专利名称：新型溶栓药物重组葡激酶抗体的制备和检测方法
技术领域：
本发明一种新型溶栓药物重组葡激酶抗体的制备和检测方法，属于生物医学的抗体制备和检测技术领域。
新型溶栓药物重组葡激酶是90年代诞生的一种新型生物技术治疗药物，是金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白质，它类似尿激酶(Uk)和链激酶(Sk)，具有溶血栓的特性。新型溶栓药物重组葡激酶是一种小分子蛋白，分子量约为1.5万，抗原性较弱；对于类似葡激酶这类肉眼不可见的微量的初级抗原、抗体反应，原理上应该通过标记技术，对免疫学反应进行放大从而测定其ng/ml水平级的含量。免疫标记技术有放射免疫测定，酶联免疫测定等方法。用常规免疫得到的葡激酶抗体效价低，即使从荷兰购进的葡激酶抗血清其双扩效价也仅有1∶2左右，双扩散效价达不到建立酶联免疫法的临界条件，因此不能用酶联免疫法检测新型溶栓药物重组葡激酶在血液中的含量，因而采用放射标记技术的放射免疫测定法测定葡激酶的含量。但放射免疫法存在如下缺点(1)由于用同位素标记的新型溶栓药物重组葡激酶容易出现衰退和降解，因而不能准确地测定血样中的新型溶栓药物重组葡激酶含量；(2)采用放射免疫法需要特殊的测定仪器，成本高；(3)存在标记物容易衰退，检测准确性差；(4)存在辐射危害等。
本发明的目的在于避免上述已有技术的不足而提供一种血清效价高、成本低、无辐射危害、检测精度高、无标记物衰退的新型溶栓药物重组葡激酶免疫血清的制备及利用该血清检测新型溶栓药物重组葡激酶的方法。通过对低抗原性新型溶栓药物重组葡激酶进行化学修饰，增大新型溶栓药物重组葡激酶的分子量，提高新型溶栓药物重组葡激酶的抗原性；采用多点注射法、淋巴结内注射法和足背预免疫免疫动物，刺激了免疫动物的抗体产生得到高效价的血清；经纯化抗体血清，进一步提高抗体的效价，从而建立酶联免疫法来检测新型溶栓药物重组葡激酶的含量。
本发明可以通过以下技术方案来实现新型溶栓药物重组葡激酶抗体的制备及利用该抗体检测新型溶栓药物重组葡激酶的方法是通过标记技术，对免疫学反应进行放大从而检测其新型溶栓药物重组葡激酶的含量，具体步骤是取等量的新型溶栓药物重组葡激酶纯品和牛血清分别用0.2-3倍醋酸盐缓冲液溶解；在牛血清溶解液中滴加浓度为10％-40％的交联剂至交联剂占总量的0.5％-5％，搅拌10-50分钟，加入透析袋，牛血清溶液浓缩至原体积的1/3以下，然后再加入新型溶栓药物重组葡激酶溶解液混合，在2～10℃搅拌12小时以上，制成牛血清球蛋白交联物；在牛血清球蛋白交联物中加入福氏完全佐剂充分乳化成油包水乳剂，采用多点注射法或淋巴结内注射法或足背预免疫家兔1次以上，每兔每次给药0.8～3mg，并静脉采血确定效价。双扩散效价达1∶16以上时，心脏放血分离血清，制取高效价的免疫血清；用平衡液平衡蛋白柱G，抽取家兔免疫血清加入蛋白柱G内，使血清在柱中停留作用5分钟以上，再以平衡缓冲液流洗20分钟以上，然后以洗脱液甘氨酸洗脱免疫球蛋白IgG，以0.1molNaOH碱性溶液中和至中性，得到纯化的IgG。
采用碘酸钠法标记免疫球蛋白IgG制成酶标抗体，以纯化的免疫球蛋白IgG包被酶标抗体，洗板后加被检血样，在37℃-45℃孵育60-120分钟，洗板，加酶标抗体在同样的温度和时间范围再孵育，洗板，加底物二氨基联苯显色，从而测定被检血样中新型溶栓药物重组葡激酶含量。
本发明还可以通过以下技术方案来实现新型溶栓药物重组葡激酶免疫血清的制备及利用该血清检测新型溶栓药物重组葡激酶的方法中醋酸盐缓冲液PH值为3～5，交联剂为戊二醛；多点注射为多点肌肉注射、多点皮内注射、多点皮下注射；多点注射的总注射点至少为8个点；每个注射点的新型溶栓药物重组葡激酶注射量为0.1～0.2mg。蛋白柱G用0.05mol/LPH7.2PB的平衡液平衡，血清在柱中的停留时间为10分钟；洗脱液为盐酸---甘氨酸，碱性溶液为0.1mol/NaOH；被检血样为血清或血浆，酶标抗体以生理盐水稀释，浓度为1∶50较好；其中底物为二氨基联苯氨。
本发明与已有技术相比具有如下优点采用牛血清与纯品新型溶栓药物重组葡激酶交联，加福氏完全佐剂充分乳化，对低抗原性新型溶栓药物重组葡激酶进行化学修饰，增大了新型溶栓药物重组葡激酶的分子量，提高了新型溶栓药物重组葡激酶的抗原性；采用多点注射法、淋巴结内注射法和足背预免疫免疫动物，刺激了免疫动物的抗体产生。所得抗体血清经纯化，可达到建立酶联免疫测定技术要求的条件。由于本发明的双抗体夹心酶联免疫吸附法中的抗原与抗体一一对应，对新型溶栓药物重组葡激酶的特异性好，对葡激酶在血清中产生的肉眼不可见的微量的初级抗原、抗体采用标记技术，对免疫学反应起到放大作用，实现酶联免疫法测定葡激酶含量，使其精确度达到ng/ml或pg/ml水平。
