专利名称：抗btla的完全人抗体的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及结合BTLA的抗体或抗原结合片段及其用途。更具体而言，本发明涉及识别人BTLA并调节其特别是在炎性、自体免疫性和增殖性病症中的活性的完全人抗体。
背景技术：
免疫系统起保护个体免遭感染原(例如细菌、多细胞生物和病毒)以及癌症的作用。该系统包括若干类型的淋巴样细胞和骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。这些淋巴样细胞和骨髓细胞常常产生称为细胞因子的信号转导蛋白。免疫应答包括炎症，即免疫细胞在全身或在机体特定部位蓄积。在响应感染因素或外源物质时，免疫细胞分泌细胞因子，后者进而调节免疫细胞增殖、发育、分化或迁移。例如在涉及过度炎症时，像自身免疫病症一样，免疫应答可产生病理性后果(参见例如 Abbas 等(主编)(2000)Cellular and Molecular Immunology,ff. B. Saunders Co.，Philadelphia, PA ；Oppenheim 和 Feldmann(主编)(2001)CytokineReference, Academic Press, San Diego, CA ;von Andrian 和 Mackay(2000)New Engl.J. Med. 343 :1020-1034 ；Davidson 和 Diamond(2001)New Engl. J. Med. 345 :340-350)。正性和负性共刺激信号在B细胞和T细胞活性的调节中起决定性作用，而且已证实介导这些信号的分子是免疫调节剂的有效靶标。除T细胞受体(TCR)参与(engagement)夕卜，幼稚T细胞的最佳活化也需要正性共刺激，而负性共刺激则被认为是自身免疫耐受性的获得以及效应T细胞功能的终止所需要的。与抗原呈递细胞(APC)表面上的B7. I或B7. 2相互作用时，原型(prototypic)T细胞共刺激分子⑶28响应TCR参与而发出促进T细胞增殖和分化的信号，但是CD28同源物细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)介导T细胞增殖和效应子功能的抑制(Chambers 等,Ann. Rev. Tmmunol. ,19 :565-594, 2001 ;Egen 等,NatureImmunol, 3 :611-618, 2002)。已发现与B7家族同源的若干新分子(Abbas等，Nat. Med. , 5 :1345-6,1999 ；Coyle 等，Nat. Immunol. ,2 :203-9, 2001 ；Carreno 等，Annu. Rev. Immunol.,20 :29-53,2002 ;Liang 等，Curr. Opin. Immunol. , 14 :384_90，2002)，并且刚开始阐明它们在T细胞活化中的作用。这些新的共刺激配体包括B7h、PD-LU PD-L2和B7-H3。B7h(Swallow等，Immunity, 11 :423-32,1999)亦称为 B7RP-1 (Yoshinaga 等，Nature, 402 :827-32,1999),GL50(Ling 等，J. Immunol.，164 :1653-7，2000)、B7H2 (Wang 等，Blood，96 :2808-13,2000)和LICOS (Brodie等，Curr. Biol.，10 :333-6, 2000)，其与活化T细胞上的可诱导的共刺激因子(ICOS)结合，并共刺激T细胞增殖和细胞因子(例如白介素4(IL-4)和IL-10)的产生。PD-Ll (Freeman 等，J. Exp. Med.，192 :1027-34，2000)亦称为 B7-H1 (Dong 等，Nat. Med.，5，1365-9，1999)和 PD-L2 (Latchman 等，Nat. Immunol.，2 :261-8,2001)亦称为B7-DC (Tseng等，J. Exp. Med.，193，839-46，2001)，两者与T细胞和B细胞上的程序性死亡I (PD-I)受体结合。最后，B7-H3与目前尚未了解的活化T细胞上的反受体结合，据报道提高⑶4+T辅助(Th)细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL或Tc)的增殖并选择性提高IFN- Y表达(Chapoval 等，Nat. Tmmunol, 2, 269-74, 2001 ；Sun 等，J. Immunol.，168,6294-7, 2002)。由于具有T细胞共刺活化性的其它分子的重大生物学重要性以及能够影响它们的活性的作用剂的治疗潜力，因此其鉴定令人极感兴趣。能够调节共刺激信号并由此能够调节CD8+CTL和CD4+Th细胞的活化和/或效应子功能的作用剂可应用于调节免疫应答，并且是十分需要的。
尤其是已知许多自身免疫病症涉及自体反应性T细胞和自身抗体。非常需要能够在不损害免疫系统抵御病原体的能力的情况下抑制或消除自体反应性淋巴细胞的作用剂。相反，许多癌症免疫疗法(例如过继免疫疗法)使肿瘤特异性T细胞群扩繁，并指引其攻击并杀死肿瘤细胞(Dudley 等,Science 298 :850-854, 2002 ； Par doll, NatureBiotech. ,20 :1207-1208,2002 ;Egen 等，Nature Immunol.，3 :611-618,2002)。也非常需要能够提高肿瘤攻击的作用剂。另外，针对不同抗原(例如微生物抗原或肿瘤抗原)的免疫应答虽然可检出，但幅度常常不足以提供针对表达这些抗原的作用剂(例如感染性微生物或肿瘤细胞)介导的疾病过程的保护。通常需要联合抗原将用作在受试者中提高对抗原的免疫应答的佐剂给予受试者。在某些情况下，还需要抑制对抗原的正常免疫应答。例如，在接受移植的患者中需要抑制正常的免疫应答，并且非常需要具有这种免疫抑制活性的作用剂。共刺激信号，特别是正性共刺激信号，还在B细胞活性的调节中起作用。例如，除受抗原刺激以外，B细胞活化和生发中心B细胞的存活也需要T细胞衍生信号。存在于辅助T细胞表面上的⑶40配体与B细胞表面上的⑶40相互作用，并在B细胞中介导许多这种T细胞依赖性作用。蛋白质BTLA(B和T淋巴细胞弱化子)是受体⑶28家族的成员，该家族还包括⑶28、CTLA-4、ICOS和TO-I。根据在加入单克隆抗体后对提高T细胞增殖的功能作用，发现了该家族最初的成员 CD28 和 ICOS(Hutloff 等(1999)Nature 397 :263-266 ；Hansen 等(1980) Immunogenics 10:247-260)。通过筛选THl细胞中的差别表达发现了 BTLA。另外，BTLA被描述为提供类似于CTLA-4的负性抑制信号。在激动剂抗BTLA Mab存在下，抗CD3和抗CD28活化的T细胞显示IL-2的产生和增殖降低(Kreig等，J. Immunol.，175，6420-6472，2005)。缺乏完整BTLA基因的小鼠显示在免疫后DNP-KLH的效价较高，且对EAE的敏感性提高(Watanabe等,Nat. Immunol, 4,670-679, 2003)。已经表明HVEM(疱疫病毒进入介体)是 BTLA 的配体(Scully 等(2005)Nat. Immunol. 6 :90-98 ；Gonzalez 等(2005)Proc. Nat.Acad. Sci. U. S. A. 102 :1116-1121)。因此，需要识别BTLA的作用剂、特别是识别BTLA的抗体及其结合作用剂和使用这些作用剂的方法。抗体可用作治疗药物。某些抗体在体内用作治疗药物时可引起不需要的抗体免疫原性。因为大多数单克隆抗体来源于啮齿动物，所以在人中重复使用导致产生针对治疗性抗体(例如，人抗小鼠抗体或HAMA)的免疫应答。这类免疫应答至少导致丧失治疗功效，而最高则导致潜在致死过敏反应。降低啮齿动物抗体的免疫原性的一种方法包括嵌合抗体的产生，其中将小鼠可变区(Fv)与人恒定区融合(Liu等(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :3439-43)。然而，用人可变区和小鼠恒定区的杂合体注射的小鼠发生针对人可变区的强抗抗体应答，这就表明这种嵌合抗体中的完整哨齿动物Fv区的保留仍可在患者中引起有害的免疫原性。另外，将啮齿动物可变结构域的互补决定区(CDR)环移植到人构架上(即人源化)已被用于进一步将哨齿动物序列减至最低。Jones等(1986)Nature 321 522 ；Verhoeyen等(1988) Science 239:1534。然而，⑶R环交换仍不能均匀产生具有与起始抗体相同的结合性质的抗体。在人源化抗体中，常常还需要构架残基(FR)(参与CDR环支持的残基)改变以保持抗原结合亲和力。Kabat等(1991) J. Immunol. 147 :1709。虽然已经报道了许多人源化抗体构建体中CDR移植和构架残基保持的使用，但是难以预测特定序列是否可产 生具有所需结合性质以及间或具有生物学性质的抗体。参见例如Queen等(1989)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029 ；Gorman 等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :4181 ；以及Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9 :421_5。此外，大部分现有研究对动物轻链和重链可变序列使用不同人序列，致使这种研究的预测性成问题。已在使用已知抗体的序列，或者更通常使用具有已知X射线晶体结构的抗体例如抗体NEW和KOL的序列。参见例如Jones等，同上；Verhoeyen等，同上；以及Gorman等，同上。已经报道了少数人源化构建体的确切序列信息。存在对用于治疗人病症(例如炎性病症、自身免疫病症和增殖性病症)的抗BTLA抗体、特别是抗BTLA单克隆抗体的需要。这种抗体可优选在人受试者中具有低免疫原性，允许重复给予而无不良免疫应答。发明概述本发明涉及在人受试者中具有一种或多种以下所需性质的抗人BTLA抗体包括高结合亲和力、中和活性、良好的药代动力学和低抗原性。本发明还涉及本发明的抗体在治疗疾病中的用途。在某些实施方案中，本发明涉及与人B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包括一种或多种选自以下的性质a)不阻断BTLA与疱疹病毒进入介体(HVEM)结合；b)与食蟹猴BTLA交叉反应；c)与人BTLA结合的Kd为至多约2. 4X 10_9 ；和d)在测量B或T细胞活化的体外测定中EC5tl约为lO-lOOnM。在其它实施方案中，本发明涉及与人BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的一种或多种性质a)阻断BTLA与HVEM结合；b)与食蟹猴BTLA交叉反应；和c)与人BTLA结合的Kd为至多约4. 6X 1θΛ在其它实施方案中，本发明涉及选自hu Mab8D5和hu Mab8A3的与BTLA结合的分离激动剂抗体或其抗原结合片段，其中抗体与BTLA特异性结合且不阻断与HVEM结合。在其它实施方案中，本发明涉及选自hu Mab21H6和hu Mabl9A7的与BTLA结合的分离激动剂抗体或其抗原结合片段，其中抗体与BTLA特异性结合且还阻断与HVEM结合。在另外的其它实施方案中，本发明涉及与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO :12、13和14的Vl⑶R结构域和至少一个选自SEQ IDNo. :5、6和7的Vh CDR结构域。在另外的其它实施方案中，本发明涉及与BTLA结合的分离拮抗剂抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO :26、27、28的' ⑶R结构域和至少一个选自SEQID NO :19、20 和 21 的 Vh CDR 结构域。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的分离抗体或其抗原结合片段，其中(a)重链可变区包含SEQ ID NO :11(8D5重链)的氨基酸序列；和
