重组抗－cd40抗体及其应用的制作方法

专利名称：重组抗－cd40抗体及其应用的制作方法
1.发明领域本发明涉及治疗包括癌症、炎性疾病和免疫系统疾病或紊乱在内的疾病的方法和组合物，包括给予增强CD40配体与CD40结合的CD40结合蛋白。CD40结合蛋白包括重组/变异形式的单克隆抗体S2C6及其衍生物。
2.发明背景CD40是一种在各种细胞类型上表达的细胞表面磷酸化糖蛋白，所述细胞类型包括B细胞、B细胞恶性肿瘤、小结树突细胞、上皮基细胞和癌。CD40结合CD40配体(“CD40L”)。在炎症和癌症过程中，CD40L于活化T细胞上表达(Younes等，1998，Br.J.Haematol.100135-141；参见Grewal和Flavell，1998，Annu.Rev.Immunol.16111-135的论述)。CD40与CD40L的相互作用导致B细胞激活和正常B细胞的增殖；然而在B细胞衍生的肿瘤系中CD40介导的信号转导可以导致激活-诱导的细胞死亡。活化信号的强度是激活-诱导的肿瘤细胞死亡的关键(Grafton等，1997，Cell.Immunol.18245-56)。因此，用于增强CD40和CD40L之间的受体-配体相互作用以及活化信号强度的组合物和方法对于治疗疾病应当具有巨大的价值。
2.1 CD40和CD40配体CD40是TNF受体超家族的一员。该家族包括TNFrII、CD40、CD30、LMP-1、LTBr、ATAR、OX-40和4-1BB受体。CD40组成型表达于B-淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞上，并由在成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞上活化的细胞因子诱导(Van Kooten和Banchereau，1997，Curr.Opin.Immunol.，9330-337)。还已经表明，CD40高度表达于许多人类癌症，包括肺癌、膀胱癌、胃癌、乳癌和卵巢癌(Stamenkovic等，1989，EMBO J.81403-1410)。
CD40配体是一种在活化T细胞上表达的膜蛋白。受体结合CD40L导致CD40多聚化，产生活化信号(对于抗原提呈(presenting)细胞如树突细胞、单核细胞和B细胞)和生长与分化信号(对于细胞因子活化的成纤维细胞和上皮细胞)。CD40信号由多聚化受体经一系列TNF受体相关因子(“TRAF”)的募集而转导(Kehry，1996，J.Immunol.1562345-2348)。TRAF的各种亚型与TNF家族成员(包括CD40)的相互作用各有不同，以使向种类繁多的下游途径提供刺激物。TRAF1和TRAF2参与编程性细胞死亡的调节(Speiser等，1997，J.Exp.Med.1851777-1783；Yeh等，1997，Immunity，7715-725)。TRAF 2、5和6参与增殖和活化过程，包括NF-κB和c-Jun N末端激酶活化。在正常B细胞中，CD40的结合为受体复合物募集TRAF2和TRAF3，并诱导其它TRAF的下调(Kuhune等，1997，J.Exp.Med.186337-342)。CD40结合的作用还取决于膜密度(De Paoli等，1997，Cytometry3033-38)。重要的是，与在正常原始B细胞观察到的增殖反应不同，在肿瘤B细胞上的CD40结合可以导致生长抑制和活化-诱导的细胞死亡(Funakoshi等，1994，Blood 832787-2794)。因此，在不同细胞类型中的CD40的活化、转化、残余TRAF和共刺激物可以诱导由活化和增殖至生长抑制和编程性细胞死亡的反应。
2.2抗CD40抗体除至少一个类型外，至今描述的抗CD40单克隆抗体(“mAb”)有三个基本类型(1)以至少90％封闭CD40/CD40L的相互作用并具有抗瘤特性的抗CD40单克隆抗体(Armitage等，美国专利第5,674,492号；Fanslow等，1995，Leukocyte Typing V，Schlossman等编辑，1555-556)；(2)通过CD40对抗信号转导的抗CD40单克隆抗体(deBoer等，美国专利第5,677,165号)；和(3)通过CD40传递刺激信号但不增加CD40和CD40L之间的相互作用的抗CD40单克隆抗体，例如G28-5(Ledbetter等，美国专利第5,182,368号；PCT说明书WO 96/18413)。
已表明，一种单克隆抗体CD40.4(5C3)(PharMingen，San Diego，Calfornia)使CD40和CD40L之间的相互作用增加约30-40％(Schlossman等编辑，1995，Leukocyte Typing V白细胞分化抗原1547-556)。
Armitage等(美国专利第5,674,492号)介绍了使用CD40结合蛋白(包括单克隆抗体HuCD40-M2)的方法，它们能够结合CD40并抑制CD40与CD40L的结合，以预防或治疗特征为肿瘤细胞表达CD40的疾病。
DeBoer等(美国专利第5,677,165号)描述了抗CD40单克隆抗体，它没有明显的拮抗活性，结合B细胞表面上的CD40并阻断B细胞活化。美国专利第5,677,165号的基本特征在于当抗CD40单克隆抗体结合正常人B细胞表面上的人CD40时，正常人B细胞的生长或分化受到抑制。
Ledbetter等(美国专利第5,182,368号)描述了一种配体G28-5，它结合B细胞表面抗原Bp50(现称为CD40)并刺激活化的B细胞阻碍细胞周期，使得B细胞增殖扩大。然而，G28-5在CD40L存在下没有增强B细胞的活化，也没有加强CD40/CD40L的相互作用。
S2C6是一种制备用于抵抗人膀胱癌的抗CD40单克隆抗体(Paulie等，1984，Cancer Immunol.Immunother.17165-179)。S2C6结合在各种细胞类型上表达的CD40受体，包括B-淋巴细胞、内皮细胞和上皮细胞。已经证明S2C6对尿路上皮癌和B细胞衍生的恶性淋巴细胞具有特异性。还已经证明S2C6与前列腺癌细胞系HS具有反应性，以及与黑素瘤具有弱反应性(Paulie等，1984，Cancer Immunol.Immunother.17165-179)。已有研究证实S2C6作为B细胞恶性肿瘤诊断标记的用途(Paulie等，1984，Cancer Immunol.Immunother.17165-179；Paulie等，1985，Eur.J.Cancer.Clin.Oncol.21701-710)。除了检测B细胞恶性肿瘤以外，还已经显示S2C6向B淋巴细胞传递强生长促进信号(Paulie等，1989，J.Immunol.142590-595)。
S2C6能以剂量依赖方式刺激原代B细胞增殖，由此证明S2C6对人外周B细胞具有激动活性(Paulie等，1989，J.Immunol.142590-595)。
尽管竞争性研究已经显示G28-5和S2C6结合相同或最接近的表位，但经测定所述抗体的功能不同，这主要是依据所述的单克隆抗体之一所达到的对先前受刺激的扁桃体B细胞的刺激程度(Clark和Ledbetter，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494-4498；Ledbetter等，美国专利第5,182,368号)。在具体的测试条件下，实现扁桃体B细胞活化需要的S2C6比G28-5多100倍(Ledbetter等，美国专利第5,182,368号)。
本领域需要一种治疗方法，以增加治疗或预防癌症、激活或加强免疫系统或治疗或预防免疫缺陷或疾病的功效，而本发明提供这种需要。
本文引用或有关联的任一参考文献不应被视为允许该参考文献作为本发明的先有技术。
3.发明概述申请人获得的出乎意料的发现是一类新的抗CD40抗体，即除了传递刺激信号以外，还增强CD40和CD40L之间的相互作用、增强CD40L介导的刺激和具有体内抗瘤活性。本发明人对S2C6单克隆抗体可变区的克隆和测序以及其中CDR区和构架区的鉴定，促进了这些抗体和其相关分子的产生和应用。
本发明涉及的分子包含S2C6单克隆抗体的可变区或一个或多个具有新序列(SEQ ID NO3、4、8、9或10)的其互补性决定区(CDR)，所述分子(a)免疫特异性地结合CD40和(b)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入，或不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。在一个具体的实施方案中，所述分子不是天然单克隆抗体S2C6，且不含有所述单克隆抗体S2C6的天然重链或轻链。在另一个具体的实施方案中，所述分子是一种抗体。在另一个实施方案中，所述抗体不是同种型IgG1。在另一个具体的实施方案中，所述分子含有轻链可变区(SEQ ID NO2的氨基酸序列)或重链可变区(SEQ ID NO7的氨基酸序列)。
本发明还涉及包含融合至第二种蛋白的氨基酸序列的单克隆抗体S2C6的片段的嵌合/融合蛋白，以及涉及其中单克隆抗体S2C6的片段共价结合(例如通过使用交联剂)至另一种化学结构的分子。在一个具体的实施方案中，提供一种免疫特异性地结合CD40的分子，该分子含有单克隆抗体S2C6的重链和/或轻链可变区，它们融合至含有bryodin 1(BD1)的氨基酸序列的第二种蛋白。
本发明还涉及其含有的氨基酸序列与SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10具有至少95％的同一性的蛋白，所述蛋白(a)免疫特异性地结合CD40和(b)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。在一个具体的实施方案中，所述蛋白不是天然单克隆抗体S2C6，且不含有所述单克隆抗体S2C6的天然重链或轻链。
本发明还涉及纯化蛋白，所述蛋白(a)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(b)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(c)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入，或不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。在一个具体的实施方案中，所述蛋白不是天然单克隆抗体S2C6，且不含有所述单克隆抗体S2C6的天然重链或轻链。
本发明还涉及编码所述分子和蛋白的核酸或与包括编码核苷酸序列的所述蛋白的DNA杂交的核酸；包含所述分子和蛋白的重组细胞；以及生产所述蛋白的方法。