本发明建立并采用双抗夹心ELISA法来检测r-SAK，借助于特异性抗体的制备以保证方法的特异性，借助于酶的放大作用以保证方法的敏感性，并且检测时不需要特殊的测定仪器，成本低，不存在标记物容易衰退、辐射危害缺点，检测精度高。
将上述交联物加福氏佐剂充分乳化成油包水乳剂，采用多点肌肉注射法或多点皮内或多点皮下或足背预免疫或腋窝淋巴结注射等方法免疫家兔，剂量为每个点注射0.1mg新型溶栓药物重组葡激酶，总注射点不少于8个点，10天和一个月后加强免疫一次，即可制备出高效价的新型溶栓药物重组葡激酶免疫血清。
为进一步提高其效价，则进行新型溶栓药物重组葡激酶抗体的纯化即提取新型溶栓药物重组葡激酶IgG。取蛋白G柱一支，以0.05mol/L、PH7.2PB平衡，将2ml抗血清加于柱上，待血清流入柱中后，关闭流出口，使血清在柱中作用10分钟，打开流出口，以平衡缓冲流冼，至蛋白流尽后再冼20分钟(流速为1ml/min)。以盐酸--甘氨酸缓冲液(0.05mol/L、PH2.8)洗脱IgG，并立即以0.1mol/LNaOH中和至中性即可得到纯化的IgG。
采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶于纯化的IgG上，制成酶标抗体，另以纯化的IgG包被酶标板，洗涤后加含新型溶栓药物重组葡激酶的被测血样(血清或血浆等)孵育，洗板，然后加酶标抗体孵育，洗板，加底物显色，颜色深浅与被测血样中新型溶栓药物重组葡激酶量成正相关。采用上述双夹心酶联免疫吸附法检测正常人静脉给予10mg新型溶栓药物重组葡激酶的血药浓度，得Vc为4.45±1.62L,AUC0-270为89935±13228min.ng/ml,CL为6.30±1.05L/h,T1/2a为13.30±2.06min，T1/2β为67.94±21.39min。其中AUC0-270为血药浓度-时间下曲线面积；Vc为中心分布容积；CL为药物总清除率；T1/2a为分布相半衰期；T1/2β为清除相半衰期。
经棋盘滴定，上述检测操作中，IgG的浓度以20mg为佳，酶标抗体的浓度用生理盐水以1∶50稀释为好。
如
图1所示，为抗r-SAK血清效价测定及特异性分析。在凝固的厚度为1.5～2mm、1.5％的琼脂板上打孔，孔径3mm，孔距4～5mm。测定抗血清效价时，中央孔加1μg的新型溶栓药物重组葡激酶，周围各孔分别加不同稀释度的兔抗新型溶栓药物重组葡激酶血清10μ1,37℃湿盒中扩散24小时，以出现沉淀线的最高稀释度为该抗血清的效价。结果所制兔抗新型溶栓药物重组葡激酶抗体血清效价达1∶16。
如图2所示，抗r-SAK血清效价特异性分析。在凝固的厚度为1.5～2mm、1.5％的琼脂板上打孔，孔径3mm，孔距4～5mm。中央孔加原倍的抗血清10μl，周围各孔加新型溶栓药物重组葡激酶、人血浆、小牛血清等，沉淀线只出现在中央孔与新型溶栓药物重组葡激酶孔之间为合格。结果所制兔抗新型溶栓药物重组葡激酶抗体血清仅与r-SAK之间有沉淀线，与人血浆、小牛血清等之间无交叉反应。
取蛋白G柱一支(pharmacia产品，批号243395)以0.05mol/L,PH7.2PB平衡，将2ml抗血清加于柱上，待血清流入柱中后关闭流出口使血清在柱中作用10min，打开流出口，平方公里平衡缓冲液流冼，至蛋白流尽后再冼20min，流速约为1ml/min。以0.05mol/L,PH2.8的盐酸--甘氨酸缓冲液冼脱IgG，并立即以0.1mol/LNaOH中和至中性。于280nm处比色，根据公式IgG浓度(mg/ml)=0.62A1cm280cm，计算IgG的浓度。
采用过碘酸钠法标记新型溶栓药物重组葡激酶免疫球蛋白IgG制成辣根过氧化物酶标。
检测程序是将一定量的新型溶栓药物重组葡激酶免疫球蛋白IgG溶于PH9.6,0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，加入到酶标反应板(Nunc-Immuno Module，批号038891，丹麦产品)各孔中，每孔100μl,4℃包被13小时，然后以0.02mol/L,PH7.4,Tween20酶标洗涤液常规洗板三次。加入适当稀释的标准品或被测血浆。每孔100μl，混匀，37℃2小时，取出洗板三次。各孔加底物溶液(即8mg邻苯二胺加入10mlPH5.0柠檬酸磷酸盐缓冲液中，再加3％H2O2,0.05ml，临用时配制)100μl,37℃30min，每孔加2mol/L H2SO4一滴中止反应，于492nm比色(CliniBio128C,Ansfra生产)。根据检测孔的吸光度查标准曲线即得相应的新型溶栓药物重组葡激酶含量。
检测最佳条件的选择，采用棋盘滴定法选择包被抗体和酶标抗体的浓度，试验结果显示包被抗体的浓度以20μg/ml为好，酶标抗体用生理盐水以1∶50稀释为好。