(b)轻链可变区包含SEQ ID N0:18(8D5轻链)的氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含以下的分离抗体或其抗原结合片段(a)包含SEQ ID NO 5(8D5HCDR1)的氨基酸序列的重链可变区CDRl ； (b)包含SEQ ID NO 6 (8D5HCDR2)的氨基酸序列的重链可变区CDR2 ; (c)包含SEQ ID NO :7 (8D5HCDR3)的氨基酸序列的重链可变区⑶R3 ； (d)包含SEQ ID NO :12 (8D5IXDR1)的氨基酸序列的轻链可变 区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 13 (8D5LCDR2)的氨基酸序列的轻链可变区CDR2 ;和(f)包含SEQ ID N0:14(8D5LCDR3)的氨基酸序列的轻链可变区CDR3 ;其中抗体与BTLA特异性结合且不阻断与HVEM结合。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含以下的分离抗体或其抗原结合片段(a)为人VH基因(SEQ ID NO :8)[编码8D5]的产物或来源于该基因的重链可变区；和(b)为人VK基因(SEQ ID N0:15)[编码8D5]的产物或来源于该基因的轻链可变区；其中抗体与BTLA特异性结合。在另外的其它实施方案中，本发明涉及分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体与包含以下序列的参比抗体交叉竞争结合BTLA : (a)包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 11(8D5重链)的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:18(8D5轻链)的氨基酸序列的轻链可变区；其中分离单克隆抗体或其抗原片段是BTLA激动剂。在某些实施方案中，重链和轻链通过挠性接头连接形成单链抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是单链Fv抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab'抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是(Fab' )2抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段是完全人单克隆抗体或完全人重组抗体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段降低BTLA活性和/或信号转导。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段提高BTLA活性和/或信号转导。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述任何抗体或抗原结合片段的Vl结构域或Vh结构域的分离多肽。在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码本文所述任何抗体或抗原结合片段的Vl结构域或Vh结构域的分离核酸。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述一种或多种抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗受试者的因BTLA表达和/或活性降低所引起的病况的方法，所述方法包括将有效量的本文所述药物组合物给予受试者。特别地，以T细胞或B细胞的存在或活性为特征的任何疾病或病症可通过BTLA激动剂抗体治疗(即涉及BTLA阳性免疫细胞存在的疾病或病症可通过活化BTLA受体功能来控制或治疗)。在某些实施方案中，一种或多种抗体或其抗原结合片段选自hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7 或 hu Mab4C7。在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗受试者的炎性病症或自身免疫病症的方法，该方法包括将有效量的本文所述抗体或抗原结合片段给予受试者。在某些实施方案中，炎性病症或自身免疫病症选自炎性肠病症(例如克罗恩病(Crohn’ s disease)、溃疡性结肠炎和炎性肠病)、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和肝硬化)、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、骨质疏松、哮喘(包括变应性哮喘)、变态反应、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化、银屑病、眼色素层炎、移植物抗宿主病(GVHD)、青少年早发性I型糖尿病、移植排斥、SLE和斯耶格伦综合征(Sj0gren’s syndrome)。这种治疗方法还可包括给予一种或多种其它的治疗药物，例如免疫抑制剂或抗炎剂。在另外的其它实施方案中，病症为类风湿性关节炎。
在另外的其它实施方案中，炎性肠病症选自克罗恩病、溃疡性结肠炎和炎性肠病。在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗移植排斥和/或移植物抗宿主病的方法。在另外的其它实施方案中，本发明涉及治疗I型糖尿病的方法。在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述抗体或抗原结合片段在制备治疗受试者的炎性病症或自身免疫病症的药物中的用途。在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述抗体或抗原结合片段在制备降低BTLA的活性的药物中的用途。在另外的其它实施方案中，本发明涉及提高受试者的免疫应答的方法，该方法包括将有效量的药物组合物给予受试者。在某些实施方案中，一种或多种抗体或其抗原结合片段是hu Mab4C7。在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述拮抗剂抗体在制备提高BTLA的活性的药物中的用途。在另外的其它实施方案中，本发明涉及本文所述任何抗体或抗体片段用于诊断应用中的用途。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述任何抗体或抗原结合片段的药盒。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含BTLA和本文述任一种抗体或抗原结合片段的复合物。在另外的其它实施方案中，本发明涉及表达载体，其包含编码多肽的分离核酸，所述多肽编码本文所述任何VH或VL链。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含本文所述表达载体的宿主细胞。在另外的其它实施方案中，本发明涉及产生本文所述抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括(a)在表达核酸序列的条件下，将本文所述宿主细胞在培养基中培养，由此产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；和
(b)从宿主细胞或培养基中回收多肽。在另外的其它实施方案中，本发明涉及分离抗体或其抗原结合片段，其中抗体与包含以下序列的参比抗体交叉竞争结合BTLA (a)包含SEQ ID NO 23 (4C7重链)的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含SEQ ID NO 30 (4C7轻链)的氨基酸序列的轻链可变区；其中分离单克隆抗体或其抗原片段是BTLA拮抗剂。在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述轻链可变区包含SEQ ID NO 18所示
氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、 ⑶R-L2和⑶R-L3的分离免疫球蛋白多肽，所述轻链可变区包含SEQ ID NO 18所示氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于重链可变区中的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述重链可变区包含SEQ ID NO 11所示
氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于重链可变区中的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3的分离免疫球蛋白多肽，所述重链可变区包含SEQ ID NO : 11所示氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述轻链可变区包含SEQ ID NO 32所示
氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于轻链可变区中的CDR-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的分离免疫球蛋白多肽，所述轻链可变区包含SEQ ID NO 32所示氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码包含存在于重链可变区中的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3的免疫球蛋白多肽的分离核酸，所述重链可变区包含SEQ ID NO 25所示
氨基酸序列。在另外的其它实施方案中，本发明涉及包含存在于重链可变区中的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3的分离免疫球蛋白多肽，所述重链可变区包含SEQ ID NO 25所示氨基酸序列。在某些实施方案中，这些核酸构建体和/或多肽可用于制备抗体的方法。附图简述图IA-C表示hu Mab 8D5的重链可变区和轻链可变区的序列。图IA表示VH链的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图IB表示VL链的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。⑶R1、⑶R2和⑶R3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图IC表示Hu Mab8D5的重链可变区和轻链可变区的序列特征。图2A-C表示hu Mab 4C7的重链可变区和轻链可变区的序列。图2A表示VH链的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图2B表示VK的成熟氨基酸序列和编码核酸序列。⑶R1、⑶R2和⑶R3序列用氨基酸序列上方的波纹线表示。图2C表示hu Mab4C7的重链可变区和轻链可变区的序列特征。图3A-D表示hu Mab8D5和hu Mab4C7的结合和交叉反应性特征。图3A表示huMab8D5对在CHO细胞上表达的人BTLA的结合概况。图3B表示hu Mab8D5对在CHO细胞上表达的食蟹猴BTLA的结合概况。图3C表示hu Mab4C7对在CHO细胞上表达的人BTLA的结合概况。图3D表示hu Mab4C7对CHO细胞上表达的食蟹猴BTLA的结合概况。图4A-B表示测试抗体阻断人HVEM与表达人BTLA的CHO细胞结合的能力的结果。图4A表示hu Mab4C7阻断人HVEM与表达人BTLA的CHO细胞结合。图4B表示hu Mab8D5不能阻断人HVEM与表达人BTLA的CHO细胞结合。图5图示hu Mab8D5以及hu Mab8D5Fab’片段抑制抗⑶3诱导的人原始T细胞增殖。
