一致。
[0045]实施例3真核表达载体pCAGGS-1zumo的构建、鉴定及质粒大量制备试剂及仪器:
[0046]EcoRI和XhoI限制性内切酶、T4DNA连接酶(TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司)
[0047]真核表达载体pCAGGS (Invitrogen公司，美国)
[0048]转染试剂Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司，美国)
[0049]HEK293T细胞由国家生物医学分析中心张学敏教授惠赠
[0050]DMEM高糖培养基、特级胎牛血清和胰酶(HyClone公司，美国)
[0051]抗Flag标签的鼠单克隆抗体(Sigma公司，美国)
[0052]辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG (Cell Signaling公司，美国)
[0053]Western发光检测试剂盒(威格拉斯生物技术有限公司，中国)
[0054]大量高纯度无内毒素质粒提取试剂盒(博迈德科技有限公司，中国)
[0055]紫外分光光度计(Bio-Rad公司，美国)
[0056]实验方法:
[0057]取鉴定正确的pBluescript-1zumo质粒和真核表达载体pCAGGS质粒利用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，电泳回收各自目的片段，体外利用T4连接酶16°C连接过夜，转化DH5ci感受态细胞，挑取单菌落进行鉴定，获得含有小鼠Izumo基因的重组载体pCAGGS-1zumo质粒，并送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序测定。测序结果表明构建的重组载体pCAGGS-1zumo完全正确。
[0058]HEK293T细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，置于37°C、5%C02的培养箱中。采用胰酶消化法进行细胞传代。将生长状态良好的HEK293T细胞接种于12孔培养板，待细胞密度达50%-60%时，参照Lipofectamine 2000使用说明进行转染，48h收取细胞进行Western blot印迹检测。用PBS清洗收集的细胞,用预冷的三去污蛋白裂解液[50mmol/LTris-HCl (pH 8.0)，150mmol/LNaCl, 0.1%SDS, 1%NP_40，0.5% 去氧胆酸钠，10% 体积的蛋白酶抑制剂]于冰上裂解20min，随后加入等体积的2 X SDS上样缓冲液，100°C煮沸lOmin，离心取上清；用10%SDS-PAGE分离蛋白质，湿转法转移至PVDF膜上，取出膜于封闭液(5%脱脂奶粉溶于TBS中)中室温封闭Ih ;根据Flag标签的鼠抗说明书,室温孵育一抗(1:2500倍)lh, TBST洗3次，每次IOmin,室温孵育HRP标记的羊抗鼠IgGC 1:2500倍)lh，TBST洗3次，TBS洗I次,每次IOmin,随后用Western发光检测试剂于暗室压片显影。结果在约56kD处有特异条带(图3)，符合理论预期，表明构建的真核表达载体质粒能够正确表达目的蛋白。
[0059]取鉴定正确的真核表达质粒pCAGGS-1zumo宿主菌，利用LB培养基扩大培养，采用博迈德科技有限公司的大量高纯度无内毒素质粒提取试剂盒对质粒DNA进行提取，并紫外分光光度计测定其浓度。稀释质粒浓度为lmg/mL。20°C保存备用。
[0060]实施例4真核表达载体pCAGGS-1zumo免疫小鼠的血清抗体滴度检测结果
[0061]试剂及其制备方法:
[0062]包被稀释液组成和配制:由0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液组成，1.5g的Na2CO3和2.9g的NaHCO3混合后，加双蒸馏水至1000mL,调至pH9.6。
[0063]封闭液组成和制备:5%BSA-PBS溶液，BSA 5g加入PBS (pH7.4) IOOmL得到
[0064]磷酸盐缓冲 液(PBS):
[0065]A液:0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，制备方法为NaH2PO4.H2O 27.6g溶于双蒸馏水1000mL0
[0066]B液:0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液，制备方法为Na2HPO4.12H20 71.6g溶于双蒸馏水 1000mL。
[0067]样本稀释液:PBS，0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水，制备方法:A液19mL与B液8ImL混合,加入NaCl 18.5g,加双蒸懼水至1000mL。
[0068]洗涤液=PBST,ρΗ7.4，制备方法=PBS 液 1000mL 加 Tween20 0.5mL，调至 ρΗ7.4。
[0069]底物液:0PD-H202来源:0PD (邻苯二胺 < 盐酸盐>)(Sigma公司，美国)
[0070]A液:0.lmol/L柠檬酸溶液，制备方法:柠檬酸19.2g,加双蒸馏水至1000mL。
[0071]B 液:0.2mol/L Na2HPO4 溶液，制备方法=Na2HPO4.12H20 71.7g，加双蒸馏水至1000mL0
[0072]终止液:2mol/L H2SO4溶液，制备方法:向双蒸馏水600mL中缓缓滴加浓硫酸IOOmL并不断搅拌后，加双蒸馏水至900mL。
[0073]辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (Cell Signaling公司，美国)。
[0074]牛血清白蛋白(BSA) (Sigma公司，美国)。
[0075]主要仪器:
[0076]酶标仪(Bio-Rad公司，美国)
