专利名称：载缓释抗菌肽组织工程骨及其制作方法
技术领域：
本发明属于医用植骨材料，具体的说，涉及一种附载有缓释抗菌肽的组织 的工程骨及其制备方法。
技术背景在日常中开放性骨折手术后感染率达3 29%;在战时火器伤中，由于组织 损伤和污染严重，在弹道周围0.5cm以内有大量细菌存在，即使清创后骨及软 组织的感染率仍高达25% 40%，如使用内固定则感染率增加30%以上。在开放 性骨折中，尤其是战时火器伤往往同时具有骨缺损和细菌污染。对于兼有骨缺损和细菌污染骨缺损的开放性骨折， 一般传统的治疗方法是-先使用彻底清创或病灶清除等外科手段去除大部分细菌；在此基础上，使用外 固定支架临时固定骨折断端；全身或局部应用大剂量抗生素消灭残留细菌；待 伤口关闭，确实无感染后3 6月，再行II期植骨修复。而I期植骨，原则上 是禁忌症。这是因为污染的骨缺损，即使在严格正规的清创手术后，仍有部分 致病菌残留。细菌与植入物材料粘附以及形成完整的生物膜是固定物相关感染 的主要病理基础，而金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌占深部检出细菌的70 90%，其中耐甲氧西林金葡菌约60%，近来甚至出现了耐万古霉素金葡菌，导致 临床面临无抗生素可用的严峻局面。I期清创后立即进行植骨，残留的致病菌会 在植入物上粘附并大量繁殖，形成生物膜使其毒力大增，远远超出了抗生素传统应用方法的抗菌能力。因此，目前临床上才会采用先使用外固定，再换成内固定，同时进行植骨的方式。但是外固定具有针道感染率高(5.9% 19%)、在 干骺端骨折中不易固定、钢针松动和严重影响患者生活、不便于护理等缺点。 而且多次手术对患者的身体、心理均是极大的创伤，同时也造成了高额的医疗 费用。如果按传统的方式，早期即大剂量在全身或局部使用抗生素，其弊端也 是显而易见的。前者，往往由于局部损伤和血循破坏导致全身血中抗生素难以 在损伤局部达到有效抗菌浓度；后者，虽然能够在局部初始产生高浓度的抗生 素，但常易被稀释而不能维持有效浓度。同时，大剂量的抗生素还会导致耐药 菌的加速出现，最终可能面临无药可用的境地。这两种方法均难以在感染性(污 染性)骨缺损I期植骨手术中，起到预防和治疗细菌感染的作用。因此，目前 迫在眉睫需要解决的问题是对于感染性(污染性)骨缺损的开放性骨折，如 何既能早期早期植骨和预防感染性骨不连的发生，同时又可以有效治疗感染性 骨缺损。因此， 一直以来，改进抗生素的应用方法，提高植骨材料的抗感染能力， 是保证开放性骨折和其他原因所导致的骨缺损在清创或病灶清除后I期植骨修 复骨连续性的关键。近年来，有具有抗生素局部缓释作用的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)抗生素链珠、载抗生素骨水泥等产品，这些产品虽具有抗感染能力， 但其载体均不是植骨材料，难以为机体吸收，需要再次手术取出；把抗生素和 羟基磷灰石等成骨材料及骨生长因子结合在一起，使在植入羟基磷灰石等植骨 材料的同时缓释抗生素的方法，其生物相容性并不如组织工程骨，其抗菌性能 针对耐药菌和生物膜存在的状态均无效，抗生素简单和组织工程骨混合的方法 也仅仅只是增加了局部的抗生素浓度，其释放过程不能真正有效的长期维持抗生素浓度，尤其是面临耐药菌和生物膜的困境时，上述方式释放的抗生素更是无效。发明内容为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种强力抗感染和抑制细菌 生物膜形成的组织工程骨。本发明目的之二在于提供一种制备强力抗感染和抑制细菌生物膜形成的组 织工程骨的方法。本发明的目的是这样实现的载缓释抗菌肽组织工程骨，其关键在于所述载缓释抗菌肽组织工程骨由植 骨材料载体和包裹有e—防御素一1 3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球组 成，所述包裹有P —防御素一1 3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球附着在植 骨材料微孔内；其中所述植骨材料为脱蛋白松质骨或脱钙松质骨。上述包裹有e—防御素一1 3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球粒径为 230土60um。载缓释抗菌肽组织工程骨的制作方法，按如下步骤进行(1) 选取脱蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体备用；该植骨材料载体能够直接购买和自己制备。(2) 制备含有e—防御素一l 3或乳铁蛋白l-ll的海藻酸盐控释微球采用乳化离子交联法制备，在35 38。