在一个实施方案中，所述分离的核酸包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白含有(a)由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6的重链可变区，和(b)人恒定区。
在一个实施方案中，所述分离的核酸包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白含有(a)由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6的轻链可变区，和(b)人恒定区。
本发明还涉及包含重组核酸载体的重组细胞，该载体含有编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，并使CD40配体与CD40的结合增加至少45％。本发明还提供生产所述蛋白的方法，包括培养所述细胞，使得所述蛋白由所述细胞表达，并回收所表达的蛋白。
本发明还涉及含有重组核酸载体的重组细胞，所述载体包含SEQID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQID NO13、SEQ ID NO14或SEQ ID NO15，以及涉及生产蛋白的方法，包括培养所述细胞，使得由所述核苷酸序列编码的蛋白由所述细胞表达，并回收所表达的蛋白。
还提供优选为纯化形式的包含本发明分子和抗体的药用组合物。在具体的实施方案中，本发明涉及含有一种分子和一种药学上可接受的载体的药用组合物，所述分子含有SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，该分子(i)免疫特异性地结合CD40，(ii)增加CD40配体与CD40的结合，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。在一个具体的实施方案中，所述分子不是天然单克隆抗体S2C6，且不含有所述单克隆抗体S2C6的天然重链或轻链。
本发明还涉及包含一种纯化蛋白和一种药学上可接受的载体的药用组合物，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入，或不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。在一个具体的实施方案中，所述蛋白不是天然单克隆抗体S2C6，且不含有所述单克隆抗体S2C6的天然重链或轻链。
在具体的实施方案中，本发明的药用组合物包含本发明的分子或抗体，其量可有效治疗或预防癌症，或可有效激活或增强免疫应答，或活化或增强患者的免疫应答。
在具体的实施方案中，本发明的药用组合物还包含CD40配体。在一个具体的实施方案中，所述药用组合物包含(a)一种分子，它免疫特异性地结合CD40，增加CD40配体与CD40的结合；(b)CD40配体；和(c)一种药学上可接受的载体，它们的量可有效治疗或预防癌症或免疫疾病，或可有效激活或增强免疫应答。在此实施方案中，例如，所述分子可以是天然单克隆抗体S2C6或天然单克隆抗体5C3或如本文所述的S2C6衍生物。
本发明还涉及在患者中治疗或预防癌症的方法，在患者中激活或增强免疫应答的方法或在患者中治疗或预防免疫缺陷或疾病的方法，包括给予所述患者治疗有效量的本发明的分子或抗体，例如一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的分子，所述分子(i)免疫特异性地结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，并且与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。在一个具体的实施方案中，所述分子不是天然单克隆抗体S2C6，且不含有所述单克隆抗体S2C6的天然重链或轻链。
本发明还涉及在患者中治疗或预防癌症的方法，在患者中激活或增强免疫应答的方法或在患者中治疗或预防免疫缺陷或疾病的方法，包括给予所述患者一种纯化的蛋白，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入，或不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。在一个具体的实施方案中，所述蛋白不是天然单克隆抗体S2C6，且不含有所述单克隆抗体S2C6的天然重链或轻链。
在具体的实施方案中，本发明的方法还包括给予所述患者CD40配体。
本发明还涉及在患者中治疗或预防癌症或免疫疾病的方法，包括给予所述患者其量可有效用于所述治疗或预防的下述物质(a)一种分子，它免疫特异性地结合CD40，该分子增强CD40配体与CD40的结合；和(b)CD40配体，其中所述分子可以是天然单克隆抗体S2C6或天然单克隆抗体5C3或如本文所述的任一种S2C6衍生物。
在一个优选的实施方案中，所述患者为人。
本发明还涉及人类以外的转基因动物、转基因植物或含有一种或多种编码蛋白的转基因的分离细胞，所述蛋白与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，并且所述蛋白使CD40配体与CD40的结合增加至少45％。
4.附图简述

图1.S2C6的轻链可变区结构。显示了所述轻链可变区(“VL”)的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图2 S2C6的重链可变区结构。显示了所述重链可变区(“VH”)的核苷酸序列(SEQ ID NO6)和氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
图3A-3B.S2C6的可变区结构。(A)显示了S2C6 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。(B)显示了S2C6 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO7)。下划线标示互补性决定区(“CDR”)。显示了邻接CDR的四个构架区的序列。VLCDR 1-3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NOS3-5。VHCDR 1-3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NOS8-10。
图4.S2C6单克隆抗体增强CD40-Ig与表达CD40L的Jurkat T细胞的结合。在增加浓度的抗-CD40单克隆抗体(“mAb”)存在下，CD40-Ig(CD40和人免疫球蛋白的可溶性融合蛋白)结合表面CD40L。单克隆抗体与CD40-Ig预温育1小时，接着与表达CD40L的靶细胞温育1小时。使用异硫氰酸荧光素(“FITC”)标记的抗人Ig利用流式细胞仪检测结合靶细胞的CD40-Ig。然后根据对数平均荧光强度(“MFI”)测定CD40/CD40L结合的程度。显示了减去每组背景值的MFI。
图5.S2C6单克隆抗体增强可溶性CD40L与B细胞表面CD40的结合。在增加浓度的抗-CD40单克隆抗体S2C6、G28-5或M3或者无关对照单克隆抗体，EXA-1H8存在下，温育Ramos B细胞、人B细胞淋巴瘤。将所述单克隆抗体与表达CD40的靶细胞预温育1小时。接着通过流式细胞仪直接检测FITC标记的CD40L与B细胞的结合。然后根据对数平均荧光强度测定CD40/CD40L结合的程度。显示了减去每组背景值的MFI。
图6.在CD40L+刺激细胞和抗-CD40单克隆抗体存在下，S2C6增强原代人外周B细胞的增殖反应。将外周B细胞(1×105/孔)与增加数目的非增殖性CD40L+Jurkat T刺激细胞和30 ng/ml的抗-CD40单克隆抗体S2C6、G28-5或M3或对照单克隆抗体EXA2-1H8混合在一起。通过在加入刺激物后72小时掺入3H-TdR检测B细胞增殖。
图7.在CD40L存在或不存在时，对比原代人外周B细胞对抗-CD40单克隆抗体的增殖反应。将外周B细胞与4∶1混合比率的非增殖性CD40L+刺激细胞和增加浓度的抗-CD40单克隆抗体S2C6、G28-5或对照抗体，EXA2-1H8混合在一起。通过在加入刺激物后72小时掺入3H-TdR检测B细胞增殖。
图8A-8C.单克隆抗体S2C6的体内抗瘤活性。评价S2C6抗(A)Ramos人B细胞非Hodgkin淋巴瘤，(B)HS Sultan多发性骨髓瘤，或(C)IM-9多发性骨髓瘤的抗瘤活性。用或不用抗-脱唾液酸-GM1预处理SCID小鼠(5只/组)，以抑制天然杀伤细胞(“NK”)活性，并在注射1×106-2×106肿瘤细胞后的第1天或第5天用单克隆抗体处理所述小鼠。实线表示随时间的存活小鼠数目。
图9.BD1-S2C6 sFv在ELISA中特异性结合固定化CD40-Ig。BD1-S2C6 sFv(由融合至单克隆抗体S2C6可变区的bryodin 1(BD1)组成的单链抗-CD40免疫毒素)在大肠杆菌中作为包含体表达，使其变性和重折叠。然后使用Blue Sepharose分离重折叠的蛋白，接着经固定化CD40-Ig亲和性层析。然后测试纯化蛋白在ELISA中结合固定化CD40-Ig的情况。用0.5μg/ml的CD40-Ig包被微量滴定板，接着在25μg/ml S2C6单克隆抗体(▲)、25μg/ml对照抗体BR96(●)或无过量抗体(■)存在下，加入纯化BD1-S2C6 sFv的稀释液。通过加入BD1特异性兔抗血清，接着加入缀合山羊抗兔Ig的辣根过氧化物酶，检测BD1-S2C6 sFv与固定化受体的结合。加入过量S2C6单克隆抗体完全抑制BD1-S2C6 sFv与CD40-Ig的结合，但加入对照单克隆抗体不能完全抑制此种结合。
5.发明详述本发明涉及S2C6基因的核苷酸序列及其编码蛋白。本发明还涉及所述S2C6蛋白和核酸的片段以及其它衍生物和类似物。在各种具体的实施方案中，本发明的分子(例如抗体)包含全部或部分的S2C6单克隆抗体(轻链和/或重链，或轻链CDR 1(SEQ ID NO3)，和/或轻链CDR 2(SEQ ID NO4)，和/或重链CDR 1(SEQ ID NO8)、重链CDR 2(SEQ ID NO9)和/或重链CDR 3(SEQ ID NO10)，或轻链CDR 3(SEQ ID NO5)与任何其它CDR和/或四条重链构架区和四条轻链构架区中的一个或多个的组合)，前提是所述分子不是天然单克隆抗体S2C6(保藏于ATCC，获得的保藏号微PTA-110)或其重链或轻链。所述分子与S2C6在序列和/或翻译后修饰(糖基化、酰胺化、肽键合或交联至非S2C6序列等)方面可以不同。在各种具体实施方案中，本发明的分子免疫特异性地结合CD40(或在多聚化时免疫特异性地结合CD40)、与天然S2C6竞争结合CD40，和/或使CD40配体与CD40的结合增加至少45％、50％、60％或65％。编码所述分子(例如S2C6片段或其衍生物)的核酸以及编码天然单克隆抗体S2C6的核酸也属于本发明的范围。提供例如通过重组方法来生产前述蛋白。
