专利名称：一种狂犬病病毒中和抗体细胞凝集试验检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种狂犬病病毒中和抗体細胞凝集试验检测方法，即以表达狂犬病病毒糖蛋白的細胞作为抗原和载体颗粒，通过与人、犬和猫的血清抗体进行凝集反应，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗体是否达到免疫保护水平；属于生物工程技术领域。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的ー种致死性传染病，一旦发病即导致100%死亡。防止狂犬病发生的根本手段是对动物进行暴露前预防免疫或对人进行暴露后紧急治疗。两种方法都是通过注射疫苗，使接种动物或人产生足够水平的中和抗体，从而阻止病毒感染的发生。免疫动物或人体内狂犬病病毒中和抗体达到0. 5IU/mL以上，既可有效防止狂犬病病毒的感染，中和抗体水平越高，其維持免疫保护的时间越长，因此，定量监测血清内中和抗体滴度，对于判断免疫效果和免疫持续期具有重要的意义。用于测定狂犬病病毒中和抗体的方法包括小鼠脑内中和试验、蚀斑抑制试验、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)和荧光抗体病毒中和试验(FAVN)等，其中RFFIT法和FAVN法分别是WHO和OIE推荐的标准方法。但是，这些检测方法所需时间较长(一般在48h以上)，操作复杂(需要使用活病毒和动物、細胞)，而且检测成本高。为了改进这些方法，不同的实验室和研究人员分别建立了酶联免疫吸附试验、荧光标记抗体检测和乳胶凝集试验等方法，但这些技术均以病毒颗粒或纯化蛋白作为抗原， 存在检测抗体针对性不强或成本高的缺点。
发明内容
本发明涉及ー种狂犬病病毒中和抗体細胞凝集试验检测方法，解决了传统测定狂犬病病毒中和抗体的方法时间长、操作复杂、检测成本高等问题。本发明公开的狂犬病病毒中和抗体細胞凝集试验检测方法，采用以下技术解决方案
以表达狂犬病病毒糖蛋白的細胞作为抗原和载体颗粒，通过与血清抗体进行凝集反应，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗体是否达到免疫保护水平。基本方案以携带狂犬病病毒糖蛋白基因的pIRES-neo真核表达载体分别转染人胚肾细胞四3、犬肾细胞MDCK和猫肾细胞F81，通过G418筛选，分別获得稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的細胞系。然后，将该細胞系在1%多聚甲醛中固定后，取其产物分別与人、犬和猫的待检血清进行反应，当血清中狂犬病病毒中和抗体水平达到免疫保护水平吋，会出现明显的凝集现象，否则不凝集。本发明的狂犬病病毒中和抗体細胞凝集试验检测方法的建立 1.狂犬病病毒糖蛋白基因表达载体的构建
利用商品化的真核表达质粒载体pIRES-neo (CL0NTECH公司产品)，通过常规的分子克隆技术构建表达狂犬病病毒糖蛋白基因(GenBank :AF499686. 2)的载体pIRES_neo/G。2.稳定表达细胞系的建立在转染试剂(脂质体等)的介导下，将构建的真核表达载体pIRES-neo/G分别转染至人胚肾细胞四3、犬肾细胞MDCK和猫肾细胞F81中，通过G418筛选，获得稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的細胞系。3.抗原与载体颗粒的制备
将该細胞系用PBS (pH7. 4)洗涤3次后，加入等体积的1%多聚甲醛固定后，2000rpm离心3min，细胞沉淀用等体积PBS (pH7. 4)重悬，即获得携帯抗原的载体颗粒。4.細胞凝集试验
