专利名称：树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法
技术领域：
本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及检测树駒IgG的抗体夹心ELISA方法。
背景技术：
树駒(Tupaia, tree shrew)是一种形似松鼠的小型攀缘型哺乳动物，主要分布于 亚洲东南部的热带和亚热带地区，在我国云南、广西、广东和海南等地广泛分布。树駒体型 小，生长繁殖快，易于捕捉、驯养和繁殖成本低，其新陈代谢特点和解剖学一些特点比啮齿 类动物更接近人类，很多人把树駒归到灵长类动物中。随着国内外非人灵长类资源的逐渐 减少和实验动物小型化的发展趋势，树駒作为研究人类相关疾病的可能动物模型受到广泛 关注，现已应用于病毒学、脑缺血、神经、糖尿病、心理、血管、肿瘤、寄生虫等方面的研究。国内外学者用树駒作为动物模型在病毒学方面的研究和应用已有很多，可以此为 基础利用树駒进行多种病毒感染的发病机理，药物筛选以及疫苗制备和检定的研究，其中 研究最多的是肝炎病毒和疱疹病毒。树駒作为一种人类疾病实验动物模型有很大的应用前景，尤其是病毒性疾病动物 模型，但研究主要局限在通过PCR检测病毒核酸和其它一些生理指标上。抗体水平是疾病 检测中重要的指标之一，受研究工具的影响，与树駒疾病相关抗体的研究很少。抗体方面研 究很难实现，树駒应用于人类疾病，尤其是病毒方面动物模型有很大的阻碍，因此制备树鼠句 抗体研究工具和建立抗体方法成为目前亟待解决的问题。迄今，现有技术中未见有检测树 鼠句IgG的方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测树駒IgG的三抗体夹心ELISA方法，用于检测树 鼠句血浆中总IgG的含量。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案树駒IgG的三抗体夹心ELISA检测方法，包括以鼠抗树駒IgG单克隆抗体为捕获 抗体，以兔抗树駒IgG多克隆抗体为二抗与抗原树駒IgG结合，以羊抗兔IgG-HRP为检测抗 体，建立检测树駒IgG的三抗体夹心ELISA方法。该方法包括将捕捉抗体即鼠抗树駒IgG单克隆抗体包被与ELISA板上，100 μ 1/ 孔，37°C温育2h，4°C过夜；将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使树駒IgG与捕 捉抗体结合，37°C温育Ih ；使结合到固相化捕捉抗体上的树駒IgG与二抗即兔抗树駒IgG 多克隆抗体结合，37°C温育Ih ；加入检测抗体即羊抗兔IgG-HRP与兔抗树駒IgG多克隆抗 体结合，37°C温育lh，来检测树駒IgG。该方法中的酶标板为购自Coster公司的96孔单孔可拆式酶标板，包被缓冲液为 PH9. 6的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，样品稀释液为pH 7. 4的PBS缓冲液，洗涤液为0. 05 % 的PBST缓冲液，商品化的羊抗兔IgG-HRP购自博士德生物工程有限公司。该方法更具体的步骤包括
(I)IgG标准曲线的建立含1/400鼠抗树駒IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100 μ 1/孔，37°C温 育2h，4°C过夜；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干； 2% BSA封闭，200 μ 1/孔，37°C温育2h ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去 洗涤液在吸水纸上拍干；加不同稀释浓度的标准品树駒IgG，将标准品树駒IgG稀释成浓 度为 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、 1· 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml,0. 125 μ g/ml,0. 0625 μ g/ml ；同时设阴性对照和空白 对照，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍 干；加1/2000兔抗树鼠句IgG多克隆抗体，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/ 孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C温 育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底 物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光温育15min ；加入2M H2SO4终止反应，100 μ 1/孔，用酶标仪测 定OD45tl值；以不同稀释浓度的标准品树駒IgG含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制 标准曲线，建立回归方程；(2)树駒血浆中IgG含量检测含1/400鼠抗树駒IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100 μ 1/孔，37°C温 育2h，4°C过夜；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干； 2% BSA封闭，200 μ 1/孔，37°C温育2h ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去 洗涤液在吸水纸上拍干；加1/5000待检树駒血浆，不同稀释浓度的标准品树駒IgG，将标 准品树鼠句 IgG 稀释成浓度为 10. 0 μ g/ml,8. 0 μ g/ml,6. 0 μ g/ml,5. 0 μ g/ml,4. 0 μ g/ml, 3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、l. 0μ g/ml、0. 5 μ g/ml、0. 25μ g/mUO. 125 μ g/mUO. 0625 μ g/ml, 同时设阴性对照和空白对照，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃 去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树駒IgG多克隆抗体，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ； PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊 抗兔，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min,弃去洗涤液在 吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光温育15min ；加入2M H2SO4终止反 应，100 μ 1/孔，用酶标仪测定OD45tl值。本发明的方法可以概括为以鼠抗树駒IgG单克隆抗体为捕获抗体，以兔抗树駒IgG多克隆抗体为二抗与抗 原树駒IgG结合，以商品化的羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，建立检测树駒IgG的三抗体夹心 ELISA方法。包括以下步骤①将捕捉抗体即鼠抗树駒IgG单克隆抗体包被与ELISA板上；②将检测样品和标准品与固相化的捕捉抗体保温，使树駒IgG与捕捉抗体结合；③使结合到固相化捕捉抗体上的树駒IgG与二抗即兔抗树駒IgG多克隆抗体结 合；④加入检测抗体即商品化的羊抗兔IgG-HRP与兔抗树駒IgG多克隆抗体结合，来 检测树駒IgG。⑤包被、封闭、兔抗树駒多抗结合、羊抗兔检测抗体结合、显色、终止等不同环节， 进行试剂浓度、反应时间优化，最终建立方法。