本发明还涉及S2C6蛋白及其衍生物，包括但不限于具有功能活性的融合/嵌合蛋白，即其能够显示一种或多种已知与全长S2C6单克隆抗体相关的功能活性。这样的功能活性包括但不限于结合CD40的能力、刺激信号至CD40信号转导途径的传递(例如便于引起B细胞增殖)、CD40L与CD40相互作用的加强；抑制肿瘤生长的能力；以及诱导免疫应答的能力。
另外提供抗CD40的抗体，包括S2C6、其衍生物和类似物，包括但不限于人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体和结合化疗剂或生物反应调节剂的抗体。
本发明还涉及治疗或预防癌症、炎性疾病和免疫系统疾病的方法，包括单独或与CD40L联合给予本发明组合物。
通过下文6-9部分阐明的实施例说明本发明，所述实施例特别公开了S2C6基因的克隆和鉴定特征；CD40/CD40L的相互作用的增强；肿瘤生长的抑制；以及单链抗-CD40免疫毒素与CD40-Ig的结合。
为了使公开内容更清晰明嘹而不是起限制作用，本发明的详述被分成以下的小单元。
5.1分离S2C6基因本发明涉及S2C6核酸的核苷酸序列。在具体的实施方案中，S2C6核酸包括SEQ ID NO1和6的cDNA序列，或编码S2C6蛋白的核酸(例如具有SEQ ID NO2和7的序列的蛋白)。本发明提供的纯化核酸由S2C6基因序列的至少8个核苷酸(即可杂交部分)组成；在其它实施方案中，所述核酸由S2C6序列的至少25个(连续)核苷酸、50个核苷酸、100或200个核苷酸或全长S2C6可变区编码序列组成。在相同的或其它实施方案中，所述核酸的长度小于50、75、100或200或5000个核苷酸长度。核酸可以是单链或双链。本发明还涉及与前述序列或其反向互补物杂交或互补的核酸，具体而言，这种编码结合于CD40的蛋白的核酸与S2C6竞争结合CD40，和/或使CD40配体与CD40的结合增加至少45％、50％、60％或65％。在具体方面，提供包含与至少10、25、50、100或200个核苷酸或S2C6可变区基因的完整编码区互补的序列的核酸。
另外提供编码S2C6蛋白的衍生物和类似物的核酸。显而易见，本文使用的“编码S2C6蛋白的片段或部分的核酸”应被解释为是指仅编码所提及的S2C6蛋白的片段或部分的核酸，而不是编码为连续序列的S2C6蛋白的其它邻接部分的核酸。
5.2克隆步骤以下为克隆S2C6基因的具体实施方案。在一个具体的实施方案中，由产生单克隆抗体S2C6的杂交瘤分离总RNA，并使用基于本文公开序列的引物，用聚合酶链式反应扩增所需的可变区序列。参见作为说明性实施例的下文6单元。至于另一个实施例，由产生单克隆抗体S2C6的杂交瘤分离mRNA，制备cDNA并将其连接至表达载体(例如噬菌体衍生物)，使得其能够由宿主细胞表达，从而将其导入所述宿主细胞中。然后可以用各种筛选测定法选择表达产物。在一个实施方案中，选择是基于与代表一部分S2C6基因或其RNA或其片段的标记探针的杂交(Benton和Davis，1977，Science 196180；Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961)。这些具有与探针大致同源性的DNA片段将与探针杂交。还可能通过限制酶消化来鉴定合适的片段，并按照已知的限制图谱(如果可以获得的话)比较其与预期片段的片段大小。可以根据所述基因的特性进行进一步的选择。
或者，通过基于所需基因表达产物的物理、化学或免疫学特性的测定，可以检测所需基因的存在。例如，可以选择并表达cDNA克隆或杂种选择合适mRNA的DNA克隆，以产生具有例如类似或等同于已知的S2C6蛋白的电泳迁移、等电聚焦特性、蛋白水解的消化图谱或功能活性的蛋白。例如，可在ELISA(酶联免疫吸附测定)-型方法中检测结合CD40的能力。
还可以通过使用核酸杂交的mRNA选择，接着通过体外翻译，鉴定S2C6基因。在此方法中，使用片段通过杂交分离互补性mRNA。分离mRNA的分离产物的体外翻译产物的功能测定(例如结合CD40等)鉴定所述mRNA，因此所述互补性DNA片段包含所需的序列。
在另一个实施方案中，可以由本文公开的序列化学合成S2C6cDNA。可以使用技术人员已知的其它分离S2C6基因的方法。
然后可以将所鉴定和分离的S2C6基因/cDNA插入到合适的克隆载体中。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可行的载体包括但不限于质粒或修饰病毒，但所述载体系统必须与使用的宿主细胞相适配。这样的载体包括但不限于噬菌体(如λ衍生物)或质粒，诸如PBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene)。例如，可以通过将所述DNA片段连接至具有互补粘性末端的克隆载体，实现对克隆载体的插入。然而，如果用于所述DNA片段的互补限制位点在所述克隆载体中不存在，则可以经酶修饰所述DNA分子的末端。或者，通过将核苷酸序列(接头)连接至DNA末端上，可以产生任何需要的位点；这些连接接头可以含有编码限制性内切核酸酶识别序列的特异性化学合成的寡核苷酸。在一个替代的方法中，可以通过同聚物加尾或使用含合适序列的引物的PCR，修饰切割的载体和S2C6基因。可以通过转化、转染、感染、电穿孔等将重组分子引入到宿主细胞中，以便产生许多拷贝的基因序列。
在一个替代的方法中，可在以“鸟枪”法将所需基因插入到合适的克隆载体后对其进行鉴定和分离。在插入所述克隆载体之前，可以通过例如大小分级进行所需的基因的富集。
在具体的实施方案中，用加入分离的S2C6基因、cDNA或合成的DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞能够产生多拷贝的所述基因。因此，通过培养转化体、由转化体分离重组DNA分子并在需要时由分离的重组DNA中回收所插入的基因，可以获得大量的所述基因。
本发明提供的S2C6基因包括编码与天然S2C6可变区发现的基本相同的氨基酸序列的那些核苷酸序列、编码具有功能相同的氨基酸的氨基酸序列的那些核苷酸序列，以及编码其它S2C6衍生物或类似物(如下文对S2C6衍生物或类似物的描述)的那些核苷酸序列。
5.3表达S2C6基因编码S2C6蛋白或其功能活性类似物或片段或其它衍生物(参见5.6单元)的核苷酸序列，可以被插入到合适的表达载体中，即含有插入蛋白编码序列的转录和翻译必需的元件的载体。转录和翻译必需的信号还可以由天然S2C6基因和/或其侧翼区提供。可以使用各种宿主-载体系统表达所述蛋白编码序列。这些系统包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，诸如含酵母载体的酵母或用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；转基因植物或人类以外的转基因动物。载体的表达元件在其长度和特异性上有所变化。根据使用的宿主-载体系统，可以使用大量合适转录和翻译元件中的任一个。
可以使用先前所述的任一种将DNA片段插入到载体中的方法，构建含有嵌合基因(由合适的转录/翻译控制信号组成)和蛋白编码序列的表达载体。这些方法可包括体外重组体DNA和合成技术以及体内重组体(基因重组)。编码S2C6蛋白或肽片段的核酸序列的表达可以由第二种核酸序列调节，以便S2C6蛋白或肽在用重组体DNA分子转化的宿主中表达。例如，可以通过本领域已知的任何启动子/增强子元件控制S2C6蛋白的表达。可用于控制S2C6基因表达的非天然S2C6基因启动子包括但不限于，SV40早期启动子区(Benoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、包含在Rous肉瘤病毒的3′长末端复制的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)；原核细胞表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)或lac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；也参见“得自重组细菌的有用蛋白”，载于Scientific American，1980，24274-94；含有胭脂碱合成酶启动子区的植物表达载体(Herrera-Estrella等，Nature 303209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，Nucl.Acids.Res.92871)，以及光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶启动子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310115-120)；得自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子，和以下的显示出组织特异性并已应用于转基因动物的动物转录控制区在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell38639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)、在胰腺β细胞中有活性的基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell 38647-658；Adames等，1985，Nature 318533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell 45485-495)、在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1268-276)、在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer等，1987，Science 23553-58)、在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1161-171)、在骨髓细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature 315338-340；Kollias等，1986，Cell 4689-94)、在大脑的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell 48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314283-286)和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science 2341372-1378)。