取携帯抗原的载体颗粒，分別与稀释后的人、犬和猫待检血清等体积混合后，37°C反应 15min,当血清中狂犬病病毒中和抗体水平达到免疫保护水平吋，会出现明显的凝集现象， 否则不凝集。发明的积极效果在于采用真核传代細胞建立了ー种凝集试验方法，可用于检测狂犬病病毒中和抗体水平，在制备和检测程序上，均不同于目前广泛使用的红细胞凝集试验和乳胶凝集试验。本方法具有以下特卢"采用真核細胞表达的狂犬病病毒糖蛋白(无需纯化)作为抗原。糖蛋白是唯一能够诱导中和抗体的狂犬病病毒结构蛋白，因此，以其作为抗原，可以特异性检测具有中和活性的抗体。②以本动物細胞作为载体颗粒。分別以携带糖蛋白的人胚肾细胞四3、犬肾细胞MDCK和猫肾细胞F81为载体颗粒，原因一是普通凝集试验采用的乳胶(Latex)颗粒制备成本高，而且吸附的抗原需要纯化，エ艺复杂；二是人、犬和猫的血清中不存在针对各自体細胞的特异性抗体，采用人胚肾细胞四3、犬肾细胞MDCK和猫肾细胞F81分別作为检测人、犬和猫血清的凝集载体，可避免出现假阳性。j制备、操作简单、 反应快速，整个检测过程仅需半小吋。与乳胶凝集试验相比，省去了载体颗粒与抗原的包被过程，只需在载玻片上滴加稀释的血清和表达狂犬病病毒糖蛋白的细胞悬液，混勻即可ンi1 判定准确。特异性检测中和抗体，且能准确判定抗体的保护力。
图1、CL0NTECH公司的真核表达质粒载体；
图2、荧光抗体检测293細胞表达糖蛋白(左为正常细胞对照，右为转染后細胞系)； 图3、293細胞凝集(左为呈葡萄串状凝集的細胞，右为均勻分布的未凝集細胞)； 图4、荧光抗体检测MDCK細胞表达糖蛋白(左为正常细胞对照，右为转染后細胞系)； 图5、MDCK細胞凝集(左为呈葡萄串状凝集的細胞，右为均勻分布的未凝集細胞)； 图6、荧光抗体检测F81細胞表达糖蛋白(左为正常细胞对照，右为转染后細胞系)； 图7、F81細胞凝集(左为呈葡萄串状凝集的細胞，右为均勻分布的未凝集細胞)。具体实施方案
下面结合实施例，对本发明做进ー步描述。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例1
狂犬病病毒糖蛋白基因真核表达载体的构建
利用商品化的真核表达质粒载体pIRES-neo (图1)的多克隆酶切位点^^. BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(GenBank :AF499686. 2)，构建表达糖蛋白基因的表达盒。EcoR V私BamH I双酶切体系(宝生物工程(大连)有限公司产品)两种内切酶各 10U，K缓冲液2Pl，pIRES-ne0质粒 μδ,蒸馏水补至20μ1。37°C水浴1小时后，1%琼脂糖凝胶电泳回收5. 3bp条带(回收步骤參照Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒说明书)。DNA连接体系(宝生物工程(大连)有限公司产品)T4 DNA连接酶200U，反应缓冲液 μ ，狂犬病病毒糖蛋白基因片段和回收的pIRES-ne0片段各0. 5μδ,蒸馏水补至10μ1。 16°C水浴4小时后，转化感受态Dffia。转化条件5μ1连接产物加入ΙΟΟμΙ感受态Dffia (宝生物工程(大连)有限公司产品)，冰浴30min，42°C热激90秒，取转化产物涂Amp抗性LB平板，37°C培养12小吋。重组pIRES-neo/G鉴定挑取单菌落，置Amp抗性LB中37°C培养12小吋，提取质粒(步骤參照Axygen公司质粒小量提取试剂盒说明)，EcoR . BamH I双酶切质粒(体系同上)，1%琼脂糖凝胶电泳出现5. 3bp和1. 75bp条带，为重组质粒pIRES-neo/G。实施例2
人狂犬病病毒中和抗体細胞凝集试验检测方法的建立 1.稳定表达细胞系的建立
在脂质体2000的介导下，将构建的真核表达载体pIRES-neo/G转染至人胚肾細胞293 中。转染步骤取10μ1脂质体2000，与的pIRES-neo/G等体积混合5min ；去除細胞培养基，将混合液平铺在单层细胞上，370C 5%C02感作30min，加入含5%小牛血清的DMEM培养基，37°C 5%C02培养。次日，去除细胞培养基，以含15(^g/mL G418和5%小牛血清的DMEM 对细胞进行筛选，获得稳定表达neo基因的293細胞系。利用商品化FITC标记的狂犬病病毒抗体对获得的细胞进行染色，荧光显微镜下鉴定糖蛋白表达情况(图2)。2.抗原与载体颗粒的制备
