¹³¹I标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2及其应用的制作方法

专利名称：：¹³¹I标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种放射性抗肿瘤抗体，特别涉及一种用mI标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2及其应用。
背景技术：
：随着医学技术的不断发展，放射免疫治疗(RIT)是除手术、放化疗外的又一肿瘤治疗手段。RIT是将放射性核素标记抗肿瘤抗体注射入体内，单克隆抗体及标记核素特异性地与肿瘤细胞结合(定向制导)，将放射性核素携带到肿瘤部位，放射性核素衰变过程中发出的射线对肿瘤细胞DNA造成损伤，最终造成肿瘤细胞生长抑制和坏死。放射免疫治疗是继肿瘤化疗和放射治疗后又一全新的治疗方法，它结合了单克隆抗体的靶向作用与放射性核素内照射的强杀伤作用，具有疗效好、副作用低的特点。国内外已有学者利用核素对胶质瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肝癌、腹膜癌、肺癌、骨与软组织肿瘤以及前列腺癌骨转移等进行诊断及治疗。目前市场上所用单克隆抗体多为鼠源性的抗体，这些抗体因为人抗鼠免疫反应而不适合于临床运用。针对肺癌的放射免疫治疗(RIT)有人用钇-90标记抗肺癌单克隆抗体LC-1采用局部治疗的给药方式，抑瘤率较低；唯一上市的新药131I-chTNT其作用机制是晚期实体肿瘤的典型特征是存在大量的变性坏死细胞，在细胞出现变性坏死的过程中，细胞膜会出现许多裂隙，胞浆内大量成分流失到胞外，细胞内的染色体的三维结构遭到破坏，产生大量变性DNA单链复合体，这种单链复合体就是131I-chTNT作用于实体肿瘤的靶点，故该药物仅适用于放、化疗失败的晚期肺癌患者。
发明内容本发明提供了一种肿瘤靶向性好的、抑瘤率较高的、适用于各期非小细胞肺癌的1311标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2。采用的技术方案如下以浓度是200pg/ml的人源化1E2抗体、放射性比活度大于2.5GBq/ml的Na1311、浓度是lpg/pl的氯氨T为原料，三者体积比是1:2:1进行取样，使用常规氯胺T法制得；人源化1E2抗体为本发明人制备保存，使用前用pH7.5、浓度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为200i_ig/ml;其余所有的原材料制剂均可购买得到。人源化1E2抗体的制备方法如下手术中切取病理证实为非小细胞肺癌患者的癌旁淋巴结，抽提淋巴结组织内的总RNA，利用噬菌体抗体库构建技术得到含1E2抗体的噬菌体抗体库，利用氨甲酰磷酸合成酶抗原吸附噬菌体抗体1E2，经洗涤、筛选、扩增得到对CPS1特异的人源化抗体1E2，最后进行鉴定和抗体活力分析。单克隆抗体的选择在放射免疫治疗中是非常重要一方面。本发明经过大量的筛选用人源化1E2作为标记抗体。1E2是抑制肺癌细胞生长的单克隆抗体，其与肿瘤细胞膜结合，抑制癌细胞增殖，以单克隆抗体与放射性核素联合进行导向治疗，在制备方法上使用常规氯胺T法标记131I-1E2简单有效，标记率为77.73%,放化纯度为95.63%，放射性比活度为432MBq/吗。在治疗效果上其优点是将放射性核素的优点和人源化单克隆抗体集于一体，一方面，核素的放射性杀伤作用范围可达数十个细胞直径，在一定程度上克服了肿瘤抗原的表达异质性所造成的盲区，而且核素对瘤细胞能直接杀伤，不需免疫毒素或免疫药物的内在化过程。核素的杀伤作用不依赖于DNA的合成(对静止期肿瘤细胞也有杀伤作用)。另一方面，有抗体导向的治疗优点，提高了药物对肿瘤细胞的耙向性，从而提高疗效，从其作用机制来看，适用于各期非小细胞肺癌的治疗。由于使用了人源化单克隆抗体，具有高效、低毒、病人不易产生抗药性等优点，大大减少了人抗鼠免疫反应，从而减少副作用，更适合临床应用。