图6A-D图示hu Mab8D5和hu Mab4C7对SEB诱导的人和食蟹猴T细胞应答的作用。图7A-B图示hu Mab8D5减弱对破伤风类毒素攻击的人记忆T细胞应答。图8A-B图示hu Mab4C7提高对破伤风类毒素攻击的人记忆T细胞应答。图9图示hu Mab8D5抑制人B细胞功能。
图10A-B图示hu Mab8D5抑制外周血B细胞趋化因子的产生。图11图示hu Mab8D5不自主刺激健康供体血液中的免疫活性。图12A-B为蛋白质印迹，表示hu Mab8D5和hu Mab4C7与BTLA结合(图12A)，且hu Mab8D5减少TCR ξ磷酸化(图12Β)。图13Α-Β图示hu Mab8D5以剂量依赖性方式抑制SEB应答和B细胞增殖。图14A-D图示受测抗BTLA激动剂抗体不会在人PBMC培养物中引起细胞因子风暴(storm)，正如在人PBMC培养物中测量的缺乏IL_2(图14A、B)、IFNy (图14C)和TNF α (图14D)的产生一样。图15图示第28天ELISA结果，表明hu Mab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人抗TT记忆IgG应答。图16图示第28天ELISA结果，表明hu Mab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人总IgG应答。图17A-B图示各个治疗小鼠的效价，说明了与同种型对照(图17B)相比，huMab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人抗TT记忆IgG应答(图17A)。图18A-B图示各个治疗小鼠的效价，表明了与同种型对照(图18B)相比，huMab8D5在SCIDhu SPL小鼠中抑制人总IgG应答(图18A)。发明详述哺乳动物免疫系统已发展控制T淋巴细胞和B淋巴细胞的潜在有害活性的若干途径。它们包括各种细胞因子-受体途径以及涉及受体(像^28、(1'1^-4、？0-1和^'1^)的共刺激途径。尽管CD28-B7相互作用是正性共刺激途径的实例(即CD28触发提高对抗原特异性触发物的T细胞应答)，但其它3种受体表示抑制性共刺激途径。CTLA-4、PD-1和BTLA显示重叠但独特的表达概况，并以非丰余方式限制T淋巴细胞和B淋巴细胞以及其它免疫细胞的活性。(参见 Deppong 等，JImmunol 2006, Tao 等，J Immunol 2005)。虽然 CTLA-4与⑶28竞争结合B7. I和B7. 2 (⑶80和⑶86)并为淋巴结和脾中的幼稚T细胞活化设定原始阈值，但是ro-Ι和BTLA各有自己独特的配体(分别为ro-Ll/-L2和HVEM)，并且似乎控制外周T细胞稳态和再活化。(参见Krieg等，Nat Immunol 2007。)BTLA下调B细胞和T细胞活化如其名称所表示的一样，B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)在静息和活化的B淋巴细胞和T淋巴细胞两者上表达。BTLA是I型跨膜糖蛋白，具有含有若干抑制酪氨酸基序的胞质尾(Watanabe，2003)。BTLA具有⑶28/CTLA-4家族成员的某种结构相似性，但几个因素使之成为独特成员。人BTLA含有下列表征的结构域Ig包外结构域残基51-117 ;跨膜结构域残基153-173 ；ITIM结构域残基255-260 ；以及ITSM结构域残基280-285 (对于人SEQ ID NO 2) 0 ITIM表示基于免疫受体酪氨酸的抑制基序，而ITSM表示基于免疫受体酪氨酸的转换基序。相当于SEQ ID NO 2的残基43-134的BTLA Ig中间类型(I类类型)胞外结构域负责配体结合，且不存在于⑶28/CTLA-4家族的其它成员中。另外，BTLA的配体不是B7 家族成员，倒不如说它是TNFR超家族受体疱疹病毒进入介体(HVEM) (Sedy，2005)。HVEM在外周B细胞和T细胞及单核细胞上表达，并且已解析了与BTLA结合的HVEM的晶体结构(Compaan,2005)。若干体内研究证实了 BTLA在淋巴细胞应答中的抑制作用。由Murphy与同事(Washington University St. Louis)制备的BTLA缺陷型小鼠在响应T依赖性抗原产生的IgG方面表现出3倍增加。另外，自BTLA+小鼠分离的T细胞和B细胞对分别使用-CD3和抗IgM进行抗原-受体刺激显示较大的增殖应答(Watanabe，2003)。在过量表达研究中，发现BTLA与B细胞受体复合物以及与T细胞受体缔合。与该研究结果一致，在BTLA缺陷型淋巴细胞中，使用Con A(T细胞)或LPS(B细胞)进行抗原-受体非依赖性刺激不受影响，而且使用抗BTLA抗体也不能被调节。已经表明BTLA敲除小鼠随时间推移发生自发性自身免疫病，且寿命缩短(Oya，2008)。BTLA被HVEM连接导致T细胞活化和增殖的下调(Sedy，2005)。BTLA敲除小鼠显示在自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和变应性气道炎症模型中疾病严重程度加剧，这两种模型均有赖于T细胞活性(Watanabe，2005 ;D印pong，2006)。也已表明了人BTLA基因中的SNP与RA易感性之间的联系(Lin，2006)。然而，有关BTLA信号转导在病理状态中的作用仍是知之甚少。因此，对于自身免疫病和某些增殖性疾病，存在开发利用BTLA在淋巴细胞应答中的抑制作用而同时允许BTLA-HVEM结合的治疗的持续需要。激动剂BTLA抗体特别适于这种作用。在选择利用Ultimab平台产生的200多种mAb的过程中，鉴定出许多激动剂抗体和拮抗剂BTLA抗体。200多种mAb之中，鉴定出活化抑制性BTLA受体功能的几种抗体(即激动剂抗体)，包括hu Mab8D5、hu Mab8A3、huMab21H6 和 hu Mabl9A7。Hu Mab8D5 和 hu Mab8A3 是不阻断 HVEM 配体与 BTLA 结合的 BTLA激动剂。Hu Mab21H6和hu Mabl9A7活化抑制性BTLA受体功能，同时还阻断HVEM配体与BTLA结合。这些激动剂抗体对BTLA的结合亲和力约为12_14nM，并且还在人供体血液中抑制T细胞和B细胞应答，其EC50约为30-100nM。当作为IgG4和单价Fab’片段重新表达时，hu Mab8D5体外保持其免疫抑制活性。这些激动剂BTLA抗体也以类似亲和力与食蟹猴BTLA结合，并表明对食蟹猴T细胞应答的等同抑制。然而，这些激动剂抗体不与小鼠BTLA交叉反应。在小鼠药理学研究中，hu Mab8D5的半寿期为约16天，与对人IgG4的预期一致。这些受体激动剂性mAb体外抑制和阻抑T淋巴细胞和B淋巴细胞活性，而且在体内模型系统中也具有这种活性。本发明的激动剂抗体的特征是具有在不消耗B细胞的情况下通过关联抗原抑制B细胞活化的能力。另外，本发明的激动剂抗体的特征还在于同时靶向B细胞和T细胞活化的能力。除了上述4种激动剂抗BTLA抗体以外,选择还鉴定出拮抗剂抗体hu Mab4C7。该抗体具有图6C-D和图8A-B中所示的免疫刺激作用，因此预期可用作癌症治疗或用于治疗某些病原体感染及用作疫苗的佐剂。预期在癌症情况下使用BTLA拮抗剂(例如Mab4C7)以刺激免疫应答与这些结果以及表明在幼稚⑶8+T细胞初敏期间阻断BTLA-HVEM连接有助于T细胞增殖增加的结果有关。(参见Derre等，J. Clin. Invest. 2010，120 :157-167)。至于BTLA激动剂，抑制抗原特异性T细胞应答和B细胞应答两者的能力可提供预期可用于以下病况的调节BTLA活性的方法例如关节炎、SLE、斯耶格伦病、溃疡性结肠炎和克罗恩病以及实体器官移植(即肾、肝和其它器官，包括组织移植)。现有治疗有缺点，部分因为只抑制T细胞不足以达到所需效果。本发明的抗BTLA抗体可通过抑制T细胞应答 和B细胞应答两者的能力有效用于治疗关节炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病以及实体器官移植(即肾、肝和其它器官)。在作为IgG4以及单价Fab’片段再表达以保持免疫抑制活性体外和体内模型时，本发明的各种激动剂抗体的能力提供用于新治疗的所需特征。缩略语在整个本发明的详述和实施例中将使用下列缩略语
ADCC抗体依赖性细胞毒性
BTLAB和T淋巴细胞弱化子
HVEM疱疹病毒进入介体
Hu Mab8D5 完全人单克隆激动剂抗BTLA抗体 Hu Mab8A3 完全人单克隆激动剂抗BTLA抗体 Hu Mab21H6 完全人单克隆激动剂抗BTLA抗体 Hu Mabl9A7 完全人单克隆激动剂抗BTLA抗体 Hu Mab4C7 完全人单克隆拮抗剂抗BTLA抗体 Hu Mab 20H4 完全人单克隆抗BTLA抗体 Hu Mab 15C5 完全人单克隆抗BTLA抗体 CDC依赖补体的细胞毒性
CDR免疫球蛋白可变区中的互补决定区，釆用Kabat编号系统定义CHO中国仓鼠卵巢
CTL细胞毒性T淋巴细胞
EC50产生50%功效或结合的浓度
ELISA酶联免疫吸附测定
FW抗体构架区不包括CDR区的免疫球蛋白可变
区
HRP辣根过氧化物酶
IL-2白介素2
IL-5白介素5
IFN干扰素
IC50产生50%抑制的浓度
IgG免疫球蛋白G
KabatElvin A. Kabat首创的免疫球蛋白比对和编号系 统((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版， Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) mAb或Mab或MAb单克隆抗体
MES2-(N-吗啉代)乙磺酸
MOA作用机制
NHS正常人血清
PCR聚合酶链式反应
PK药代动力学 SEB葡萄球菌肠毒素B
TT破伤风类毒素
V区在不同抗体之间的序列中是可变的IgG链的区 段。它在轻链中延伸到Kabat残基109，在重链中延伸到113。
VH免疫球蛋白重链可变区
VK免疫球蛋白K轻链可变区定义
为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文献其它部分有明确定义，否则本文所用的所有其它科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