将该細胞系用PBS (pH7. 4)洗涤3次后，加入等体积1%多聚甲醛4°C固定20min后， 获得携帯抗原的载体颗粒。2000rpm离心3min，去除上清，细胞沉淀用等体积PBS (pH7. 4) 重悬，并调整细胞浓度至1 X 106/mL。3.細胞凝集试验的建立
取0. 5IU/mL的狂犬病病毒标准血清(AFSSA，法国)，分別用PBS (pH7. 4)稀释5倍和 10倍。将细胞和稀释血清等体积混合后，37°C反应15min。光学显微镜(OLYMPUS产品)20 倍物镜下观察(图3)。当5倍稀释的血清发生凝集，10倍稀释的血清不发生凝集吋，检测成立；待测样品若5倍稀释后凝集，10倍稀释后不凝集吋，抗体水平判定为0. 5IU/mL ；待测样品若5倍和10倍稀释后均凝集，抗体水平判定为大于0. 5IU/mL ；待测样品若5倍和10倍稀释后均不凝集，抗体水平判定为小于0. 5IU/mL。4.人血清样品的检测
人血清样品8份，由本实验室工作人员提供。細胞凝集试验法检测步骤取待检血清和0. 5IU/mL的狂犬病病毒标准血清，分別用PBS (pH7. 4)稀释5倍和10倍。取25μ1細胞和稀释血清等体积混合后，37°C湿盒内反应15min。光学显微镜20倍物镜下观察凝集情況。FAVN法检测步骤对待检血清按β1』2』3、.. . 312进行稀释，加入100 TCID50的狂犬病病毒CVS-Il感作一定时间后，加入ΒΗΚ-21細胞，培养48h。丙酮固定細胞后，加荧光标
5记抗体染色，荧光显微镜下读取結果。以100 TCID5tl CVS-Il的复制完全被抑制作为最终抑制效价判定結果。以0. 5IU/mL作为狂犬病最低保护水平。检测结果如表1所示，細胞凝集试验的检测结果与FAVN (金标准)法完全一致。表1人血清样品检测结果
权利要求
1.一种通过細胞凝集反应检测狂犬病病毒中和抗体水平的方法，其特征为以表达狂犬病病毒糖蛋白的人宫颈癌HeLa細胞裂解物同时作为抗原和载体颗粒，通过与人、犬和猫的血清抗体分别进行凝集反应，判定血清中所含狂犬病病毒中和抗体是否达到免疫保护水平。
2.如权利要求1所述检测狂犬病病毒中和抗体水平的方法，包括以下步骤1)狂犬病病毒糖蛋白基因表达载体的构建利用真核表达质粒载体pIRESneo，通过常规的分子克隆技术构建表达狂犬病病毒糖蛋白基因的载体PlRESneo-G ；2)稳定表达细胞系的建立在转染试剂的介导下，将构建的真核表达载体PlRESneo-G转染至人宫颈癌HeLa細胞中，通过G418筛选，获得稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的細胞系；3)抗原与载体颗粒的制备将该細胞系用PBS洗涤3次后，加入PBS冻融裂解3次后，获得携帯抗原的载体颗粒；4)細胞凝集试验取携帯抗原的载体颗粒与待检血清等体积混合后，37°C反应15min，当血清中狂犬病中和抗体水平达到免疫保护水平吋，会出现明显的凝集现象，否则不凝集。
全文摘要
本发明提供一种狂犬病病毒中和抗体细胞凝集试验检测方法，即以表达狂犬病病毒糖蛋白的细胞作为抗原和载体颗粒，通过与人、犬和猫的血清抗体进行凝集反应，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗体是否达到免疫保护水平；解决了传统测定狂犬病病毒中和抗体的方法时间长、操作复杂、检测成本高等问题。
文档编号G01N33/569GK102539757SQ201210051228
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者刘晔, 张守峰, 张菲, 扈荣良 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所