在一个具体的实施方案中，使用的载体包含有效连接至S2C6基因核酸的启动子、一个或多个复制起点以及任选含有一个或多个选择性标记(例如抗生素抗性基因)。
可通过三种基本方法鉴定包含S2C6基因插入片段的表达载体(a)核酸杂交；(b)“标记”基因功能的存在或不存在；和(c)插入序列的表达。在第一种方法中，可通过使用含与插入的S2C6基因同源的序列的探针进行核酸杂交，检测插入到表达载体中的S2C6基因的存在。在第二种方法中，可根据所述载体中插入的S2C6基因产生的某些“标记”基因功能(例如胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、在杆状病毒中形成包含体等)的存在或不存在，鉴定并选择重组载体/宿主系统。例如，如果在所述载体的标记基因序列中插入S2C6基因，则可通过标记基因功能的缺失鉴定含有S2C6插入片段的重组体。在第三种方法中，可通过测定由所述重组体表达的S2C6产物，鉴定重组表达载体。这样的测定可基于例如S2C6蛋白在体外测定系统中的物理和功能特性，例如增强CD40L与CD40的结合、刺激正常B细胞增殖、抑制肿瘤生长。
一旦鉴定和分离出具体的重组DNA分子，则可用几种本领域已知的方法进行增殖。一旦确定合适的宿主系统和培养条件，则可以大量增殖和制备重组表达载体。如前所述，可使用的表达载体包括但不限于以下的载体或其衍生物人或动物病毒如痘苗病毒或腺病毒、昆虫病毒如杆状病毒、酵母载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)以及质粒和粘粒DNA载体，在此仅举几个例子。
此外，可以选择调节插入序列的表达或以需要的特异性方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。在某些诱导物存在下可提升某些启动子的表达；因此，可以控制S2C6基因工程蛋白的表达。而且，不同的宿主细胞具有用于翻译和翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制(例如蛋白糖基化、磷酸化)。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保对表达的前述蛋白的所需修饰和加工。例如，在细菌系统中的表达可用于产生非糖基化核心蛋白产物。在酵母中的表达可产生糖基化产物。在哺乳动物细胞中的表达可用于确保异源蛋白的“天然”糖基化。而且，不同载体/宿主系统可不同程度地影响加工反应。
在具体的实施方案中，表达的S2C6相关蛋白为抗体或其片段或衍生物。重组抗体可含有重组轻链可变区、重组重链可变区或二者均包含在内。在一个具体的实施方案中，轻链和重链或其衍生物均由细胞重组表达(参见例如Boss等于1989年3月28日登记的美国专利第4,816,397号)。可使用各种宿主-载体系统表达蛋白编码序列。这些系统包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，诸如含酵母载体的酵母或用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；转基因植物或人类以外的转基因动物。
5.4鉴定和纯化基因产物在具体的方面，本发明提供S2C6蛋白及其片段和衍生物的氨基酸序列，以及编码它们的核酸序列，所述氨基酸序列含有互补决定区(CDR)或具有其它的功能活性。本文使用的“功能活性”的S2C6物质是指显示出一种或多种与全长(天然)S2C6蛋白相关的功能活性的物质，所述功能活性例如为结合CD40，刺激正常B细胞增殖，抑制肿瘤生长，使CD40配体与CD40的结合增加至少45％。
在具体的实施方案中，本发明提供S2C6蛋白片段以及其编码核酸，其中所述片段由至少6、10、20、50、75或100个氨基酸组成。
一旦鉴定出表达S2C6基因序列的重组体，则可以分析基因产物。这可通过基于所述产物的物理或功能特性的测定来实现，所述测定包括放射性标记所述产物然后经凝胶电泳分析、免疫测定、正常B细胞增殖的刺激、CD40结合测定、CD40配体与CD40结合的促进、肿瘤生长的抑制等。
一旦鉴定出S2C6蛋白，则可通过标准方法对其进行分离和纯化，所述标准方法包括层析(例如离子交换层析、亲和性层析和分子筛(sizing)柱层析)、离心、不同溶解性或任何其它用于蛋白纯化的标准技术。可用任一合适的测定评价功能特性(参见5.7单元)。
或者，可通过本领域已知的基于本文公开的序列的标准化学方法合成S2C6蛋白或其衍生物(例如参阅Hunkapiller等，1984，Nature310105-111)。
在本发明的一个具体实施方案中，这类S2C6蛋白，无论是通过重组DNA技术产生还是通过化学合成方法产生，或是通过天然蛋白纯化产生，都包括(但不限于)包含为初级氨基酸序列的基本如图3A-3B(SEQ ID NO2和7)所示的氨基酸序列的全部或部分的蛋白，以及其片段和其他衍生物和其类似物(包括其同源蛋白)。
5.5 S2C6基因和蛋白的结构可通过本领域已知的各种方法分析本发明的S2C6基因和蛋白的结构。以下描述这些方法的某些实例。
5.5.1遗传分析可分析对应于S2C6基因的克隆DNA或cDNA的方法包括但不限于DNA杂交(Southern hybridization)(Southern，1975，J.Mol.Biol.98503-517)、RNA杂交(Northern hybridization)(参见例如Freeman等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.804094-4098)、限制性内切核酸酶作图(Maniatis，1982，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring HarborNew York)以及DNA序列分析。因此，本发明提供识别S2C6基因的核酸探针。例如，在聚合酶链反应(PCR；美国专利第4,683,202、4,683,195和4,889,818号；Gyllenstein等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857652-7656；Ochman等，1988，Genetics 120621-623；Loh等，1989，Science 243217-220)后用S2C6基因特异性探针进行DNA杂交，可检测来自细胞(例如杂交瘤)的DNA或cDNA中的S2C6基因。也可以使用通常已知的非PCR扩增方法。可对DNA杂交和RNA杂交二者的杂交条件的严格性进行操作，以确保检测出与使用的特异性S2C6基因探针具有所需相关度的核酸。可使用这些方法和本领域通常已知的其它方法的改良方法。
可使用限制性内切核酸酶作图粗略估测S2C6基因的遗传结构。可通过DNA序列分析证实由限制性内切核酸酶切割产生的限制酶图谱。
可通过任何本领域已知的技术进行DNA序列分析，包括但不限于Maxam和Gilbert法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)、Sanger双脱氧法(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)、使用T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson，美国专利第4,795,699号)或使用自动化DNA测序仪(例如Applied Biosystems，Foster City，California)。
5.5.2蛋白分析可通过DNA序列推导，或通过直接蛋白测序(例如使用自动化氨基酸测序仪)，得出S2C6蛋白的氨基酸序列。
可通过亲水性分析进一步特征鉴定S2C6蛋白序列(Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783824)。亲水性分布图可用于鉴定S2C6蛋白的疏水区和亲水区(加强免疫原性)以及编码这些区的相应的基因序列区。
还可以进行二级结构分析(Chou和Fasman，1974，Biochemistry13222)，以鉴定表现为特异性二级结构的S2C6蛋白区。
还可以用本领域可得到的计算机软件程序完成操作、翻译和二级结构预测、可读构架预测和作图以及序列同源性测定。
5.6单克隆抗体S2C6抗体衍生物本文描述了用于产生能够免疫特异性结合CD40的S2C6抗体衍生物的方法。
这样的抗体包括但不限于单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体以及以上任一抗体的表位结合片段。在一个实施方案中，S2C6衍生物在与S2C6初级氨基酸序列相关的初级氨基酸序列中包含一个或多个缺失、添加和/或取代。在另一个实施方案中，S2C6衍生物不是用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生的。在再另一个实施方案中，S2C6衍生物在与S2C6初级氨基酸序列相关的初级氨基酸序列中包含一个或多个缺失、添加和/或取代，且不是用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生的。在本单元和下文的5.7单元提供选择合适的缺失、添加和/或取代的引导。
为制备另外的抗CD40的单克隆抗体，可使用在培养基中由传代细胞系生产抗体分子的任何技术。这些技术包括但不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(1975，Nature 256，495-497；以及美国专利第4,376,110号)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，ImmunologyToday 4，72Cole等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026-2030)以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。这样的抗体或本领域可获得的其它抗CD40抗体例如可用作克隆的基础，并因此在S2C6重链重组表达时提供互补轻链(两条链可在同一细胞中重组表达，或在分开表达和纯化后体外组合)；或者，可使用来自任何特异性抗体的轻链。可将编码S2C6重链或编码含S2C6重链可变区的分子的核酸(例如质粒)转染入表达抗体轻链或含抗体轻链的分子的细胞中，用于表达多聚体蛋白；所述抗体轻链可以是重组体或非重组体，并可以具有或不具有抗-CD40特异性。或者，可任选在互补轻链或轻链可变区不存在的情况下，表达和使用S2C6重链或含其可变区或其CDR的分子。在各种实施方案中，本发明提供具有CD40结合亲和性的S2C6重链或一种分子(其含有一个或多个拷贝的重链CDR 8、9和/或10或由其组成)或一种蛋白(肽或多肽)，所述蛋白的序列含有一个或多个拷贝的CDR 8、9和/或10或由其组成。在一个具体的实施方案中，这种蛋白可以通过例如C末端酰胺化或N末端乙酰化对N或C末端进行修饰。