同时又克服了鼠单抗半衰期短、反复应用会引进病人的HAMA等缺点，人源性单抗已成为继手术切除、放疗及化疗后又一治疗肿瘤的药物。为了证明1311标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2对非小细胞肺癌的治疗效果，做了下述试验先建立Lewis肺癌荷瘤鼠模型，40只荷瘤小鼠成瘤后随机分为四组生理盐水对照组(NS0.1ml);单纯1E2抗体组(注射1E23吗)；1311标记IgG组(注射131I-IgG18.5MBq);1311标记1E2抗体组(注射131I-1E218.5MBq),l次/2天，共10次，注射标记抗体前2日，小鼠饮用0.1。/。KI溶液以封闭甲状腺。采用游标卡尺每3天测量一次肿瘤最大直径(a)和最大垂直直径(b)。21天后处死小鼠，剥离瘤体、测量肿瘤组织重量。对肿瘤体积大小和重量进行单因素方差分析。肿瘤体积计算公式为V(mm3)=1/2xabH十算，长度单位mm;肿瘤体积抑瘤率抑瘤率气Vo—Vn)/Vo><100%(Vo为对照组体积，Vn为治疗组体积)。观察病理学改变，21天后处死小鼠，取治疗组和对照组肿瘤组织10%福尔马林固定，石腊包埋切片后HE染色，镜下观察病理学改变。结果显示1、^I-1E2在小鼠体内的分布荷瘤小鼠注射标记抗体后36h肿瘤的每克组织百分注射剂量率(%ID/g)最高为11.61，此时瘤/血比值=4.73,瘤/肝比值=7.44，瘤/脾比值=7.07，24小时后mi-lE2在肿瘤组织内浓度较其他各部位高(尸<0.05)，证明mi-lE2抗体在肿瘤组织中浓聚(表l)。表1."I-1E2瘤内注射后不同时间小鼠体内的分布情况(王土S)单位％ID/g<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、各组小鼠肿瘤重量、体积、抑瘤率比较21天后测量肿瘤体积和重量(表2)，SNK-q检验表明1311标记1E2抗体组与其他三组有差异，而其他三组间比较无明显差异，说明131I-1E2明显抑制肿瘤生长，抑瘤率高达78.3%。表2各组肿瘤重量与体积比较及抑瘤率(5士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*与对照组比较，尸<0.053、镜下可见^I标记1E2抗体组大片肿瘤细胞坏死，核浓縮、核碎裂，呈玻璃样变。而其它三组病理切片细胞核分裂相多见，明显异型性，未见大片组织坏死。由此可知注射131I-1E2后肿瘤生长速度明显低于对照组，131I-IgG组虽然也局部注射了高剂量1311，肿瘤生长速度明显快于^I-1E2组，单用单抗组虽对肿瘤生长有一定的抑制作用，但效果不明显，由此可见只有将单抗与放射性核素相结合，才能起到良好的杀伤肿瘤细胞的作用，使抑瘤率得到大大提高。本发明无明显的临床毒副作用，可对肿瘤进行局部注射治疗也可以静脉注射治疗，但局部注射效果优于静脉注射，适用于各期非小细胞肺癌的治疗。本发明的有益效果是本发明用mI标记抗肺癌人源化单克隆抗体1E2，将放射性核素的优点和人源化单克隆抗体集于一体，两者协同作用，提高对肿瘤的耙向性，对肿瘤生长有明显的抑制作用，大大提高了抑瘤率。同时本发明采用的是人源化单克隆抗体，大大减少了免疫反应，适用范围更加广泛，对各期非小细胞肺癌都有效。具体实施例(共5例)实施例l制备人源化抗肺癌单克隆抗体1E2(1)噬菌体抗体库的构建①总RNA的提取手术切取肺癌患者癌旁淋巴结(病理证实为非小细胞肺癌)10g，无菌纱布包好后迅速放入液氮中冻存，在盛有液氮碾钵中迅速把淋巴组织碾成粉末，然后再利用RNA抽提试剂盒进行提取，得到总RNA。②VH和VL基因片断的扩增以01igodT-Adaptorprimer作为引物合成cDNA，PCR条件为50°C30min，99。C5min，5。C5min，一个循环。然后以cDNA为模板，以上下游引物配对分别扩增轻链基因片断和重链基因片断，PCR条件为94°C2min，一个循环，94。C30sec，55。C30sec，72°C90sec，三十个循环。