实施例3标准曲线的制备将r-SAK标准品(20μg/支，1000活性单位，批号97卫生参字01号)复溶后，以正常从枸橼酸抗凝血浆稀释成50、100、200、400、800、1200、1600、和2000ng/ml不同浓度，与被检血浆标本同样以酶标稀释液(含15％小牛血清的酶标洗涤液)1∶20稀释，加入到已包被的酶标板孔中，按上述实施例3检测程序操作，每一稀释度均做复孔，取吸光度均值(Y)对浓度(X)作回归曲线。当待测标本中r-SAK浓度低于50ng/ml时，另作一标准曲线，标准品浓度取10、20、30、40、50ng/ml，与血浆标本同时1∶4稀释后按上述程序操作并绘制曲线。
权利要求
1．新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，通过标记技术，对免疫学反应进行放大从而测定其葡激酶含量，其特征在于新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测采用----取等量的重组药物葡激酶纯品和牛血清分别用0.2-3倍醋酸盐缓冲液溶解；在牛血清溶解液中滴加浓度为10％-40％的交联剂至交联剂占总量的0.5％-5％，搅拌10-50分钟，加入透析袋，牛血清溶液浓缩至原体积的1/3以下，然后再加入重组药物葡激酶溶解液混合，在2-10摄氏度搅拌12小时以上，制成牛血清球蛋白交联物；----在牛血清球蛋白交联物中加入福氏完全佐剂充分乳化成油包水乳剂，采用多点注射法或淋巴结内注射法或足背预免疫家兔1次以上，每兔每次给药0.8～3mg，制取高效价的免疫血清；----用平衡液平衡蛋白柱，抽取家兔免疫血清加入蛋白柱内，使血清在柱中停留作用5分钟以上，再以平衡缓冲液流洗20分钟以上，然后以洗脱液洗脱免疫球蛋白IgG，以碱性溶液中和至中性，得到纯化的IgG。----采用碘酸钠法标记免疫球蛋白IgG制成酶标抗体，以纯化的免疫球蛋白IgG包被酶标抗体，洗板后加被检血样在37-45℃孵育60-120分钟，洗板，加酶标抗体再同样孵育，洗板，加底物显色，从而测定被检血样中重组药物葡激酶含量。
2．如权利要求1所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于醋酸盐缓冲液PH值为3～5。
3．如权利要求1所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于交联剂为戊二醛；
4．如权利要求1所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于多点注射为多点肌肉注射、多点皮内注射、多点皮下注射。
5．如权利要求4所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于所述的多点注射的总注射点至少为8个点；
6．如权利要求4或5所述的新型溶栓药物重组葡激酶免疫血清的制备及利用该血清检测重组药物葡激酶的方法，其特征在于所述的每个注射点的重组药物葡激酶注射量为0.1～0.2mg。
7．如权利要求1所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于所述蛋白柱用0.05mol/LPH7.2PB的平衡液平衡，血清在柱中的停留时间为10分钟；
8．如权利要求1所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于所述洗脱液为盐酸---甘氨酸，碱性溶液为0.1mol/NaOH。
9．如权利要求1所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于酶标抗体的浓度为1∶50稀释为好。
10．如权利要求1所述的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征在于所述的底物为二氨基联苯氨。
全文摘要
本发明的新型溶栓药物重组葡激酶的抗体制备和检测方法，其特征是将重组药物葡激酶纯品和牛血清球蛋白交联，加福氏佐剂充分乳化，制成油包水乳剂。将该乳剂采用多点肌肉和淋巴结内注射法免疫家兔。以蛋白G柱纯化免疫球蛋白IgG部分，碘酸钠法标记免疫球蛋白IgG制成酶标抗体，再以免疫球蛋白IgG包被酶标抗体，洗板后加被检血样孵育，洗板，加酶标抗体孵育，洗板，加底物显色，从而测定被检血样中葡激酶含量。
文档编号C07K16/18GK1316438SQ0011282
公开日2001年10月10日 申请日期2000年4月5日 优先权日2000年4月5日
发明者童明庆, 王世鹏, 佟彬 申请人:成都金鹏生物技术有限公司, 南京医科大学第一附属医院