另外，可使用通过将合适抗原特异性的小鼠抗体分子基因与合适生物活性的人抗体分子基因剪接在一起开发的用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312，604-608；Takeda等，1985，Nature314，452-454)。嵌合抗体是一种其中不同的部分得自不同的动物物种的分子，例如具有鼠类单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。(参阅例如美国专利第4,816,567号；以及Boss等，美国专利第5,816,397号)。在一个具体的实施方案中，所述嵌合抗体包含由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6的可变区和人恒定区。在具体的实施方案中，所述嵌合抗体的可变区含有示于图3A的S2C6 VL(SEQ ID NO2)和/或示于图3B的S2C6 VH(SEQ ID NO7)。
另外，已开发了产生人源化抗体的技术。(参阅例如Queen，美国专利第5,585,089号和Winter，美国专利第5,225,539号)。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区间隔的“构架”区组成，称为互补性决定区(CDR)。已精确定义了构架区和CDR的范围(参阅“目的免疫球蛋白的序列”，Kabat，E.等，美国公共医疗卫生与人类健康部(1983))。简而言之，人源化抗体是得自具有一个或多个人类以外物种的CDR和人免疫球蛋白分子的构架区的人类以外物种的抗体分子。
本发明包括含重链或轻链可变区的抗体或其衍生物，所述可变区包含(a)一组三个互补性决定区(CDR)，其中所述CDR组来自单克隆抗体S2C6，和(b)一组四个构架区，其中所述构架区组与单克隆抗体S2C6中的构架区组不同，并且其中所述抗体或其衍生物免疫特异性地结合CD40。所述构架区组最好是得自人单克隆抗体，例如不结合CD40的人单克隆抗体。
在一个具体的实施方案中，本发明包括含轻链可变区的抗体或其衍生物，所述可变区包含(a)一组三个互补性决定区(CDR)，其中所述CDR组包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO4，和(b)一组四个构架区，其中所述构架区组与单克隆抗体S2C6中的轻链构架区组不同，并且其中所述抗体或其衍生物免疫特异性地结合CD40。
在一个具体的实施方案中，本发明包括含重链可变区的抗体或其衍生物，所述可变区包含(a)一组三个互补性决定区(CDR)，其中所述CDR组包含SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，和(b)一组四个构架区，其中所述构架区组与单克隆抗体S2C6的重链中的构架区组不同，并且其中所述抗体或其衍生物免疫特异性结合CD40。
或者，可采用所描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号；Bird，1988，Science 242，423-426；Huston等，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883；和Ward等，1989，Nature 334，544-546)，使用S2C6序列产生单链抗体。通过经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链抗体，产生单链多肽。在一个具体的实施方案中，所述单链抗体包含示于图3A和图3B的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOS2和7)。
在一个具体的实施方案中，含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO6的全部或部分的抗CD40抗体、多肽、肽或其它衍生物或其类似物是一种双特异性抗体(一般参见例如Fanger和Drakeman，1995，DrugNews and Perspectives 8133-137)。对这样的双特异性抗体进行基因工程改造，以便识别(1)表位和(2)众多“触发”分子中的一种，例如骨髓细胞上的Fc受体和T细胞上的CD3和CD2，它们已被鉴定为能够使细胞毒性T细胞破坏特定靶。可通过化学接合、杂交瘤或技术人员已知的重组分子生物学技术制备这种双功能抗体。在一个具体的实施方案中，所述双功能抗体包含的分子含有S2C6重链或轻链可变区或其CDR序列，所述分子具有抗体重链或轻链的结构，但不同于天然S2C6重链或轻链(例如在构架区或人恒定区中具有氨基酸取代)。
可通过已知技术产生保留识别CD40能力的抗体片段。例如，这样的片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段以及可通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生的F(ab′)片段。或者，可构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science 2461275-1281)，以允许快速且容易地鉴定具有所需的特异性的单克隆Fab片段。
5.7 S2C6蛋白、衍生物和类似物除了在以上5.6单元描述的那些抗体分子/变异体以外，本发明还涉及S2C6蛋白、衍生物(包括但不限于片段)、类似物和S2C6蛋白分子。还提供编码S2C6蛋白衍生物和S2C6蛋白类似物的核酸。在一个实施方案中，S2C6蛋白由上文5.1单元描述的核酸所编码。在具体的方面，所述蛋白、衍生物或类似物由SEQ ID NO1或SEQID NO6的序列所编码。
与S2C6蛋白相关的衍生物和类似物的生产和应用属于本发明的范围。在一个具体的实施方案中，所述衍生物和类似物具有功能活性，即能够表现出一种或多种与全长S2C6蛋白相关的功能活性。作为一个实施例，可在免疫测定或治疗性抑制肿瘤生长等中应用这样的具有所需结合特异性的衍生物或类似物。一个具体的实施方案涉及结合CD40并增强CD40L与CD40结合的S2C6蛋白片段。可通过本领域已知的各种免疫测定检测S2C6蛋白的衍生物或类似物的所需活性，所述免疫测定包括但不限于使用以下技术的竞争性测定系统和非竞争性测定系统诸如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、蛋白质印迹、免疫荧光测定、A蛋白测定、免疫电泳测定等。
另外，可使用本领域已知的测定检测或测定体内或体外抑制细胞增殖(例如抑制肿瘤生长)的能力或刺激细胞增殖(例如B细胞增殖)的能力。
具体而言，可通过提供功能等同分子的取代、添加(例如插入)或缺失改变S2C6序列，制备S2C6衍生物。由于核苷酸编码序列的简并性，所以编码与S2C6基因大致相同的氨基酸序列的其它DNA序列可用于本发明的实践。这些DNA序列包括但不限于包含S2C6基因的全部或部分的核苷酸序列，它们是通过编码序列中功能等同氨基酸残基的不同密码子的取代，由此产生沉默变化而得到改变。同样地，本发明的S2C6衍生物包括但不限于包含为初级氨基酸序列的S2C6蛋白的全部或部分氨基酸序列的那些物质，包括其中功能等同氨基酸残基取代所述序列的残基导致沉默变化的改变序列。例如，所述序列中的一个或多个氨基酸残基可被另一个起功能等价作用的相似极性氨基酸取代，产生沉默改变。所述序列中的氨基酸取代可选自所述氨基酸所属类型的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这类取代通常被理解为保守取代。
在本发明的一个具体实施方案中，提供由S2C6蛋白片段组成或包含S2C6蛋白片段的蛋白，其中所述S2C6蛋白片段由S2C6蛋白的至少10个(连续的)氨基酸组成。在其它实施方案中，所述片段由S2C6蛋白的至少20个或至少50个氨基酸组成。在具体的实施方案中，这种片段不长于50、75、100或200个氨基酸。S2C6蛋白的衍生物或类似物包括但不限于那些含有与S2C6蛋白或其片段大致同源(例如在各种实施方案中，在没有插入或缺失的相同大小的氨基酸序列上的同一性至少为60％或70％或80％或90％或95％，或与通过本领域已知的计算机同源性程序进行序列对比的对比序列相比较，同一性至少为60％或70％或80％或90％或95％)的区的分子，或者其编码核酸能够在高、中或低严格条件下与编码S2C6基因序列杂交的分子。
具体而言，用于测定同源性的计算机程序实例包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TEASTA和CLUSTALW (Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)2444-8；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-10；Thompson等，1994，Nucleic.Acids.Res.22(22)4673-80；Higgins等，1996，Methods Enzymol 266383-402；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-10)。这些计算机程序中的每一种程序的默认参数均为熟知的，并可加以利用。
具体而言，基本局部序列对比检索工具(BLAST)(www.ncbi.nlm.nih.gov)(Altschul等，1990，J.of Molec.Biol.215403-410，“BLAST算法；Altschul等，1997，Nuc.Acids.Res.253389-3402)是一种专门用于检索序列相似性的启发性检索算法，该算法可归结于使用Karlin和Altschul等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-68；1993，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，905873-77的统计学方法的显著性。使用五种特定的BLAST程序执行以下的任务1)BLASTP程序比较氨基酸查询(query)序列与蛋白质序列数据库；2)BLASTN程序比较核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库；3)BLASTX程序比较核苷酸查询序列(双链)的6-读框(frame)概念翻译产物与蛋白质序列数据库；4)TBLASTN程序比较蛋白查询序列与在全部6个读框中翻译的核苷酸序列数据库(双链)；5)TBLASTX程序比较核苷酸查询序列的6-读框翻译产物与核苷酸序列数据库的6-读框翻译产物。