⑥从自有种群中选取30只健康树駒，尾静脉采血，EDTA抗凝获得血浆，用所建立 方法，进行血浆中IgG定量检测。上述三抗体夹心ELISA方法中酶标板为购自Coster公司的96孔单孔可拆式酶标 板，包被缓冲液为PH9. 6的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，样品稀释液为pH 7. 4的PBS缓冲液， 洗涤液为0. 05 %的PBST缓冲液，商品化的羊抗兔IgG-HRP购自博士德生物工程有限公司。本发明的积极效果在于以鼠抗树駒IgG单克隆抗体为捕获抗体，以兔抗树駒IgG 多克隆抗体为二抗与抗原树駒IgG结合，以商品化的羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，建立检测 树駒IgG的三抗体夹心ELISA方法。检测树駒IgG的三抗体夹心ELISA方法的建立及其应 用，为研究树駒抗体提供了有力的工具，为树駒作为人类相关疾病，尤其是人类病毒的实验 动物模型建立奠定了基础。
图1为树駒IgG浓度-OD45tl值曲线；横坐标为不同稀释浓度的标准品树駒IgG,纵 坐标为相应的OD45tl值。图2为树駒IgG浓度-OD45tl值标准曲线；横坐标为不同稀释浓度的标准品树鼠句 IgG,纵坐标为相应的OD45tl值。
具体实施例方式下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不此 来限定本发明。实施例1 下面本发明的三抗体夹心ELISA方法中使用的酶标板均为购自Coster公司的96 孔单孔可拆式酶标板，包被缓冲液为PH9. 6的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，样品稀释液为pH 7.4的PBS缓冲液，洗涤液为0. 05%的PBST缓冲液，商品化的羊抗兔IgG-HRP购自博士德 生物工程有限公司。三抗体夹心ELISA方法的建立1、方法1. 1、IgG标准曲线的建立含1/400鼠抗树駒IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100 μ 1/孔，37°C温 育2h，4°C过夜；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干； 2% BSA封闭，200 μ 1/孔，37°C温育2h ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去 洗涤液在吸水纸上拍干；加不同稀释浓度的标准品树駒IgG，将标准品树駒IgG稀释成浓 度为 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、 1· 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml, 0. 125 μ g/ml,0. 0625 μ g/ml,同时设阴性对照和空白 对照，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍 干；加1/2000兔抗树鼠句IgG多克隆抗体，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/ 孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C温 育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底 物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光温育15min ；加入2M H2SO4终止反应，100 μ 1/孔，用酶标仪测定OD45tl值。以不同稀释浓度的标准品树駒IgG含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘 制标准曲线，建立回归方程。1. 2、树駒血浆中IgG含量检测含1/400鼠抗树駒IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100 μ 1/孔，37°C温 育2h，4°C过夜；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干； 2% BSA封闭，200 μ 1/孔，37°C温育2h ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去 洗涤液在吸水纸上拍干；加1/5000待检树駒血浆，不同稀释浓度的标准品树駒IgG，将标 准品树鼠句 IgG 稀释成浓度为 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、 3· 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、l. 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/mU0. 125μ g/mU0. 0625 μ g/ml, 同时设阴性对照和空白对照，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃 去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/2000兔抗树駒IgG多克隆抗体，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ； PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊 抗兔，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min,弃去洗涤液在 吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光温育15min ；加入2M H2SO4终止反 应，100 μ 1/孔，用酶标仪测定OD45tl值。2、结果将标准品树駒IgG 稀释成浓度为 10. 0 μ g/ml、8· 0 μ g/ml、6· 0 μ g/ml、5. 0 μ g/ ml、4. 0μ g/ml>3. 0 μ g/ml>2. 0 μ g/ml、l. 0μ g/ml、0. 5μ g/mU0. 25 μ g/ml、0. 125 μ g/ml、 0. 0625 μ g/ml,重复检验三次，结果表明，其具有良好线性关系的检测区间为0. 25 μ g/ ml 3. 0 μ g/ml，标准曲线方程为 y = 0. 3674x_0. 0352 (R2 = 0. 9912)。选取30只健康树駒，尾静脉采血，EDTA抗凝获得血浆，用上述建立的方法进行抗 凝血浆的IgG含量检测。检测结果为树駒抗凝血浆的IgG含量水平为8. 6-17. 8g/L。