本文(包括随附权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。用于细胞或受体的“活化”、“刺激”和“处理”可具有相同含义，例如细胞或受体用配体活化、刺激或处理，除非上下文另外或明确规定。“配体”包括天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合化合物。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指通过内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。“应答/反应”，例如细胞、组织、器官或生物体的应答，包括生化或生理行为(例如生物区室内的浓度、密度、粘附或迁移、基因表达速率或分化状态)的改变，其中改变与活化、刺激或处理有关，或者与例如遗传编程等内部机制有关。分子的“活性”可描述或指该分子与配体或受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号转导、分化或成熟的能力；抗原活性；调节其它分子的活性等。分子的“活性”还可指在调节或保持细胞-细胞间相互作用(例如粘附)中的活性，或在保持细胞结构(例 如细胞膜或细胞骨架)中的活性。“活性”也可指比活，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等。“活性”可指先天免疫系统或适应性免疫系统的组分的调节。“增殖活性”包括促进、对以下方面是必需的或与以下方面明确有关的活性例如正常的细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成。应用于动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物流体的“给予”和“治疗”是指使外源药物、治疗药、诊断药或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗、药代动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的治疗包括使试剂与细胞接触以及使试剂与流体(其中该流体与细胞接触)接触。“给予”和“治疗”还意指体外和离体治疗，例如细胞用试剂、诊断、结合化合物或用另一种细胞的体外和离体治疗。术语“受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔)，最优选人。本文所用BTLA激动剂抗体是指与BTLA结合并加强其对B细胞和T细胞的共抑制信号的抗体。本文所用BTLA拮抗剂抗体是指与BTLA结合并防止共抑制信号递送给B细胞和T细胞的抗体。在本发明的一个实施方案中，可能时，按照Physicians ' DeskReference2003 (Thomson Healthcare ;第57版(2002年11月I日))，将本发明的组合物给予受试者。在某些实施方案中，可通过侵入性途径例如通过注射(参见上文)给予抗BTLA抗体或其抗原结合片段。通过非侵入性途径(例如口服；例如以丸剂、胶囊剂或片剂口服)给药也落入本发明的范围内。在本发明的一个实施方案中，经静脉内、皮下、肌内、动脉内、关节内(例如在关节炎关节中)、通过吸入、气雾剂递送或肿瘤内给予抗BTLA抗体或其抗原结合片段或其药物组合物。在某些实施方案中，与以片剂形式口服给予的化疗药物(例如吉非替尼(例如Iressa ))组合，给予抗BTLA抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，化疗药物是静脉内给予的紫杉醇(例如Taxol )。在又一个实施方案中，抗BTLA抗体或其抗原结合片段与至少一种其它治疗药物组合给予，其它治疗药物例如而不限于针对CTLA-4的其它单克隆抗体(例如AVASTIN(贝伐单抗)、MYL0TARG (吉妥珠单抗)、BEXXAR (托西莫单抗)、RITUXAN (利妥昔单抗)、HERCEPTIN(曲妥珠单抗))，或具有类似作用的蛋白质配体；活化抗原呈递细胞(树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞)的作用剂，包括I型干扰素(例如干扰素α和β);干扰素Y ;BCG;提供任何和所有形式的肿瘤抗原(包括蛋白质抗原、肽抗原、完整细胞裂解物及其衍生物)的作用剂；遗传编码抗原(例如腺病毒编码抗原)；体内或离体改变以加强其免疫性质的免疫系统的细胞组分(例如自体树突细胞、淋巴细胞、热激蛋白等)；化疗药物例如但不限于尤其环磷酰胺、甲氨蝶呤、依托泊苷、阿霉素、紫杉烷类、氟尿嘧啶、阿糖胞苷(AraC)和含钼药物。抗原的实例包括PSA抗原(例如PROSTVAC/TRICOM)和黑素瘤来源的gplOO抗原。也可与以下成分组合给予联合药物细胞因子或生长因子，例如但不限于GM-CSF，或者免疫刺激核苷酸，例如但不限于CpG ODN PF3512676 (亦称为ProMune，参见W02007/008463)。另外，在某些实施方案中，抗BTLA抗体或其抗原结合片段与以下抗体组合给予，例如抗CTLA-4和抗HH，包括美国专利号6，682，736和美国专利号7，563，869中分别描述的抗体。
可用本领域已知的医疗装置给予组合物。例如，可用皮下注射针经注射给予本发明的药物组合物。还可用无针皮下注射装置给予本发明的药物组合物；例如美国专利号6，620，135,6,096，002,5,399，163,5,383，851,5,312，335,5,064，413,4, 941，880、4，790，824或4，596，556中公开的装置。给予药物组合物的众所周知的植入物和组件形式的实例包括美国专利号4，487，603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微型输注泵；美国专利号4，447，233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4，447，224，其公开了用于连续药物递送的可变流速可植入输注装置；美国专利号4，439，196，其公开了具有多室区室的渗透药物递送系统。本领域技术人员熟知许多其它的这类植入物、递送系统和组件。“治疗”意指将治疗药物例如含有本发明的任何结合化合物的组合物，经内部或外部给予具有药物对其具有已知治疗活性的一种或多种疾病症状的患者。通常，以有效减轻受治疗的患者或群体的一种或多种疾病症状的量给予药物，而不论是通过诱导这些症状的消退还是抑制这些症状的进展达任何临床可测量的程度。有效减轻任何特定疾病症状的治疗药物的量(亦称为“治疗有效量”)可随例如患者的疾病状态、年龄和体重及药物在患者中引起所需反应的能力等因素而变化。可通过医师或其他专业保健提供者常用于评价疾病症状的严重程度或进展状态的任何临床测量来评价该症状是否减轻。虽然本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)可能不会有效减轻每位患者的靶疾病症状，但其应在按本领域已知的任何统计检验测定的统计显著数量的患者中减轻靶疾病症状，统计检验例如斯氏t检验、X 2检验、Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra 检验和 Wilcoxon 检验。用于人、兽医或研究对象的“治疗”是指治疗性治疗、预防措施、研究和诊断应用。用于人、兽医或研究对象或者细胞、组织或器官的“治疗”包括使BTLA激动剂或拮抗剂与人或动物受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体接触。“细胞的治疗”不仅包括例如在流体相或胶态相中BTLA激动剂或拮抗剂与BTLA受体接触的情况,而且还包括激动剂或拮抗剂不与细胞或受体接触的情况。在某些实施方案中，可单独或组合使用抗BTLA抗体或其抗原结合片段以治疗或预防需要这种治疗或预防的受试者的任何疾病或病况。至于拮抗剂抗BTLA抗体，在某些实施方案中，病况受例如BTLA的表达或活性升高或者其配体(例如HVEM)的表达升高介导，并且可通过调节BTLA-HVEM配体结合、活性或表达来治疗或预防。 某些实施方案中，疾病或病况受BTLA和/或HVEM水平提高的介导，并且通过降低BTLA-HVEM配体结合、活性或表达来治疗或预防。本文所述拮抗剂抗BTLA抗体可作为负性信号转导分子阻断BTLA的活性，并且可通过T细胞和B细胞引起对肿瘤应答的上调。术语“B和T淋巴细胞弱化子”和“BTLA”基因/蛋白质可互换使用，其包括变体、同种型、同源物、直向同源物(ortholog)和种内同源物(paralog)。例如,在某些实施方案中，人BTLA特异性抗体可与来自非人物种的BTLA交叉反应。在其它实施方案中，人BTLA特异性抗体可以是人BTLA完全特异性的，并且不具有物种交叉反应性或其它类型的交叉反应性。除非另有说明，否则术语“人BTLA”是指人BTLA序列。除非另有说明，否则人BTLA序列包括所有人同种型和BTLA变体，例如Genbank登记号为AAP44003的人BTLA的完整氨基酸序列。还存在至少两种人BTLA转录物变体。GenBank登记号NP_861445记载的转录物变体I长度为289个氨基酸，并且与登记号AAP44003的BTLA序列有近98%同一性。这种变体代表较长的转录物，并编码较长的289个氨基酸的同种型。转录物变体2 (GenBank登记号NM_001085357)与变体I相比，缺乏可变框内外显子，产生与同种型I相比较短的241个氨基酸的蛋白质(同种型2，GenBank登记号NP_001078826)。人BTLA序列可因具有例如保守突变或非保守区的突变而不同，该BTLA具有与SEQID NO 2, SEQ ID NO :35或SEQ ID NO :37的人BTLA基本相同的生物功能。例如，人BTLA的生物功能是抑制免疫应答，例如T细胞应答。也就是说，BTLA被视为负性调节因子。它具有参与降低IL-2产生和T细胞扩繁的C端抑制基序(Watanabe等，Nat. Immunol. ,4,670-679,2003 ；Chemnitz 等，J. Immunol.，176，6603-6614，2006)。另外，人 BTLA 的生物功能可为具有例如在被本公开内容的抗体特异性结合的BTLA的胞外结构域中表位。具体的BTLA序列一般可与SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :35 或SEQ ID N0:37 的人BTLA或其它同种型的氨基酸序列有至少90%同一性，并且当与其它物种(例如鼠)的BTLA氨基酸序列相比时，含有鉴定为人的氨基酸序列的氨基酸残基。在某些情况下，人BTLA可与SEQID N0:2、SEQ ID NO :35或SEQ ID NO :37的人BTLA或其它同种型或变体有至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一性。在某些实施方案中，人BTLA序列与SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 35或SEQ ID NO 37的BTLA或者其它同种型或变体的差异将不超过10个氨基酸。在某些实施方案中，人 BTLA 与 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :35 或 SEQ ID NO :37 的 BTLA或其它同种型或变体的差异可不超过5个或甚至不超过4、3、2、或I个氨基酸。百分比同一性可按本文所述确定。术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用导致从人体选择性损害、破坏或清除侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或者在自体免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。在某些情况下，对小鼠类似抗体进行推论研究是有用的。可采用本文所述合适方法产生抗BTLA小鼠抗体以及选择和表征小鼠抗BTLA抗体。虽然具有所需性质和活性的任何小鼠BTLA肽可用来产生小鼠BTLA抗体,但优选Watanabe等，Nat. Immunol. 4 (7),670-679 (2003)描述的序列，包括GenBank登记号AY293285编码的GenBank登记号AAP44002 (306 个氨基酸)。另外，已表征了许多小鼠BTLA剪接变体，在某些情况下，这些中的任一种都可用于产生抗小鼠BTLA抗体。