C温度下配制1.1 1.8%的海藻酸钠溶液 100ml，加入0.5 0.8mol/mlP —防御素一1 3或乳铁蛋白1-ll混合均匀；加入 橄榄油ll 14ml，加入1.2 1.7 ml司盘- 80和0. 3 0， 5ml吐温-80，混合均匀; 1000 1500 r/min搅拌5 7min，搅拌中滴入l. 2 1. 7mol/L氯化转溶液10 15ml,形成水/油乳剂(W/0乳剂)；然后改用磁力搅拌器慢速搅拌20 40min， 交联固化；将乳剂转移至试管中，静置7 9h，取下层2000 2500r/min冷冻离心 3 5min，分离微球，用蒸馏水洗涤3 5次,置-70 -75'C冰箱预冻4 5h,然后冷 冻干燥机中冷冻干燥11 13h制得。步骤2中司盘-80为单油酸酯，"吐温-80" 是表面活性剂聚山梨酯-80的俗称，聚山梨酯-80。(3)将含有e —防御素一1 3或乳铁蛋白1-11的海藻酸盐控释微球与密度 为1乂105 106/1111的患者自身间充质干细胞(MSCs)悬液混匀，调海藻酸盐控释 微球的浓度小于2. Og/L，将步骤l所述的蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载 体置入无菌抽滤瓶，滴加悬液至饱和后抽干空气，负压使海藻酸盐控释微球分 布均匀，在35 38°(:下体积比5 6%0)2孵箱内培养5 7天即得。上述步骤1脱蛋白松质骨的制备，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人 股骨远端松质部分，所截取骨块内不含软骨及皮质骨成分，其长轴与所取松质 骨骨小梁排列方向一致，取材各骨块的表观孔隙密度基本相同。制成植入所需 大小的骨块，采用与骨块质量比为l:l的氯仿/甲醇液脱脂24 25h， 50 60°C 蒸馏水震荡冲洗，再用20 25%仏02浸渍24 25h,反复3 5次，将处理后的 骨块放入蒸馏水中于室温下浸泡透析24 25h，烘干备用。扫描电镜见采用脱蛋 白处理后的松质骨有大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构，孔径直径200 500 ii m。上述步骤l脱钙松质骨的制备，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人股 骨，剔除表面的骨膜、软组织和骨髓等，制成骨条，用双蒸水反复浸泡，至浸泡液 澄清无血色、捞出、沥干，放入无菌的玻璃缸内，在25 30 。C恒温摇床中，采用 与骨块质量比为l:l氯仿/甲醇浸泡8 9h,用36 38。C双蒸水反复冲洗3 5次，10 15min/次，再按每克骨块加入50 60ml浓度为0. 6 0. 8mol/L的盐酸脱 钙，在室温下浸泡24 25h，每8 9小时更换盐酸1次，用浓度5 7%的碳酸氢钠溶 液冲洗振摇，直至浸泡液呈中性再加入浓度为20 30%貼2溶液中，密闭容器置 36 38。C恒温箱中，浸泡72 74h，每12 14h更换溶液l次，每次换液前用36 38 。C双蒸水反复冲洗3次，10 15 min/次；用装有75 80%乙醇超声清洗机振荡清 洗,每2 2.5小时更换洗涤液1次，连续洗涤3 5次，调pH为7.3 ±0. l后干燥制 得。本发明载缓释抗菌肽组织工程骨经体内(羊和猪)及体外药物动力学检测 证实，具有强力抗感染和抑制细菌生物膜形成的作用，可在局部维持14天的有 效抗菌浓度，组织工程骨的生物力学性能不发生变化。有益效果本发明载缓释抗菌肽组织工程骨提高了植骨材料的抗感染能力， 保证开放性骨折和其他原因所导致的骨缺损在清创或病灶清除后I期植骨修复 骨连续性。能很好为机体吸收，其抗菌性能针对耐药菌和生物膜存在的状态非 常有效，达到长期维持抗生素浓度，尤其是面临耐药菌和生物膜的困境时，上 述方式释放的抗菌肽更有效。
具体实施方式
实施例1(1)制备脱蛋白松质骨，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人股骨远端 松质部分，制成植入所需大小的骨块，采用与骨块质量比为1:1的氯仿/甲醇液 脱脂24 25h， 50 6(TC蒸馏水震荡冲洗，再用20 25% HA浸渍24 25h,反 复3 5次，将处理后的骨块放入蒸馏水中于室温下浸泡透析24 25h，烘干制 得。(2) 制备含有P—防御素一1 3的海藻酸盐控释微球采用乳化离子交联法制备，在35i:温度下配制1. W的海藻酸钠溶液100ml，加入0.5mol/mlP—防 御素—1 3混合均匀；加入橄榄油llml，加入1.2ml司盘-80和O. 3ml吐温-80， 混合均匀；1000r/min搅拌5min，搅拌中滴入l. 2mol/L氯化钙溶液10ml，形成 W/0乳剂；然后改用磁力搅拌器慢速搅拌20min，交联固化；将乳剂转移至试管中， 静置7h,取下层2000r/min冷冻离心3min，分离微球，用蒸馏水洗涤3次,置-70°C 冰箱预冻4h，然后冷冻干燥机中冷冻干燥llh制得。