权利要求
树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法，包括以鼠抗树鼩IgG单克隆抗体为捕获抗体，以兔抗树鼩IgG多克隆抗体为二抗与抗原树鼩IgG结合，以羊抗兔IgG HRP为检测抗体，建立检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法包括将捕捉抗体即鼠抗树駒IgG 单克隆抗体包被与ELISA板上，100 μ 1/孔，37°C温育2h，4°C过夜；将检测样品和标准品与 固相化的捕捉抗体保温，使树駒IgG与捕捉抗体结合，37°C温育Ih ；使结合到固相化捕捉抗 体上的树駒IgG与二抗即兔抗树駒IgG多克隆抗体结合，37°C温育Ih ；加入检测抗体即羊 抗兔IgG-HRP与兔抗树駒IgG多克隆抗体结合，37°C温育lh，来检测树駒IgG。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于上述三抗体夹心ELISA方法中酶标板为 购自Coster公司的96孔单孔可拆式酶标板，包被缓冲液为pH9. 6的0. 05mol/L碳酸盐缓 冲液，样品稀释液为PH 7. 4的PBS缓冲液，洗涤液为0. 05%的PBST缓冲液，商品化的羊抗 兔IgG-HRP购自博士德生物工程有限公司。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于更具体的步骤为(1)IgG标准曲线的建立含1/400鼠抗树駒IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100 μ 1/孔，37 °C温 育2h，4°C过夜；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干； 2% BSA封闭，200 μ 1/孔，37°C温育2h ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去 洗涤液在吸水纸上拍干；加不同稀释浓度的标准品树駒IgG，将标准品树駒IgG稀释成浓 度为 10. 0μ g/ml、8. 0μ g/ml、6. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、4. 0μ g/ml、3. 0μ g/ml、2. 0μ g/ml、 1· 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml,0. 125 μ g/ml,0. 0625 μ g/ml ；同时设阴性对照和空白 对照，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍 干；加1/2000兔抗树鼠句IgG多克隆抗体，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/ 孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C温 育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底 物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光温育15min ；加入2M H2SO4终止反应，100 μ 1/孔，用酶标仪测 定OD45tl值；以不同稀释浓度的标准品树駒IgG含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制 标准曲线，建立回归方程；(2)树駒血浆中IgG含量检测含1/400鼠抗树駒IgG单克隆抗体腹水的包被液包被酶标板，100 μ 1/孔，37°C温育2h， 4°C过夜；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；2% BSA封 闭，200 μ 1/孔，37°C温育2h ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水 纸上拍干；加1/5000待检树駒血浆，不同稀释浓度的标准品树駒IgG，将标准品树駒IgG稀 释成浓度为 10. 0 μ g/ml,8. 0 μ g/ml,6. 0 μ g/ml,5. 0 μ g/ml,4. 0 μ g/ml,3. 0 μ g/ml,2. 0 μ g/ ml、l. 0μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 125 μ g/ml、0. 0625 μ g/ml，同时设阴性对照和空白 对照，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干； 加1/2000兔抗树鼠句IgG多克隆抗体，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ；PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每 次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加1/8000酶标羊抗兔，100 μ 1/孔，37°C温育Ih ； PBST洗涤3次，300 μ 1/孔，每次微震3min，弃去洗涤液在吸水纸上拍干；加入TMB底物溶液， 100μ 1/孔，37°C避光温育15min ；加入2M H2SO4终止反应，100 μ 1/孔，用酶标仪测定OD45tl值。
全文摘要
本发明公开一种树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法，并将其应用于检测树鼩血浆中总IgG含量。以鼠抗树鼩IgG单克隆抗体包被于酶标板作为捕获抗体，结合待检测树鼩IgG；进而用兔抗树鼩IgG多克隆抗体为二抗，以商品化的羊抗兔IgG-HRP为检测抗体，通过抗体浓度等多因素条件优化，建立检测树鼩IgG的三抗体夹心ELISA方法。所建立的方法应用于检测健康树鼩(30只)血浆IgG水平，发现树鼩血浆正常IgG水平为8.6-17.8g/L。树鼩IgG的三抗体夹心ELISA检测方法的建立，为树鼩作为人类疾病实验动物模型及相关疾病免疫机制的研究提供了必要工具。
文档编号G01N33/558GK101923093SQ20101022470
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者冯悦, 刘丽, 夏雪山, 杨恒, 温志刚, 魏大巧 申请人:昆明理工大学