Smith-Waterman(数据库欧洲生物信息研究所wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/)(Smith-Waterman，1981，J.of Molec.Biol.，147195-197)是一种用于序列对比的数学上严密的算法。
FASTA(参见Pearson等，1988，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，852444-2448)是一种近似于Smith-Waterman算法的启发性算法。关于BLAST、Smith-Waterman和FASTA算法的的步骤和优势的一般性论述，参见Nicholas等，1998，“序列数据库检索指南和序列记分方法”(www.psc.edu)及其中引用的参考文献。
本发明的S2C6衍生物和类似物可通过本领域已知的各种方法产生。可在基因或蛋白水平上进行导致其产生的操作。例如，可通过本领域已知的众多策略中的任一种，修饰克隆的S2C6基因序列(Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)。可用限制性内切核酸酶在合适的位点切割所述序列，接着如果需要的话进一步进行酶修饰、分离并体外连接。在产生编码S2C6蛋白衍生物或类似物的修饰基因时，应小心确保所述修饰基因保留在与天然蛋白相同的翻译读框中，而不致于在编码所需的S2C6蛋白活性的基因区中被翻译终止信号间断。
另外，S2C6核酸序列可在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译序列、起始序列和/或终止序列，或在编码区产生变异和/或形成新的限制性内切核酸酶位点或破坏预先存在的限制性内切核酸酶位点，以易于进一步的体外修饰。可以使用任一种本领域已知的诱变技术，包括但不限于化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson等，1978，J.Biol.Chem.2536551)、使用含有诱变的引物的PCR等。
还可以在蛋白水平上操作S2C6蛋白序列。包括在本发明范围内的S2C6蛋白片段或其它衍生物或类似物在翻译过程中或在翻译后被分别修饰，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保护基/封闭基团衍生化、蛋白酶剪切、连接至抗体分子或其它细胞配体等。可通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，包括但不限于利用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、氧化、还原、在衣霉素存在下的代谢合成等。
另外，可化学合成S2C6蛋白的类似物和衍生物。例如，可使用肽合成仪合成对应于一部分、含有所需的结构域或在体外介导所需的活性的S2C6蛋白的肽。而且，如果需要的话，可将非典型氨基酸或化学氨基酸类似物以取代或添加引入到S2C6序列中。非典型氨基酸包括但不限于一般氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、designer氨基酸(诸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)和一般的氨基酸类似物。而且，所述氨基酸可以是D(右旋)氨基酸或L(左旋)氨基酸。
在其它的具体实施方案中，S2C6蛋白、片段、类似物或衍生物可作为融合或嵌合蛋白产物(包含通过肽键连接不同蛋白的异源蛋白序列的所述蛋白、片段、类似物或衍生物)表达。所述异源蛋白序列可含有生物反应调节剂，包括但不限于α干扰素、γ干扰素、白介素-2、白介素-4、白介素-6和肿瘤坏死因子或其功能活性部分。或者，所述异源蛋白序列可包含酶(如β-内酰胺酶或羧酸酯酶)或毒素(如bryodin1、假单胞菌外毒素A或gelonin)或其功能活性部分。或者，S2C6蛋白可与化疗剂化学连接，所述化疗剂包括但不限于烷化剂(例如氮芥、亚硝基脲、三氮烯)；抗代谢物(例如叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似剂)；天然产物(例如抗生素、酶、生物反应调节物)；其它物质(例如取代的脲、铂配位复合物)；以及激素和拮抗剂(例如雌激素、雄激素、抗雄激素、促性腺素释放激素类似物)；或其功能活性部分(参见例如Goodman和Gilman，治疗的药理基础，第九板，McGraw-Hill，第1225-1287页，1996)。可通过本领域已知的方法，将编码所需的氨基酸序列的合适核酸序列在正确的编码框内互相连接，并通过本领域通常已知的方法表达所述嵌合产物，从而制备这样的嵌合产物。或者，可通过蛋白合成技术(例如使用肽合成仪)制备这样的嵌合产物。在不同的实施方案中，异源蛋白序列可通过非肽键(例如使用本领域众所周知的化学交联剂)与S2C6相关序列共价结合。
在一个具体的实施方案中，S2C6蛋白衍生物是一种含有S2C6蛋白或其片段(优选由S2C6蛋白的至少一个结构域或基序组成，或由S2C6蛋白的至少10、50或100个氨基酸组成)的嵌合或融合蛋白，其中所述S2C6蛋白或其片段在其氨基末端或羧基末端通过肽键连接至不同蛋白的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述不同蛋白是毒素、酶或生物反应调节剂。
在具体的实施方案中，所述不同蛋白的氨基酸序列为所述不同蛋白的至少6、10、20或30个连续的氨基酸或所述不同蛋白的功能活性部分，在一个实施方案中，通过重组表达编码所述蛋白(包含在读框内连接至不同蛋白的编码序列的S2C6编码序列)的核酸产生这样的嵌合蛋白。可通过本领域已知的方法，将编码所需的氨基酸序列的合适核酸序列在正确的编码框内互相连接，并通过本领域通常已知的方法表达所述嵌合产物，从而制备这样的嵌合产物。或者，可通过蛋白合成技术(例如使用肽合成仪)制备这样的嵌合产物。可构建含有融合至任何异源蛋白编码序列的S2C6基因部分的嵌合基因。一个具体的实施方案涉及的嵌合蛋白含有的S2C6蛋白片段至少为6或15或50个氨基酸，或具有S2C6蛋白的一种或多种功能活性(例如包含一个或多个CDR的拷贝)。
在一个具体的实施方案中，S2C6蛋白或其衍生物化学连接至化疗药物(包括但不限于阿霉素、紫杉醇或docetaxel)。这种S2C6-药物结合体可将所述药物传递至表达CD40的细胞。S2C6蛋白或衍生物可连接一种或多种药物分子。连接包括但不限于腙、肽或糖连接。
在另一个具体的实施方案中，所述衍生物是一种含有与S2C6蛋白同源的区的分子。作为实施例，在各种实施方案中，当第一个蛋白区的氨基酸序列(没有任何插入或缺失)与第二个蛋白区(其含有的氨基酸数目与所述第一个区中含有的氨基酸数目相等)的任何序列相比至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相同，或当第一个蛋白区的氨基酸序列与第二个区的已通过本领域已知的计算机同源性程序进行比较的对比序列相比至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相同时，则可认为所述第一个蛋白区与所述第二个蛋白区同源。
5.8杂交条件在一个具体的实施方案中，提供在低严格条件下与S2C6核酸(例如具有SEQ ID NOS1或6所提供的序列)或其反向互补物或者编码S2C6衍生物的核酸或其反向互补物杂交的核酸。作为非限制性实例，以下为使用这类低严格条件的方法(也参见Shilo合Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6789-6792)。于40℃在含35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA的溶液中预处理含DNA的滤器6小时。在具有以下改变的相同溶液中进行杂交0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑精DNA、10％(重量/体积)硫酸葡聚糖，并使用5-20×106cpm32P标记的探针。滤器于40℃在杂交混合物中温育18-20小时，然后于55℃在含2X SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中漂洗1.5小时。用新鲜溶液替换漂洗溶液，并于60℃再温育1.5小时。吸干滤器并进行放射自显影曝光。如果必要，于65-68℃第三次清洗滤器并对胶片重新曝光。可以使用的其它低严格条件是本领域众所周知的(例如采用种间杂交)。
在一个具体的实施方案中，提供在高严格条件下与S2C6核酸(例如具有SEQ ID NOS1或6所提供的序列)或其反向互补物或者编码S2C6衍生物的核酸或其反向互补物杂交的核酸。作为非限制性实例，以下为使用这类高严格条件的方法。于65℃在由6X SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA组成的缓冲液中预杂交含DNA的滤器8小时至过夜。于65℃使滤器在含100μg/ml变性鲑精DNA和5-20×106cpm32P标记的探针的预杂交混合物中杂交48小时。于37℃在含2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中漂洗滤器1小时。接着于50℃在0.1X SSC中漂洗45分钟，然后放射自显影。可以使用的其它高严格条件是本领域众所周知的。
在一个具体的实施方案中，提供在中等严格条件下与S2C6核酸(例如具有SEQ ID NOS1或6所提供的序列)或其反向互补物或者编码S2C6衍生物的核酸或其反向互补物杂交的核酸。对合适的中等严格条件的选择是本领域众所周知的(参见例如Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring HarborNew York；还参见Ausubel等编辑，载于实验室技术手册分子生物学系列现时方案，1987-1997Current Protocols，1994-1997 John Wiley and Sons，Inc.)。
5.9治疗应用本发明通过给予治疗性化合物(本文称为“治疗剂”)提供对各种疾病或紊乱的治疗和预防。这样的治疗剂包括但不限于S2C6抗体及其衍生物(例如上文所述)；以及编码这种S2C6抗体及其衍生物的核酸(例如上文所述)。本文使用的“治疗”实际上应包括任何对所述疾病或紊乱有临床需要或有益的作用，包括但不限于缓解一种或多种症状、抑制、减缓或终止恶化等。