对于较长转录物变体I (长为306个氨基酸)，小鼠BTLA剪接变体包括编码序列ΝΜ_001037719和相应的氨基酸序列ΝΡ_001032808，较短转录物2变体序列描述于GenBank NP_808252 (长为305个氨基酸)；其与变体I相比使用3 ^编码区中的可变框内剪接位点，产生较短的蛋白质(同种型2)。本文所用术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗 体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体和骆骑源化(camelized)单结构域抗体。本文所用术语“抗BTLA抗体”或抗体(“亲代抗体”)的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab' >F(ab/ )2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子,例如sc_Fv ;由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当BTLA结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其BTLA结合活性的至少10%。优选结合片段或衍生物保持亲代抗体的BTLA结合亲和力的至少20 %、50 %、70 %、80 %、90 %、95 %或100 %或更高。还预期抗BTLA抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。术语“结合化合物”是指抗体及其结合片段两者。“分离抗体”是指结合化合物的纯化状态，且在这种情况下意指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。“Fab片段”由一条轻链及ChI和一条重链的可变区组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fe”区含有包含抗体的ChI和Ch2结构域的2个重链片段。该2个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过Ch3结构域的疏水相互作用保持在一起。“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的部分或片段，该重链的部分或片段含有Vh结构域和ChI结构域以及ChI和Ch2结构域之间的区域，使得2个FaY片段的2条重链之间可形成链间二硫键以形成F(ab' )2分子。“F(ab' )2片段”含有2条轻链和2条含有介于ChI和Ch2结构域之间的恒定区的一部分的重链，使得在2条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab' )2片段由通过2条重链间的二硫键保持在一起的2个Fab'片段组成。“Fv区”包含来源于重链和轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的Vh和\结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。Fv多肽一般还包含V1^P '结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关scFv的综述,参见Pluckthun (1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 主编Springer-Verlag, New York,第269-315页。另参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号 4，946，778 和 5，260，203。“结构域抗体”是只含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或更多个Vh区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的2个Vh区可靶向相同或不同的抗原。“二价抗体”包含2个抗原结合部位。在某些情况下，2个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(参见下文)。除非另有规定，否则本文所用“抗BTLA”抗体是指针对人BTLA或其变体或其任何抗原片段产生的抗体。 本文所用术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler等(1975)Nature 256 :495最早描述的杂交瘤方法制备,或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4，816，567)制备。还可采用例如Clackson等(1991)Nature 352 624-628和Marks等(1991) J. Mol. Biol. 222 :581-597描述的技术，从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。另参见 Presta(2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116 :731。在某些实施方案中，单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们具有所需生物活性即可(美国专利号4，816，567 ；以及 Morrison 等，(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855)。本文所用“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常可变结构域获自啮齿动物等实验动物的抗体(“亲代抗体”)，而恒定结构域序列获自人抗体，使得与亲代啮齿动物抗体相比，所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。在某些实施方案中，本文的单克隆抗体还包括骆驼源化单结构域抗体。参见例如 Muyldermans 等(2001) Trends Biochem. Sci. 26 :230 ；Reichmann 等(1999) J. Immunol.Methods 231 25 ；W0 94/04678 ；W0 94/25591 ;美国专利号 6，005，079)。在一个实施方案中，本发明提供单结构域抗体，其包含带有修饰的2个Vh结构域从而形成单结构域抗体。本文所用术语“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(Vh-'或'-Vh)中与轻链可变结构域(')连接的重链可变结构域(Vh)。通过使用短得不允许在同一链的两个结构域之间配对的接头，迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。在例如EP 404，097、WO 93/11161以及Holliger等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 中，对双抗体进行了更充分的描述。有关工程改造抗体变体的综述一般参见Holliger和Hudson(2005)Nat. Biotechnol. 23 1126-1136。本文所用术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含基本所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(FR)区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(Fe)。本发明的抗体还包括具有修饰的(或封闭的)Fe区以提供改变的效应子功能的抗体。参见例如美国专利号 5，624，821、TO2003/086310、TO2005/120571、TO2006/0057702。这类修饰可用来促进或抑制免疫系统的各种反应，在诊断和治疗方面具有可能的有益作用。Fe区的变化包括氨基酸改变(取代、缺失和插入)、糖基化或去糖基化和加入多个Fe。Fe的变化还可改变治疗性抗体中抗体的半寿期，使得能够不太频繁地给药，因此增加了方便性，减少了材料使用。参见 Presta(2005) J. Allergy Clin. Tmmunol. 116 :731 第 734-35 页。 术语“完全人抗体”是指只包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可含有鼠糖链。同样，“小鼠抗体”是指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。或者，如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在来源于大鼠细胞的杂交瘤中产生，则完全人抗体可含有大鼠糖链。同样，“大鼠抗体”是指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。抗体结构总的来说，已知基本的抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分或片段可包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分或片段可限定主要负责效应子功能的恒定区。通常将人轻链归类为K和λ轻链。此外，通常将人重链归类为μ、δ、Y、α或ε ,并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental ImmunoloRY第 7 章(Paul, W.主编，第 2 版。Raven Press, N. Y. (1989)。每个轻链/重链对的可变区配对形成抗体结合部位。因此，完整IgG抗体一般具有2个结合部位。除双功能或双特异性抗体以外，2个结合部位通常相同。通常，各链均具有相同的通过3个超变区(亦称为互补决定区或⑶R)连接的相对保守构架区(FR)的通用结构。每对的2条链的CDR通常通过构架区对准，使之能与特定表位结合。总的来说，轻链和重链两者从N端到C端包含结构域FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。一般按照以下文献中的定义指定每个结构域的氨基酸Sequences of Proteins ofImmunoloRical Interest,Kabat 等National Institutes of Health, Bethesda, Md.;第