(3) 将含有P —防御素_ 1 3的海藻酸盐控释微球与密度为1X lOVml的患 者自身间充质干细胞(MSCs)悬液混匀，调海藻酸盐控释微球的浓度1.0g/L， 将步骤l所述的蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体置入无菌抽滤瓶，滴加 悬液至饱和后抽干空气，负压使海藻酸盐控释微球分布均匀，在35t下体积比 5%0)2孵箱内培养5天即得。实施例2(1)制备脱钙松质骨，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人股骨，剔除 表面的骨膜、软组织和骨髓等,制成骨条，用双蒸水反复浸泡，至浸泡液澄清无血色、捞出、沥干，放入无菌的玻璃缸内，在25 30 r恒温摇床中，采用与骨块质量比为l: l氯仿/甲醇浸泡8 9h，用36 38。C双蒸水反复冲洗3 5次，10 15min/次，再按每克骨块加入50 60ml浓度为0. 6 0. 8mol/L的盐酸脱钙，在室 温下浸泡24 25h，每8 9小时更换盐酸1次,用浓度5 7%的碳酸氢钠溶液冲洗 振摇，直至浸泡液呈中性再加入浓度为20 30%仏02溶液中，密闭容器置36 38。C 恒温箱中，浸泡72 74h，每12 14h更换溶液l次，每次换液前用36 38'C双蒸水 反复冲洗3次，10 15 min/次；用装有75 80%乙醇超声清洗机振荡清洗，每2 2.5小时更换洗涤液1次，连续洗涤3 5次，调pH为7.3 ±0. l后干燥制得。(2)制备含有乳铁蛋白1-ll的海藻酸盐控释微球采用乳化离子交联法制 备，在38。C温度下配制1.8y。的海藻酸钠溶100ml，加入O. 8mol/ml乳铁蛋白l-11 混合均匀；加入橄榄油14ml,加入1.7 ml司盘-80和O. 5ml吐温- 80,混合均匀; 1500r/min搅拌7min，搅拌中滴入l. 7mol/L氯化钙溶液15ml，形成W/0乳剂；然 后改用磁力搅拌器慢速搅拌40min，交联固化；将乳剂转移至试管中，静置9h，取 下层2500r/min冷冻离心5min,分离微球，用蒸馏水洗涤5次,置于-75'C冰箱预冻 5h，然后冷冻干燥机中冷冻干燥13h制得。(3 )将含有乳铁蛋白1-11的海藻酸盐控释微球与密度为1X 10Vml的患者自 身间充质干细胞(MSCs)悬液混匀，调海藻酸盐控释微球的浓度1.9g/L，将步 骤l所述的蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体置入无菌抽滤瓶，滴加悬液 至饱和后抽干空气，负压使海藻酸盐控释微球分布均匀，在38匸下体积比6%。02 孵箱内培养7天即得。 实施例3(1)外购脱蛋白松质骨备用。 (2)制备含有P—防御素一1 3的海藻酸盐控释微球采用乳化离子交联法制 备，在37。C温度下配制1. 5W的海藻酸钠溶液100ml，加入O. 6mol/ml P—防御素 —1 3混合均匀；加入橄榄油12ml,加入1.5ml司盘-80禾卩0.4ml吐温-80,混合 均匀；1200 r/min搅拌6min，搅拌中滴入l. 5mol/L氯化转溶液12ml，形成W/0 乳剂；然后改用磁力搅拌器慢速搅拌30min,交联固化；将乳剂转移至试管中，静 置8h,取下层2300r/min冷冻离心4min，分离微球,用蒸馏水洗涤4次，置-72°〇冰 箱预冻4. 5h，然后冷冻干燥机中冷冻干燥12h制得。(3 )将含有0 —防御素一 1 3的海藻酸盐控释微球与密度为1X 107ml的患 者自身间充质干细胞(MSCs)悬液混匀，调海藻酸盐控释微球的浓度O. 5g/L， 将步骤l所述的蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体置入无菌抽滤瓶，滴加 悬液至饱和后抽干空气，负压使海藻酸盐控释微球分布均匀，在36-C下体积比 5.5%0)2孵箱内培养6天即得。
权利要求
1、一种载缓释抗菌肽组织工程骨，其特征在于所述载缓释抗菌肽组织工程骨由植骨材料载体和包裹有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球组成，所述包裹有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球附着在植骨材料微孔内；其中所述植骨材料为脱蛋白松质骨或脱钙松质骨。
2、 根据权利要求1所述载缓释抗菌肽组织工程骨，其特征在于所述包裹 有P —防御素一1 3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球粒径为230土60um。