在本发明的具体实施方案中，所述治疗剂或单独给予或与CD40L一起给予，以治疗或预防恶性肿瘤(包括但不限于癌和血癌)、炎性疾病以及免疫系统疾病。所述治疗剂和CD40L可以(但不是必须)包含在同一制剂中，即所述治疗剂和CD40可分别给予，但也可同时给予或在同一治疗过程中给予。在一个具体的实施方案中，所述恶性细胞表达CD40。或者，所述恶性细胞不必表达CD40，因为与恶性肿瘤相连的脉管系统的内皮细胞应表达CD40，因此本发明的治疗剂甚至对不表达CD40的肿瘤也能提供治疗功效。在一个优选的实施方案中，所述治疗剂使CD40L与CD40的结合增强至少45％、50％、60或65％。
在具体的实施方案中，所述治疗剂用于增强免疫受抑制的个体(如罹患获得性免疫缺陷综合征、恶性肿瘤的人或婴儿或老年人)的免疫应答。
在本发明的其它实施方案中，所述治疗剂可进行化学修饰，以便杀死其结合的细胞。这样的细胞包括但不限于多发性骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞或癌细胞。因为所有的B细胞都表达CD40，所以该方法可对免疫应答产生抑制。例如，为了越过移植患者的组织相容性屏障，可使用连接S2C6序列的细胞毒性药物(例如融合蛋白)，以在体内引起免疫抑制；或者可使用这些修饰的配体控制自身免疫性疾病。
在其它的实施方案中，所述治疗剂可用于促进非B细胞的携带CD40的细胞(例如肺癌细胞)的增殖和/或分化，作为直接治疗恶性肿瘤的工具或作为化疗辅助剂。
可使用本发明的治疗剂治疗或预防的恶性肿瘤包括但不限于表1中的那些恶性肿瘤表1恶性肿瘤和相关疾病白血病急性白血病急性淋巴细胞白血病急性骨髓细胞白血病急性成髓细胞白血病急性前髓细胞白血病急性骨髓单核细胞白血病急性单核细胞白血病急性红白血病慢性白血病慢性骨髓细胞(粒细胞)白血病慢性淋巴细胞白血病脾大性红细胞增多淋巴瘤何杰金氏病非何杰金氏病多发性骨髓瘤Waldenstrm氏巨球蛋白血症重链疾病实体瘤肉瘤和癌症纤维肉瘤粘液肉瘤脂肪肉瘤软骨肉瘤骨原性肉瘤骨肉瘤脊索瘤血管肉瘤内皮肉瘤淋巴管肉瘤淋巴管内皮肉瘤滑膜瘤间皮瘤Ewing氏瘤平滑肌肉瘤横纹肌肉瘤结肠癌结肠直肠癌胰腺癌乳癌卵巢癌前列腺癌鳞状细胞癌基细胞癌腺癌汗腺癌皮脂腺癌乳头状癌乳头状腺癌囊腺癌髓样癌支气管原性癌肾细胞癌肝细胞瘤胆管癌绒膜癌精原细胞瘤胚胎癌Wilms氏肿瘤颈癌子宫癌睾丸癌肺癌小细胞肺癌非小细胞肺癌膀胱癌上皮细胞癌神经胶质瘤星细胞瘤成神经管细胞瘤颅咽管瘤室管膜细胞瘤松果体瘤成血管细胞瘤听神经瘤寡枝神经胶质细胞瘤脑膜瘤(menangioma)黑素瘤成神经细胞瘤眼癌鼻咽癌食道癌可使用本发明的治疗剂治疗或预防的炎性疾病和免疫系统缺陷或疾病包括但不限于在表2中的那些病症表2炎性疾病和免疫系统疾病系统性红斑狼疮(SLE)硬皮病(例如CRST综合征)炎症性肌炎
Sjgren氏综合征(SS)混合性结缔组织疾病(例如MCTD、Sharp综合征)类风湿性关节炎多发性硬化炎性肠道疾病(例如溃疡性结肠炎、节段性结肠炎)急性呼吸窘迫综合征肺炎骨质疏松症迟发型过敏症哮喘夏科氏肝硬变(PBC)自发性血小板减少性紫癜(ITP)5.9.1有效剂量可通过标准药学方法测定所述治疗剂在细胞培养物或实验性动物中的毒性和治疗功效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比率为治疗指数，它可以表示为LD50/ED50比率。优选具有大治疗指数的治疗剂。尽管可以使用具有毒性副作用的治疗剂，但应小心设计将所述化合物靶向受累组织部位的传递系统，以使对未感染细胞的潜在伤害最小，并因此减少副作用。
在配制人类使用的剂量范围时，可使用由细胞培养测定和动物研究所获得的数据。典型剂量包括但不限于1ng/kg至100mg/kg。所述治疗剂的剂量优选位于包括几乎无毒或无毒的ED50的循环浓度范围内。所述剂量可根据使用的剂型和利用的给药途径而在此范围内有所变化。对于一种治疗剂，最好先由细胞培养测定评价治疗有效剂量。可配制一种剂量，以在动物模型中达到循环血浆浓度范围，包括在细胞培养中测定的IC50(即达到对综合征最大抑制一半时的测试化合物浓度)。可使用这种信息，以更精确地测定在人类中有用的剂量。例如可通过高效液相色谱检测在血浆中的水平。
5.9.2 配制可以常规方式，使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂，配制按照本发明使用的药用组合物。
因此，可配制所述治疗剂及其生理学上可接受的盐和溶剂化物，以通过吸入或吹入(或通过嘴或通过鼻)给药或口服、口腔含化、胃肠外或直肠给药。
对于口服给药，所述药用组合物可采用例如通过常规方法利用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊剂剂型，其中所述赋形剂有例如粘合剂(例如预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可通过本领域广为人知的方法进行包衣。口服的液体制剂可采用的剂型例如为溶液剂、糖浆剂或悬浮剂，或者它们可作为在使用前用水或其它合适溶媒稀释的干燥产品存在。这样的液体制剂可通过常规方法，用药学上可接受的添加剂制备，其中所述添加剂例如为悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水溶性载体(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制剂在合适时还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
可适当地配制口服给药制剂，以获得控释的活性化合物。
对于口腔含化给药，所述组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂剂型。
对于吸入给药，按照本发明使用的所述治疗剂通常以由加压填充器或喷雾器使用合适的抛射剂提供的气溶胶喷雾剂形式传递，所述抛射剂例如为二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供一种计量的量传递的阀确定剂量单位。用于吸入剂或吹入剂的胶囊和药筒(例如明胶)，可配制成含有所述化合物的粉末混合物和一种合适的粉末基，诸如乳糖或淀粉。
所述治疗剂可配制为通过注射胃肠外给予，例如通过大剂量注射或连续输注。注射制剂可以是有或没有添加的防腐剂的单位剂型(例如在安瓿或多剂量容器中)。所述组合物可采用诸如在油性或水性溶媒中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述活性成分可以为在使用前用合适溶媒(例如灭菌无热源水)配制的粉末形式。
所述治疗剂还可以被配制为直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，例如含常规栓剂基质(如可可酯或其它甘油酯)的组合物。
除了先前描述的制剂以外，所述治疗剂还可以被配制为包埋长效(depot)制剂。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或肌内注射给药。因此，例如所述治疗剂可用合适的聚合物或疏水性物质(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物，例如微溶盐。
如果需要的话，所述组合物可存在于包装或分散装置中，所述装置可含有一种或多种含所述活性成分的单位剂型。所述包装例如可包括金属或塑料薄片，诸如泡罩包装。所述包装或分散装置可附带有优选给予人的给药说明。
在具体的实施方案中，本发明提供包含治疗有效量的治疗剂与CD40配体的药用组合物。
在以下的实施例中进一步描述本发明，但这些实施例决不是限制本发明的范围。
6.实施例克隆S2C6可变区
6.1材料与方法使用基本如Gilliland等，1996，Tissue Antigens 471-20所述的方法，克隆S2C6轻链和重链可变区。由S2C6杂交瘤分离总RNA。使用逆转录酶和退火JC接点(junction)下游大约100个碱基对的反义引物，制备小鼠κ轻链和重链可变区的互补DNA(cDNA)第一链。使用末端转移酶将聚鸟苷酸尾(poly-G tail)加入到所述cDNA链中，然后使用聚合酶链反应(PCR)合成双链DNA。设计对所述聚鸟苷酸尾或轻链或重链cDNA内部约50个碱基的序列特异性的PCR引物，使之能包括独特限制酶切位点。扩增后，将用EcoRI和HindIII消化的PCR产物克隆入已用相同限制酶消化的pUC19中。连接这些反应物，转化到大肠杆菌DH5α中，并通过限制酶切分析筛选获得的克隆。通过在Li-Cor荧光测序仪上进行DNA测序，对限制酶消化分析为阳性的克隆测序。在图1中显示了轻链可变区(VL)的核苷酸序列(SEQ IDNO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在图2中显示了重链可变区(VH)的核苷酸序列(SEQ ID NO6)和氨基酸序列(SEQ ID NO7)。图3A-3B图解显示了S2C6 VL和S2C6 VH的氨基酸序列(分别为图3A和3B)。CDR标出下划线。VLCDR 1-3的氨基酸序列分别对应于SEQ IDNOS3-5。VHCDR 1-3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NOS8-10。
然后比较获得的DNA序列与相同同种型的其它鼠抗体的轻链和重链可变区，并测定分离自S2C6的基因的读框和对应的氨基酸序列。为证实所述氨基酸序列，对S2C6单克隆抗体的轻链和重链可变区进行N-末端氨基酸分析。
1999年4月21日提交S2C6 VL、S2C6 VH以及VL和VH二者CDR的氨基酸序列，使用NR数据库(全部非丰余GenBank CDS翻译物+PDB+SwissProt+PIR+PRF)和Kabat数据库(Kabat的有关免疫球蛋白序列数据库)进行BLASTP检索。在http∥www.ncbi.nlm.nih.gov使用登录号可获取使用NR数据库发现的序列。在http∥immuno.bme.nwu.edu/database_.html和SEQHUNT II使用登录号可获取使用Kabat数据库发现的序列。这些检索结果如下所示使用NR数据库进行BLASTP检索S2C6 VL(SEQ ID NO2)用S2C6 VL作为查询序列对NR数据库进行BLASTP检索，在100％同一性时未得到命中序列，而在94％(106/112)同一性时获得6个命中序列。这6个序列示于以下pir||PT0359 IgGκ链V区(R4A.12)-小鼠(片段)gi|196660(M59949)免疫球蛋白κ链VJ区[鼠类肌肉]gi|196954(M12183)κ链V区[鼠类肌肉]＞gi|2247[鼠类肌肉]pir||B34904 Igκ链前体V区(12-40和5-14)…emb|CAA80076|(Z22102)免疫球蛋白可变区[鼠类肌肉]dbj|BAA22172|(AB006833)抗假尿苷单克隆抗体…VL CDR1(SEQ ID NO3)用VL CDR1作为查询序列进行BLASTP检索，在100％同一性时未得到命中序列，而在93％(15/16)同一性时获得无数命中序列。其中前5个序列示于以下dbj|BAA03480|(D14627)免疫球蛋白γ-3κ链[鼠类肌肉]dbj|BAA22172|(AB006833)抗假尿苷单克隆抗体…gi|4101647(AF005352)免疫球蛋白V区轻链[鼠类肌肉]gi|3377681(AF078800)单链抗HIV-1Rev可变区片段gi|1870366(U55625)抗DNA免疫球蛋白轻链IgM[鼠类肌肉]VL CDR2(SEQ ID NO4)用VL CDR2作为查询序列对NR数据库进行BLASTP检索，未得到命中序列。