最后利用Linker引物分别扩增VH—Linker基因片断和VL—Linker基因片断，PCR条件为94。C2min，一个循环，94°C30sec，60。C30sec，72。C90sec，三十五个循环。得到VH—Linker基因片断和VL—Linker基因片断。③Scfv基因片段的连接及PCR扩增将胶回收纯化的VH—Linker基因片断和VL—Linker基因片断进行连接，反应条件为94°C5min，一个循环，94°Clmin,60°Clmin，72°C90sec，五个循环。从而将VH基因片断和VL基因片断连接形成scfv基因片断。然后再向反应体系中加入scfv扩增的引物(带有酶切位点)，反应条件为94°C30sec，60°C60sec，72°C90sec，五个循环。形成两端分别带有酶切位点的scfv基因片断。④重组质粒的构建用T4DNA连接酶连接经sfiI限制性内切酶和NotI限制性内切酶双酶切ScFv基因片断和PCANTAB-5E载体，用电穿孔法转化TG感受态细胞，铺于氨苄青霉素选择培养基上，培养过夜，计算克隆数。随机挑取24个转化后TG1菌落，分别加入到2-YT培养液中振荡培养过夜，提取质粒，用PCR检查DNA中有无ScFv基因插入。⑤抗体库的构建将阳性细菌克隆铺于S0BAG平板上37。C培养过夜，再加入10ml2-YT培养液收聚菌液。用2-YT培养液稀释至A600二0.3。加入氨苄青霉素，终浓度为IOOug/ml，葡萄糖的终浓度为2%。37°C150rpm振荡培养lh，再加入5.lX101Qpfu的M13K07至终浓度为4X109，37°C250rpm振荡培养lh。4000g离心20min，弃上清。沉淀重悬于100m1-YTAK培养液，30°C250rpm振荡培养过夜。10000g离心10min沉淀细菌，取上清加入1/5的PEG/NaCl，冰浴60min。10000g4。C离心20min，弃上清。沉淀重悬于lml2-YT培养液，10000g再次离心10min，上清中加入终浓度为O.02%的叠氮钠。4'C保存。(2)噬菌体抗体库的亲和筛选用lmlscFv噬菌体抗体库溶液，加入浓度为300ug/ml氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)抗原lml，静止30分钟。②PBS洗涤去除非特异性结合物，收集与抗原CPS1结合的噬菌体抗体1E2;③感染大肠杆菌，使特异的噬菌体抗体1E2扩增富集，便可得到对CPS1特异的人源化抗体1E2。(3)阳性噬菌体单克隆PCR鉴定挑取第三轮筛选出的单克隆，提取单克隆质粒进行抗体基因克隆.随机挑取20个单克隆，加入3mL含lOOmg/L氨苄青霉素的2-YT培养液过夜培养，常规提取质粒.以质粒为模板进行PCR反应，然后以IOg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定是否扩增出目的基因。(4)阳性噬菌体单克隆酶切鉴定随机挑取10个单克隆质粒以NheI及BssHII双酶切，以IOg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定是否含有目的基因.(5)阳性单克隆抗体活性分析挑取阳性单克隆，以不含目的基因的载体为对照.按前述方法进行噬菌体表面呈现，收集上清即为噬菌体抗体.将单克隆抗体及对照上清加入接种有人成纤维细胞及肺癌细胞的96孔板过夜，再加入HRP-羊抗M1337°C温育lh，加入TMB显色IOmin，加入2mol/L硫酸终止反应.酶标仪读板，以P/N〉2.l为阳性.