5版；NIH 公告号 91-3242(1991) ；Kabat (1978)Adv. Prot. Chem. 32 :1-75 ；Kabat 等(1977)J.Biol. Chem. 252 :6609-6616 ；Chothia 等(1987)J Mol. Biol. 196 :901-917 或 Chothia 等(1989) Nature 342:878-883。本文所用术语“超变区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。超变区包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域的残基24-34 (CDRLl)、50_56 (CDRL2)和89-97 (CDRL3)和重链可变结构域的残基 31-35 (CDRHl)、50_65 (CDRH2)和 95-102 (CDRH3)；Kabat 等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)和/或“超变环”的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32 (CDRLl)、50-52 (CDRL2)和91-96 (CDRL3)和重链可变结构域中的 26-32 (CDRHl)、53-55 (CDRH2)和 96-101 (CDRH3) ； Chothia Lesk (1987)J. Mol. Biol. 196 :901-917)。本文所用术语“构架”或“FR”残基是指本文定义为CDR残基的超变区残基以外的可变结构域残基。“结合物质”是指能够与靶标结合的分子、小分子、大分子、抗体、其片段或类似物或可溶性受体。“结合物质”也可指能够与靶标结合的分子复合物(例如非共价复合物)、离子化分子和例如通过磷酸化、酰化、交联、环化或有限切割修饰的共价或非共价修饰分子。“结合物质”还可指能够与稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶剂或添加剂组合而结合靶标的分子。“结合”可定义为结合物质与靶标缔合，其中缔合导致结合物质的正常布朗运动减少，在这种情况下结合物质可溶解或悬浮在溶液中。“有效量”包括足以改善或预防医学病症的症状或体征的量。有效量还意指足以 允许或便于诊断的量。特定患者或兽医对象的有效量可根据例如待治疗的病况、患者的总体健康状况、给药的方法途径和剂量及副作用的严重程度等因素而变化(参见例如授权给Netti等的美国专利号5，888，530)。有效量可以是避免明显副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。结果可导致诊断测量或参数改进至少5%、通常为至少10%、更常为至少20%、最常为至少30%、优选至少40%、更优选至少50%、最优选至少60%、理想为至少70%、更理想为至少80%、最理想为至少90%，其中100%定义为正常受试者显示的诊断参数(参见例如 Maynard 等(1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press, Boca Raton, FL ；Dent (2001)Good Laboratory and Good ClinicalPractice, Urch PubI. , London, UK)。“外源的”是指根据上下文在生物体、细胞或人体外部产生的物质。“内源的”是指根据上下文在细胞、生物体或人体内产生的物质。“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当所比较的两个序列中某一位置被相同碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如如果两个DNA分子每个中某一位置均被腺嘌呤占据，则分子在该位置上是同源的。两个序列间的同源性百分比是两个序列共有的匹配位置或同源位置数除以所比较的位置数X100的函数。例如，如果在对序列进行最佳比对时两个序列10个位置中有6个匹配或同源，则两个序列是60%同源的。一般在比对两个序列时进行比较以得到最大百分比同源性。“免疫病况”或“免疫病症”包括例如病理性炎症、炎性病症和自身免疫病症或疾病。“免疫病况”还指感染、持续感染和增殖性病况，例如癌症、肿瘤和血管生成，包括抵抗免疫系统根除的感染、肿瘤和癌症。“癌性病况”包括例如癌症、癌细胞、肿瘤、血管生成和癌前病况，例如发育异常。“炎性病症”意指其中病理全部或部分由例如免疫系统细胞的数目改变、迁移速率改变或活化改变引起的病症或病理状况。免疫系统细胞包括例如T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞、小胶质细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞或与免疫学特别有关的任何其它细胞，例如产细胞因子的内皮或上皮细胞。
“分离结合化合物”是指结合化合物的纯化状态，在这种情况下意指分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质，例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”一般并非是指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲剂或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。“分离核酸分子”意指基因组、mRNA、cDNA或合成来源或其某些组合的DNA或RNA，其不与多核苷酸的全部或部分缔合(其中分离多核苷酸天然存在)，或者与其天然不连接的多核苷酸连接。对于本公开内容的目的，应当理解的是，“包含”特定核苷酸序列的“核酸分子”不包括完整的染色体。除规定序列外，“包含”规定核酸序列的分离核酸分子还可包括多达10个或甚至多达20个或更多个其它蛋白质或其部分或片段的编码序列，或者可包括有效连接的控制所列举的核酸序列编码区表达的调节序列，和/或可包括载体序列。表述“调控序列”是指特定宿主生物体中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的调控序列包括启动子、任选操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当与另一核酸序列处于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白质表达，则前序列或分泌前导区的DNA与多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列有效连接；或者如果核糖体结合位点的定位有利于翻译，则核糖体结合位点与编码序列有效连接。总的来讲，“有效连接”意指所连接的DNA序列是邻接的，而在分泌前导区的情况下，是邻接的且是符合读相的(in reading phase)。然而,增强子不一定是邻接的。连接通过在合宜的限制位点连接而实现。如果这种位点不存在，则按常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头本文所用表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，所有这类名称包括子代。因此，术语“转化体”和“转化细胞”包括原代主题细胞和由其得到的培养物而不论传递次数。还要理解的是，由于有意的或不经意的突变所致，所有子代的DNA内容物可能并不完全相同。包括了在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的突变型子代。虽然指定不同名称，但从上下文看将是清楚的。本文所用“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中按照例如美国专利号4，683，195中所述扩增极少量的核酸、RNA和/或DNA的特定片段的方法或技术。一般目标区末端或以外的序列信息必须是可得的，使得可设计寡核苷酸引物；这些引物可与待扩增模板的相反链的序列相同或相似。2个引物的5'端核苷酸可与扩增材料的末端一致。可采用PCR扩增特定的RNA序列、来自全基因组DNA的特定DNA序列和自细胞总RNA、噬菌体或质粒序列转录的 cDNA 等。一般参见 Mullis 等(1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 263 ；Erlich 主编(1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N. Y)。本文所用 PCR 被视为是一个(但不是唯一的)用于扩增核酸试验样品的核酸聚合酶反应方法的实例，该方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶以扩增或产生特定的核酸片段。本文所用术语“种系序列”是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可使用任何合适来源的未重排的免疫球蛋白。“抑制剂”和“拮抗剂”或“活化物”和“激动剂”分别是指抑制或活化分子，例如用
于例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的活化。例如基因、受体、配体或细胞的调节剂是改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中活性可因其调节性质被活化、抑制或者改变。调节剂可单独起作用，或者可以使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。抑制剂是降低、阻断、防止、延迟活化、钝化、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。活化物是提高、活化、利于、促进活化、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂还可定义为降低、阻断或钝化组成型活性的化合物。“激动剂”是与靶标相互作用引起或促进靶标活化增加的化合物。“拮抗剂”是对抗激动剂的作用的化合物。拮抗剂防止、降低、抑制或中和激动剂的活性。甚至在没有已鉴定的激动剂的情况下，拮抗剂还可防止、抑制或降低靶标(例如靶受体)的组成型活性。在BTLA的情况下，BTLA激动剂可启动和增强BTLA递送给B细胞和T细胞的负信号。另一方 面，BTLA拮抗剂可阻断对B细胞和T细胞的信号转导，因此增加B细胞和T细胞活化/增殖。为了检查抑制程度，将例如包含给定蛋白质、基因、细胞或生物体的样品或实验物用潜在活化物或抑制剂处理，并与无抑制剂的对照样品进行比较。将对照样品(即未用拮抗剂处理的样品)的相对活性值指定为100%。当活性值相对于对照为以下值时便达到抑制约90%以下、通常85%以下、更通常80%以下、最通常75%以下、普遍70%以下、更普遍65%以下、最普遍60%以下、通常55%以下、通常50%以下、更常45%以下、最常40%以下、优选35%以下、更优选30%以下、甚至更优选25%以下、最优选小于25%。当活性值相对于对照为以下较高值时便达到活化约110%、普遍至少120%、更普遍至少140%、更普遍至少160%、时常至少180%、更时常至少2倍、最时常至少2. 5倍、通常至少5倍、更常为至少10倍、优选至少20倍、更优选至少40倍和最优选超过40倍。可如下监测活化或抑制中的终点。可通过终点监测例如细胞、生理流体、组织、器官和动物或人受试者的活化、抑制和对治疗的反应。终点可包括例如炎症迹象、致肿瘤性或细胞脱粒或分泌(例如细胞因子、毒性氧或蛋白酶的释放)的预定量或百分比。终点可包括例如预定量的离子流出或转运、细胞迁移、细胞粘附、细胞增殖、转移潜力、细胞分化以及表型的改变，例如与炎症、细胞凋亡、转化、细胞周期或转移有关的基因表达的改变(参见例如 Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30 :145-158 ；Hood 和 Cheresh (2002)Nature Rev.Cancer 2 :91-100 ;Timme 等(2003)Curr. Drug Targets 4 :251-261 ;Robbins和 Itzkowitz (2002)Med. Clin. North Am. 86 1467-1495 ；Grady 和 Markowitz (2002) Annu.Rev.Genomics Hum. Genet. 3 :101-128 ;Bauer 等(2001)Glia 36 :235-243 ；Stanimirovic和 Satoh(2000)Brain Pathol. 10 :113-126)。抑制的终点一般是对照的75%以下，优选对照的50%以下，更优选对照的25%以下，最优选对照的10%以下。