3、 一种权利要求1所述载缓释抗菌肽组织工程骨的制作方法，其特征在于 按如下步骤进行(1) 选取脱蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体备用；(2) 制备含有P—防御素一1 3或乳铁蛋白1-ll的海藻酸盐控释微球采 用乳化离子交联法制备，在35 38'C温度下配制1. 1 1. 8%的海藻酸钠溶液 100ml，加入O. 5 0. 8mol/mlP —防御素一1 3或乳铁蛋白1-11混合均匀；加入 橄榄油ll 14ml，加入1.2 1.7 ml司盘-80和O. 3 0. 5ml吐温-80，混合均匀； 1000 1500 r/min搅拌5 7min，搅拌中滴入l. 2 1. 7mol/L氯化转溶液10 15ml，形成水/油乳剂；然后改用磁力搅拌器慢速搅拌20 40min，交联固化；将 乳剂转移至试管中，静置7 9h，取下层2000 2500r/min冷冻离心3 5min,分离 微球，用蒸馏水洗涤3 5次，置-70 -75-C冰箱预冻4 5h，然后冷冻干燥机中冷 冻干燥ll 13h制得。(3) 将含有P —防御素一1 3或乳铁蛋白1-ll的海藻酸盐控释微球与密度 为lX105 106/ml的患者自身间充质干细胞悬液混匀，调海藻酸盐控释微球的浓度小于2. 0g/L,将步骤l所述的蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体置入无 菌抽滤瓶，滴加悬液至植骨材料载体上饱和后抽干空气，负压使海藻酸盐控释 微球分布均匀，在35 38°(:下含5 6%0)2的孵箱内培养5 7天即得。
4、根据权利要求3所述载缓释抗菌肽组织工程骨的制作方法，其特征在于: 所述步骤1脱蛋白松质骨的制备，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人股骨 远端松质部分，制成植入所需大小的骨块，采用与骨块质量比为1:1的氯仿/甲 醇液脱脂24 25h， 50 6(TC蒸馏水震荡冲洗，再用20 25% ^02浸渍24 25h, 反复3 5次，将处理后的骨块放入蒸馏水中于室温下浸泡透析24 25h，烘干 制得。
5、根据权利要求3所述载缓释抗菌肽组织工程骨的制作方法，其特征在于-所述步骤l脱钙松质骨的制备，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人股骨，剔 除表面的骨膜、软组织和骨髓等，制成骨条,用双蒸水反复浸泡,至浸泡液澄清无 血色、捞出、沥干，放入无菌的玻璃缸内，在25 30 。C恒温摇床中，采用与骨块 质量比为l:l氯仿/甲醇浸泡8 9h，用36 38-C双蒸水反复冲洗3 5次，10 15min/次，再按每克骨块加入50 60ml浓度为0. 6 0. 8mol/L的盐酸脱钙，在室 温下浸泡24 25h，每8 9小时更换盐酸1次,用浓度5 7%的碳酸氢钠溶液冲洗 振摇，直至浸泡液呈中性再加入浓度为20 30%仏02溶液中，密闭容器置36 38T: 恒温箱中，浸泡72 74h，每12 14h更换溶液l次，每次换液前用36 38。C双蒸水 反复冲洗3次，10 15 min/次；用装有75 80%乙醇超声清洗机振荡清洗,每2 2.5小时更换洗涤液1次，连续洗涤3 5次，调pH为7.3 ±0. l后干燥制得。
全文摘要
本发明公开了一种载缓释抗菌肽组织工程骨及其制作方法，由包裹有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球附在载缓释抗菌肽组织工程骨微孔内制得。制作步骤(1)制备脱蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体；(2)制备含有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸盐控释微球(3)将含有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸盐控释微球附着在脱蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体上制得。本发明载缓释抗菌肽组织工程骨提高了植骨材料的抗感染能力，保证开放性骨折和其他原因所导致的骨缺损在清创或病灶清除后I期植骨修复骨连续性。达到长期维持抗生素浓度，尤其是面临耐药菌和生物膜的困境时，上述方式释放的抗生素更有效。
文档编号A61L27/36GK101401975SQ20081023300
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月7日 优先权日2008年11月7日
发明者余洪俊, 军 费 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院