[0077]实验方法:
[0078]实验动物分组:健康雄性BALB/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)20只，6~8周龄，16~18g，随机分为2组，为真核表达载体pCAGGS-1zumo (组I)和真核表达载体pCAGGS (组2)，取提取的重组pCAGGS-1zumo质粒按100 μ g/只剂量免疫小鼠。
[0079]免疫程序:首次免疫，将质粒按100 μ g/只/次的剂量分两点注射到BALB/c小鼠后腿股四头肌；间隔2周，加强免疫2次。免疫结束后14天，将接受免疫的小鼠尾静脉取血,收集其血清。
[0080]标本的采集和分离:从免疫小鼠尾静脉采血，分离血清，于_20°C冰箱保存备用。
[0081]间接酶联免疫(ELISA)方法检测抗体:采用标准间接ELISA法测定血清中抗体滴度，分别测定每组动物特异性抗体滴度。用96孔酶联板包被原核表达的6His-1Zumo蛋白抗原(10μ g/mL)，每孔100 μ 1，置4°C包被过夜，弃去孔中液体；用5%BSA_PBS封闭酶标反应孔，37°C恒温水浴箱Ih后，洗涤液满孔洗涤3次，每次3min。将100倍稀释的血清加入各孔，每孔100 μ 1，37°C恒温水浴箱Ih后洗涤3次；加入酶标二抗，37°C恒温水浴箱lh，加入底物0PD，每孔100 μ 1，置室温避光显色反应lOmin，终止反应，于20min内，用酶标仪于492nm测定吸光度A值，以正常小鼠血清作阴性对照。待测标本OD值/阴性对照OD值>
2.1判定为阳性。免疫雄性小鼠血清抗体检测结果见图4。
[0082]检测结果显示:表达小鼠精子Izumo的真核表达载体pCAGGS-1zumo免疫小鼠血清中针对小鼠Izumo蛋白产生了较高滴度的抗体。
[0083]实验例5真核表达载体pCAGGS-1zumo免疫小鼠的抗生育效果
[0084]实验方法:
[0085]实验动物分组:健康雄性BALB/c小鼠(北京军事医学科学院实验动物中心提供)20只，6~8周龄，16~18g，随机分为2组，为真核表达载体pCAGGS-1zumo (组I)和真核表达载体PCAGGS (组2)，按100 μ g/只剂量免疫小鼠。
[0086]免疫程序:首次免疫，将质粒按100 μ g/只/次的剂量分两点注射到BALB/c小鼠后腿股四头肌；间隔2周，加强免疫2次。免疫结束后观察14天，再将免疫小鼠与正常的健康雌性小鼠按照1:1比例合笼饲养。合笼14天后分笼，分笼4天后，每日上午观察小鼠生产情况，并统计产仔数，结果见表1。
[0087]表1本发明核酸疫苗免疫小鼠的抗生育效果检测结果(*P < 0.05)
[0088]
【权利要求】
1.一种免疫避孕核酸疫苗，其包含编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列。
2.权利要求1所述的免疫避孕核酸疫苗，其中所述编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表达载体中，从而能够在真核细胞中表达精子特异膜蛋白Izumo。
3.权利要求1-2任一项所述的免疫避孕核酸疫苗，其中所述编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列是小鼠的Izumo编码序列。
4.权利要求3所述的免疫避孕核酸疫苗，其中所述真核表达载体为pCAGGS，并且所述小鼠编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表达载体pCAGGS的CMV增强子和鸡β-actin启动子下游。
5.权利要求4所述的免疫避孕核酸疫苗，其中在所述编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列起始端加入了 Kozak序列。
6.一种免疫避孕核酸疫苗的制备方法，其包括如下步骤:(I)利用RT-PCR技术从小鼠睾丸组织总RNA扩增得到编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列；(2)将扩增得到的Izumo编码序列插入到真核表达载体中，构建重组真核表达载体；(3)大量制备步骤(2)构建得到的真核表达载体，纯化，获得免疫避孕核酸疫苗。
7.权利要求6的制备方法，其中在步骤(1)中使用的扩增编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列的引物对序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。
8.权利要求6或7的制备方法，其中步骤(2)中使用的真核表达载体为pCAGGS，并且所述编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表达载体pCAGGS的CMV增强子和鸡β-actin启动 子下游。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中在所述编码小鼠精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列起始端加入了 Kozak序列。
10.编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列在制备免疫避孕核酸疫苗中的用途，其中包括将所述编码精子特异膜蛋白Izumo的DNA序列插入到真核表达载体，构建重组真核表达载体的步骤。
【文档编号】A61K39/00GK103961718SQ201310006851
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月29日 优先权日:2013年1月29日
【发明者】汪莉, 王玉民, 侯小强, 田利源, 郭振东, 张斌, 胡亚欧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所