活化的终点一般为对照的至少150%，优选至少2倍于对照，更优选至少4倍于对照，最优选至少10倍于对照。“配体”是指例如可用作受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽和膜缔合或膜结合分子或其复合物。“配体”还包括不是激动剂或拮抗剂但可与受体结合的物质。此外，“配体”包括例如通过化学或重组方法改变成膜结合配体的可溶性形式的膜结合配体。按惯例，如果配体在第一细胞上是膜结合的，则受体通常出现在第二细胞上。第二细胞可具有与第一细胞相同或不同的特性。配体或受体可以是完全胞内的，也就是说，它可存在于细胞溶胶、核或某些其它胞内区室中。配体或受体可改变其位置，例如从胞内区室变到质膜的外表面。配体和受体的复合物称为“配体受体复合物”。如果配体和受体参与信号转导途径，则配体出现在信号转导途径的上游位置，而受体出现在下游位置。HVEM是TNF受体超家族成员。除与BTLA结合以外，其还可与LIGHT、LTa和CD160结合。“小分子”定义为分子量小于lOkDa、通常小于2kDa、优选小于lkDa、最优选小于约500Da的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含有无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗药，与大分子相比，小分子可以是更易透过细胞、较不易降解和较不易诱导免疫应答。已对小分子例如抗体的肽模拟物和细胞因子以及小分子毒素进行了描述(参见例如Casset等(2003)Biochem. Biophys.Res. Commun. 307 :198-205 ;MuyIdermans (2001)J. Biotechnol. 74:277-302 ；Li(2000)Nat. Biotechnol. 18 1251-1256 ；Apostolopoulos 等(2002)Curr. Med. Chem. 9 :411-420 ；Monfardini 等(2002)Curr. Pharm. Des. 8 :2185-2199 ；Domingues 等(1999)Nat. Struct.Biol. 6 :652-656 ；Sato 和 Sone (2003) Biochem. J. 371 :603-608 ;授权与 Stewart 等人的美国专利号6，326,482)。提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时的“特异性”或“选择性”结合，是指确定异质蛋白质群和其它生物制剂中蛋白质存在的结合反应。因此，在指定条件下，具体配 体与特定受体结合，而不以显著的量与样品中存在的其它蛋白质结合。预期方法的抗体或由抗体的抗原结合部位衍生的结合化合物与其抗原或其变体或突变蛋白结合，其亲和力比与任何其它抗原的亲和力高，为至少2倍、优选至少10倍、更优选至少20倍、最优选至少100 倍。本文所用术语“免疫调节剂”是指抑制或调节免疫应答的天然或合成的作用剂。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。本文所用“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制药”是用于免疫抑制治疗以抑制或防止免疫系统活性的治疗药。在临床上它们用于防止移植器官和组织(例如骨髓、心脏、肾、肝)排斥和/或用于以下疾病的治疗自身免疫病或很可能是自身免疫起因的疾病(例如类风湿性关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、多发性硬化)。免疫抑制药可分为糖皮质激素；细胞抑制剂；抗体；生物反应修饰剂，例如Ig融合蛋白，包括CTLA-4/Ig(AbataCept );作用于抑免蛋白的药物；其它药物，包括用于治疗增殖性病症的已知化疗药物，例如霉酚酸吗乙酯(MMF)。特别是对于多发性硬化，本发明的抗体可与称为copaxone的一类新的髓磷脂结合蛋白样治疗药联合给予。“抗炎剂”或“抗炎药”是指留体治疗药和非留体治疗药两者。留体，亦称为皮质甾类，是非常像皮质醇(一种由肾上腺天然产生的激素)的药物。留体用作某些炎性病况例如系统性血管炎(血管炎症)和肌炎(肌肉炎症)的主要治疗。还可选择性使用留体以治疗炎性病况，例如类风湿性关节炎(身体两侧关节内发生的慢性炎性关节炎)；系统性红斑狼疮(因免疫系统功能异常引起的全身性疾病)；斯耶格伦综合征(引起眼干和口干的慢性病症)。非留体抗炎药，通常缩写为NSAID，是具有镇痛、解热和抗炎作用的药物一它们减轻疼痛、发热和炎症。使用术语“非甾体”将这些药物与(除多种其它作用以外)具有类似的降类二十烷酸、抗炎作用的留体区分开来。NSAID—般适用于以下病况的症状缓解类风湿性关节炎；骨关节炎；炎性关节病(例如强直性脊柱炎、银屑病关节炎、赖特综合征(Reiter; s syndrome));急性痛风；痛经；转移性骨疼痛；头痛和偏头痛；术后疼痛；因炎症和组织损伤所致的轻度-中度疼痛；发热和肾绞痛。NSAID包括水杨酸酯、芳基烷酸类(arlyalknoic acid)、2_芳基丙酸(洛芬)、N-芳基氨茴酸(芬那酸)、昔康、昔布和磺苯胺。可给予缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)，时常与NSAID联用。普遍处方使用的DMARD包括羟氯喹/氯喹、甲氨蝶呤、金疗法、柳氮磺吡啶和硫唑嘌呤。“信号转导途径”是指在信号从细胞的一个部分传递到细胞的另一个部分中起作用的各种信号转导分子间的生化关系。本文所用表述“细胞表面受体”包括例如能够接收信号和跨细胞质膜传递这种信号的分子和分子复合物。本公开内容的“细胞表面受体”的实例是BTLA受体。人BTLA特异性抗体
本发明总的来讲涉及与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段和这类抗体或其抗原结合片段的用途。更具体而言，本发明提供分离的完全人抗BTLA抗体以及这些抗体或其抗原结合片段在疾病治疗中的应用方法。完全人抗BTLA抗体的实例包括但不限于HuMab8D5,hu Mab8A3,hu Mab21H6,hu Mabl9A7和 hu Mab4C7。本发明提供分离的抗BTLA激动剂抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段具有一种或多种下列性质(I)不阻断HVEM或LIGHT与人BTLA结合；(2)与食蟹猴BTLA交叉反应；(3)在蛋白质结合测定(例如Biacore)中与人BTLA结合的Kd为至多约
2.5xl0_9 ;和⑷在T细胞和B细胞活化测定中的EC5tl为至少约ΙΟηΜ。在一个实施方案中，在蛋白质结合测定(例如Biacore ;实施例2-3)中，抗BTLA抗体或其抗原结合片段与人BTLA结合的Kd为至多约2. 5xl(T9，在T细胞和B细胞活化测定中的EC5tl为约ΙΟ-ΙΟΟηΜ。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是阻断HVEM与BTLA结合的分离的完全人抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，这种抗体的实例包括但不限于完全人抗 BTLA 抗体 hu Mab4C7。与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段可包含本发明所述抗体和抗原结合片段的1、2、3、4、5或6个互补决定区(⑶R)。1、2、3、4、5或6个⑶R可独立选自本发明的抗体和抗原结合片段的所述⑶R序列(例如表1，表2)。或者，1、2、3、4、5或6个⑶R可选自本发明的单个所述抗体或抗原结合片段的CDR序列。在某些实施方案中，I、2或3个CDR选自所述激动剂抗体的Vl CDR(例如表I ；SEQ ID NO :12-14)和/或1、2或3个CDR选自所述发明的Vh⑶R(例如表2;SEQ ID NO :5-7)。在另一个实施方案中，1、2或3个⑶R选自所述拮抗剂抗体的\⑶R(例如表I ;SEQ ID NO :26-28)和/或1、2或3个⑶R选自所述发明的 Vh CDR(例如表 2;SEQ ID NO :19-21)。与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段可包含至少一个抗体轻链可变(')结构域，其包含一个或多个选自以下的⑶R-Ll、⑶R-L2或⑶R-L3 (a)抗体hu Mab8D5可变区的 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 ； (b)抗体 hu Mab8A3 可变区的 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 ；
(c)抗体 hu Mab21H6 可变区的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 ;和(d)抗体 hu Mabl9A7 可变区的 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3。与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段可包含至少一个抗体重链可变(VH)结构域，其包含一个或多个选自以下的CDR-Hl、CDR-H2或CDR-H3 (a)抗体hu Mab8D5可变区的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3 ； (b)抗体 hu Mab8A3 可变区的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3 ；(C)抗体 hu Mab21H6 可变区的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 ;和(d)抗体 hu Mabl9A7 可变区的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3。在一个优选的实施方案中，与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段包含至少一个抗体轻链可变结构域和至少一个抗体重链可变(Vh)结构域，所述抗体轻链可变(')结构域包含选自以下的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3 (a)抗体hu Mab8D5可变区的CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 ； (b)抗体 hu Mab8A3 可变区的 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 ； (c)抗体 hu Mab21H6 可变区的 CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3 ；和(d)抗体 hu Mabl9A7 可变区的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;而所述抗体重链可变(Vh)结构域包含选自以下的⑶R-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 (a)抗体 hu Mab8D5 可变区的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3 ； (b)抗体 huMab8A3 可变区的 CDR-Hl、CDR_H2 和 CDR-H3 ； (c)抗体 hu Mab21H6 可变区的 CDR-Hl、CDR_H2和 CDR-H3 ;和(d)抗体 hu Mabl9A7 可变区的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3。本发明抗体轻链和重链⑶R的序列分别见表I和表2。通过举例而非限制，激动剂抗体的'结构域⑶R选自SEQ ID NO : 12-14，而拮抗剂抗体的'结构域⑶R选自SEQ ID N0:26-28。同样，激动剂抗体的Vh结构域CDR选自SEQ ID NO :7_9，而拮抗剂抗体的Vh结构域 CDR 选自 SEQ ID NO: 10-12。表I:轻链 CDR