实施例2用氯氨T法制备1311标记1E2抗体方法如下1、碘化反应取实施例1制备的人源化1E2抗体10昭，用pH7.5、浓度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为200pg/ml，精确量取50pl备用；取放射性比活度5.5GBq/ml的Na1311100再取浓度是lpg/|il的氯氨T50pl，将三者混匀，加入放有磁力搅拌子的玻璃试管中，置于磁力搅拌器上充分摇匀，在室温下反应60s;2、终止碘化反应60s后立即加入偏重亚硫酸钠(Na2S205))100|ig,体积100pl，终止碘化反应；3、分离纯化(1)、将标记反应液注入lcmxl5cm规格的SephadexG50层析柱，PBS溶液(pH=7.4)洗脱，流速为10滴/min，用试管分段收集，10滴/管，收集100管；(2)、在r-计数仪上测定每管的每分钟放射性计数(countsperminute,cpm)，绘制纯化曲线，对两次纯化曲线进行比较，确定Na^I放射峰的位置。收集第一次纯化的第一个放射峰的反应液，得到纯化的1311标记的1E2抗体。实施例3对实施例2所制备的纯化1311标记的1E2抗体进行标记率和放化纯度的鉴定三氯乙酸为展开剂，以新华1号滤纸为支持物，对分离纯化前后的反应液作纸层析检测标记率和放化纯度，公式1311标记1E2抗体峰的放射性强度(cpm)标记率(％)=-xl00%卞总放射性强度(cpm)=77.73%层析后1311标记1E2抗体峰的放射性强度(cpm)放化纯度(％)=xinn<)/层析后总放射性强度(cpm)1U"/e=432MBq/jxg实施例4131I标记1E2抗体浓度测定-将1E2抗体倍比稀释成20pl、10pg/100pl、5ng/100pl、2.5(ig/100pil、1.25pl、0.625ng/100(il、0.3125ng/100^作为标准浓度，和待测的131I标记1E2抗体各100pi分别装入5ml试管中，加入考马斯亮蓝lOOpl混匀；30分钟后用分光光度计在波长595测定每个试管的吸光度(OD595);用以上相同方法测量两次；根据吸光度建立回归方程夕=a+6x计算出被标记物的浓度为18.65pg/100pl。实施例51311标记1E2抗体的比活度的计算测量标记物的放射性，然后求出放射性比活度，公式始fr+W"^沐存n/m/、标记抗体的放射性活度(MBq)O《"o/放射性比活度(MBq///g)=-m^^-s,~100%=95.63%标记抗体的质量(//g)权利要求1、一种131I标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2，其特征是以浓度是200μg/ml的人源化1E2抗体、放射性比活度大于2.5GBq/ml的Na131I、浓度是1μg/μl的氯氨T为原料，三者体积比是1∶2∶1进行取样，使用常规氯胺T法制得；所述人源化1E2抗体的制备方法如下手术中切取病理证实为非小细胞肺癌患者的癌旁淋巴结，抽提淋巴结组织内的总RNA，利用噬菌体抗体库构建技术得到含1E2抗体的噬菌体抗体库，利用氨甲酰磷酸合成酶抗原吸附噬菌体抗体1E2，经洗涤、筛选、扩增得到对CPS1特异的人源化抗体1E2，最后进行鉴定和抗体活力分析。2、如权利要求1所述的1311标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种用¹³¹I标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1E2。以人源化1E2抗体、Na¹³¹I、氯氨T为原料，使用氯胺T法标记制得纯化的¹³¹I标记1E2抗体。其中人源化1E2抗体是取非小细胞肺癌患者的癌旁淋巴结，抽提淋巴结组织内的总RNA，利用噬菌体抗体库构建技术得到含1E2抗体的噬菌体抗体库，利用氨甲酰磷酸合成酶抗原吸附噬菌体抗体1E2，经洗涤、筛选、扩增得到对氨甲酰磷酸合成酶特异的人源化抗体1E2。本发明应用了放射免疫治疗技术，将放射性核素的优点和抗肿瘤细胞人源化单克隆抗体集于一体，提高了药物对肿瘤细胞的靶向性和疗效，减少了副作用和不良免疫反应，适用范围更加广泛，适用于各期非小细胞肺癌的治疗。文档编号A61K101/02GK101407545SQ200810233139公开日2009年4月15日申请日期2008年11月27日优先权日2008年11月27日发明者吴永忠,平季,尹晓玲,华庞,涛张,彭志平,明文,李少林,林海波,东段,陈晓品申请人:重庆医科大学