抗体CDRlCDR2CDR3
8D5(激动剂)
(SEQ ID NO 12)(SEQ ID NO 13)(SEQ ID NO 14)
4C7(拮抗剂)
(SEQ ID NO 26, VK) (SEQ ID NO 27, VK)(SEQ ID NO :28，Vk)表2:重链 CDR
抗体CDRlCDR2CDR3
8D5(激动剂)
(SEQ ID NO 5)(SEQ ID NO 6)(SEQ ID NO 7)
4C7(拮抗剂)
(SEQ ID NO 19) (SEQ ID NO 20)(SEQ ID NO 21)本发明还提供与BTLA结合、起激动剂抗体作用并包含抗体HuMab8D5的成熟\结构域(SEQ ID No 18)的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体。优选的完全人激动剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab8D5.huMab8A3,hu Mab21H6,hu Mabl9A7 及其抗原结合片段。本发明还提供与BTLA结合、起拮抗剂作用并包含抗体Hu Mab4C7的成熟'结构域(SEQ ID NO 32)的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体。优选的完全人拮抗剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab4C7及其抗原结合片段。本发明还提供与BTLA结合、起激动剂作用并包含选自(a)抗体Hu Mab8D5的成熟Vh结构域(SEQ ID NO 11)的至少一个Vh结构域的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人单克隆激动剂抗BTLA抗体。优选的完全人激动剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mabl9A7及其抗原结合片段。本发明还提供与BTLA结合、起拮抗剂作用和包含选自(a)抗体hu Mab4C7的成熟Vh结构域(SEQ ID NO 25)的至少一个Vh结构域的分离抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人拮抗剂抗BTLA抗体。优选的完全人拮抗剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab4C7及其抗原结合片段。本发明提供与BTLA结合并且具有选自SEQ ID NO : 12、13和14的至少一个Vl结构域和选自SEQ ID NO :5、6和7的至少一个Vh结构域的分离激动剂抗体或其抗原结合片 段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人激动剂抗BTLA抗体。优选的完全人激动剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab8D5,hu Mab8A3,hu Mab21H6、hu Mabl9A7及其抗原
结合片段。本发明提供与BTLA结合并具有选自SEQ ID NO :26、27、28的至少一个Vl结构域和选自SEQ ID NO 19,20和21的至少一个Vh结构域的分离拮抗剂抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，抗体是完全人拮抗剂抗BTLA抗体。优选的完全人拮抗剂抗BTLA抗体的实例包括但不限于hu Mab4C7及其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的分离抗体包含重链恒定区，优选人恒定区，例如Y I、Y 2、γ3或Y 4人重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，结合化合物包含轻链恒定区，优选人轻链恒定区，例如λ或K人轻链区或其变体。通过举例而非限制，人重链恒定区可为Y 1，人轻链恒定区可为K。在一个备选的实施方案中，抗体的Fe区是具有Ser228Pro突变的 Y 4 (Schuurman, J 等，Mol. Immunol. 38 1-8, 2001)。在一个实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、Fab’ _SH、Fv、scFv、F (ab，)2和双抗体。本发明还提供包含本发明抗体的Vl结构域(例如SEQ ID NO : 16、18、30、32、37和38)的分离多肽和包含本发明抗体的Vh结构域(例如SEQ ID NO :9、11、23和25)的分离多肽。在一个实施方案中，本发明提供与BTLA结合并具有至少95%、90%、85%、80%、75%或50%序列同源的'结构域Vh结构域的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或以上的保守或非保守氨基酸取代，同时仍具有所需结合性质的\和Vh结构域(含或不含信号序列)。“保守修饰变体”或“保守取代”是指蛋白质中的氨基酸被具有相似性质(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸取代，使得在不改变蛋白质的生物活性的情况下可频繁进行变化。本领域技术人员认识到，多肽非必要区的单个氨基酸取代一般不会显著改变生物活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co.,第 224 页(第 4版))。另外，结构或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。本发明各种实施方案的结合化合物包含具有下述序列的多肽链与本文公开的具体氨基酸序列(例如SEQ ID N0:5、6、7、9、ll、12、13、
14、16、18、19、20、21、23、25、30、32 和 37)比较时，其包括至多 O (无变化)、1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、12、15、20个或更多个保守氨基酸取代。本文所用表述“至多X个”保守氨基酸取代包括O个取代和取代至多X的任何数目并包括X个取代的取代。这种示例性取代优选按照下列表3给出的取代进行表3示例性保守氨基酸取代
权利要求
1.一种与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO:.12、13和14的Vl CDR结构域和至少一个选自SEQ ID NO :5、6和7的Vh CDR结构域。
2.一种与BTLA结合的分离抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个选自SEQ ID NO:.26、27、28的Vl CDR结构域和至少一个选自SEQ ID NO : 19、20和21的Vh CDR结构域。
3.一种分离抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中 (a)所述重链可变区包含SEQID NO :11 (8D5重链)的氨基酸序列；和 (b)所述轻链可变区包含SEQID NO:18(8D5轻链)的氨基酸序列。
4.一种分离抗体或其抗原结合片段，其包含 (a)包含SEQID NO 5(8D5HCDR1)的氨基酸序列的重链可变区CDRl ； (b)包含SEQID NO 6(8D5HCDR2)的氨基酸序列的重链可变区CDR2 ； (c)包含SEQID NO 7(8D5HCDR3)的氨基酸序列的重链可变区CDR3 ; (d)包含SEQID NO :12(8D5LCDR1)的氨基酸序列的轻链可变区CDRl ； (e)包含SEQID NO :13(8D5LCDR2)的氨基酸序列的轻链可变区CDR2 ;和 (f)包含SEQID NO :14(8D5LCDR3)的氨基酸序列的轻链可变区CDR3 ; 其中所述抗体与BTLA特异性结合且不阻断与HVEM结合。
5.—种分离抗体或其抗原结合片段，其包含 (a)重链可变区，其是人VH基因(SEQID NO:8)[编码8D5]的产物或来源于所述人VH基因；和 (b)轻链可变区，其是人VK基因(SEQID NO :15)[编码8D5]的产物或来源于所述人VK基因；其中所述抗体与BTLA特异性结合。
6.一种分离多肽，其包含权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段的'结构域或Vh结构域。
7.一种分离核酸，其编码权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段的'结构域或Vh结构域或者权利要求6的分离多肽。
8.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段或者权利要求6的分离多肽，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
9.一种治疗受试者的因BTLA表达和/或活性降低引起的病况的方法，所述方法包括将有效量的包含一种或多种权利要求I或3-5中任一项的抗体或抗原结合片段的组合物给予受试者。
10.一种治疗受试者的炎性病症或自身免疫病症的方法，所述方法包括将有效量的权利要求I或3-5中任一项的激动剂抗体或抗原结合片段给予受试者。
11.权利要求10的方法，其中所述炎性病症或自身免疫病症选自克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、炎性纤维化、硬皮病、肺纤维化、和肝硬化、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、骨质疏松、哮喘(包括变应性哮喘)、变态反应、慢性阻塞性肺病(COPD)、多发性硬化、银屑病、眼色素层炎、移植物抗宿主病(GVHD)、青少年早发性I型糖尿病、移植排斥、SLE和斯耶格伦综合征。
12.一种提高受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的包含权利要求2的抗体或抗原结合片段的组合物给予受试者。
13.—种表达载体,其包含权利要求7的分离核酸。
14.一种宿主细胞，其包含权利要求13的表达载体。
15.—种产生权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括 a.在表达核酸序列的条件下，将权利要求14的宿主细胞在培养基中培养，从而产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；和 b.从所述宿主细胞或培养基中回收所述多肽。
全文摘要
本发明涉及对BTLA有特异性的结合化合物及其用途。更具体而言，本发明涉及识别人BTLA并调节其在癌症、炎性病症和自身免疫病症中的活性的完全人抗体。
文档编号A61K39/395GK102762593SQ201080045118
公开日2012年10月31日 申请日期2010年7月26日 优先权日2009年7月31日
发明者A·J·科尔曼, A·范埃尔萨斯, E·L·霍尔克, H·N·勒不兰, J·M·马塔拉扎, K·B·图久姆, M·塞尔比, T·W·斯普罗尔 申请人:米德列斯公司