VL CDR3(SEQ ID NO5)用VL CDR3作为查询序列对NR数据库进行BLASTP检索，未得到命中序列。
S2C6 VH(SEQ ID NO7)用S2C6 VH作为查询序列对NR数据库进行BLASTP检索，在100％同一性时未得到命中序列，而在最多可至88％同一性时获得无数命中序列，其中的前5个序列示于以下gi|3561044(AF083186)抗HIV-1p24抗体D2重链[鼠类肌肉]pdb|1A6T|B链B，Mab1-Ia单克隆抗体的Fab片段gi|2895955(AF045895)IgG1重链mAB1-IA[鼠类肌肉]emb|CAA80023|(Z22049)免疫球蛋白可变区[鼠类肌肉]gi|194510(M91695)免疫球蛋白γ-1链[鼠类肌肉]VH CDR1(SEQ ID NO8)用VH CDR1作为查询序列对NR数据库进行BLASTP检索，未得到命中序列。
VH CDR2(SEQ ID NO9)用VH CDR2作为查询序列对NR数据库进行BLASTP检索，在100％同一性时未得到命中序列，在94％(16/17)同一性时获得1个命中序列，而在低于94％的同一性时得到无数个命中序列。94％同一性时获得的1个命中序列如下所示gi|3561044(AF083186)抗HIV-1p24抗体D2重链[鼠类肌肉]VH CDR3(SEQ ID NO10)用VH CDR3作为查询序列对NR数据库进行BLASTP检索，未得到命中序列。
使用KABAT数据库进行BLASTP检索S2C6 VL(SEQ ID NO2)用S2C6 VL作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，在100％同一率时未得到命中序列，而在89-91％同一率时获得无数个命中序列。前5个序列示于以下KADBID 005591，小鼠IGκ轻链可变区(5-14...)，
KADBID 005594，小鼠IGκ轻链可变区(10VA...)，KADBID 005593，小鼠IGκ轻链可变区(12-4...)，KADBID 005603，小鼠IGκ轻链可变区(17s...)，KADBID 005588，小鼠IGκ轻链可变区(TEPC...)。
VL CDR1(SEQ ID NO3)用VL CDR1作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，在100％同一率时未得到命中序列，而在93％(15/16)同一率时获得无数命中序列。前5个序列示于以下KADBID 005720，小鼠IGκ轻链可变区(BW24...)，KADBID 005614，小鼠IGκ轻链可变区(PME7...)，KADBID 005624，小鼠IGκ轻链可变区(C5-7...)，KADBID 005621，小鼠IGκ轻链可变区(40-6...)，KADBID 005640，小鼠IGκ轻链可变区(40-9...)。
VL CDR2(SEQ ID NO4)用VL CDR2作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，未得到命中序列。
VL CDR3(SEQ ID NO5)用VL CDR3作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，在与所述查询序列的同一性为100％时得到1个命中序列KADBID 005681，小鼠IGκ轻链可变区(NC10...)。
S2C6 VH(SEQ ID NO7)用S2C6 VH作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，在与所述查询序列的同一性为100％时未得到命中序列，而在与所述查询序列的同一性为79-85％时获得无数命中序列。前5个命中序列示于以下KADBID 001498，小鼠IG重链可变区(HDEX24)，KADBID 001494，小鼠IG重链可变区(HDEX5)，
KADBID 001529，小鼠IG重链可变区(163.72′CL)，KADBID 001500，小鼠IG重链可变区(HDEX 37)，KADBID 001597，小鼠IG重链可变区(BB128′CL)。
VH CDR1(SEQ ID NO8)用VH CDR1作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，未得到命中序列。
VH CDR2(SEQ ID NO9)用VH CDR作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，在与所述查询序列的同一率为100％时未得到命中序列，而在与所述查询序列的同一率为87-88％时获得10个命中序列。前5个命中序列如下所示KADBID 001535，小鼠IG重链可变区(H10″CL)，KADBID 001534，小鼠IG重链可变区(H81′CL)，KADBID 001533，小鼠IG重链可变区(H50′CL)，KADBID 019741，小鼠IG重链可变区(克隆F′CL)，KADBID 001529，小鼠IG重链可变区(163.72′CL)。
VH CDR3(SEQ ID NO10)用VH CDR3作为查询序列对Kabat数据库进行BLASTP检索，未得到命中序列。
7.实施例S2C6的生物活性7.1材料与方法7.1.1抗-CD40抗体的制备于37℃在含10％胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素的完全IMDM(Gibco-BRL，Grand Island，NY)中培养S2C6杂交瘤。通过离心收获培养物，并通过使用0.2μm滤膜过滤收集上清液。随后将所述上清液上GammaBindTMSepharose柱(Pierce)，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并用0.1M甘氨酸pH2.5洗脱。在洗脱后立即用1M Tris pH8.0中和抗体，透析到PBS中，并除菌过滤。通过大小排阻层析分析单克隆抗体制品。在本文所述的研究中只使用单体蛋白超过99％的样品。
7.1.2人肿瘤异种移植模型得到90只6-8周龄的雌性C.B.-17 SCID小鼠(Taconic Labs，Germantown，NY)，并隔离检疫2周。对照组小鼠静脉内(i.v.)注射人B细胞肿瘤系Ramos(非何杰金氏淋巴瘤)细胞、HS Sultan(多发性骨髓瘤)细胞或IM-9(多发性骨髓瘤)细胞(1×106-2×106细胞)。余下的小鼠被分为两组；一半在注射肿瘤细胞前1天静脉注射200μl 1∶10稀释的抗-脱唾液酸-GM1(Wako Chemicals，Richmond，VA)，以去除宿主天然杀伤细胞(Murphy等，1992，Eur.J.Immunol.22241)。两组小鼠静脉注射Ramos细胞、HS Sultan细胞或IM-9细胞(1×106-2×106细胞)。然后由肿瘤移植后第1天或第5天开始，按照以下的时间表对测试组小鼠腹膜内(i.p.)注射1mg/kg的如7.1.2单元中所述制备的S2C6 IgG，并监测测试组小鼠的部分瘫痪或其它疾病体征。
异种移植模型时间表
7.1.3 外周血B细胞分离使用抗CD19和CD20二者的固定化抗体，通过正选择分离外周血B细胞。经流式细胞仪测定，最终分离的细胞群含有的B细胞超过85％。为了储存，将所述细胞在含10％二甲基亚砜的胎牛血清(FBS)中稀释至4×107细胞/ml，并储存在液氮冷冻装置中。
7.1.4 B细胞增殖测定解冻人外周血B细胞，并在5ng/ml重组人IL-4(Biosource)和各种稀释度的抗-CD40单克隆抗体S2C6、G28-5(Bristol-Myers Squibb)或M3(Genzyme#80-3702-04)存在的情况下，在IMDM培养基+10％FBS中以1×105细胞/孔在96孔组织培养板中温育。作为对照，细胞与IL-4和不相关对照单克隆抗体EXA2-1H8(抗假单胞菌外毒素)温育。该板于37℃温育3天，然后以0.5mCi3H-胸苷/孔脉冲16小时。使用Filtermate 196 HarvesterTM(Packard Instruments)将细胞收获在96孔玻璃纤维滤器上，并与闪烁液混合。使用Topcount LSCTM(Packard Instruments)通过液闪记数检测3H-胸苷掺入到新生DNA中的程度。
将选择用来组成型表达高水平CD40L的Jurkat细胞系(“Jurkat/CD40L”)用作CD40L刺激细胞(Malik等，1996，J.Immunol.1563952-60)。为消除刺激细胞增殖，将它们用丝裂霉素(50mg/ml)的PBS溶液于37℃处理20分钟，接着在PBS中洗涤3次，然后与B细胞混合。将B细胞(1×105细胞/孔)与Jurkat/CD40L细胞混合，如上所述进行测定。首先将B细胞和IL-4与刺激细胞(2.5×104细胞/孔)混合，接着立即加入抗CD40单克隆抗体。用固定浓度的刺激细胞滴定单克隆抗体，或者用固定浓度的单克隆抗体滴定刺激细胞。
7.1.5 CD40/CD40L结合测定在这些测定中使用Jurkat/CD40L细胞系作为靶细胞系。将细胞浓度调节为2×107/ml，每个样品50μl。在RPMI 1640培养基(Gibco)+10％FBS中进行结合。为测定受体饱和度，将Jurkat/CD40L细胞与增加浓度的CD40-Ig(CD40和人免疫球蛋白的可溶性融合蛋白)温育(Noelle等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896550-6554)，洗涤并与缀合抗人免疫球蛋白的异硫氰酸荧光素(“FITC-抗-人Ig”)温育。使用FacScanTM流式细胞仪(Becton Dickinson)评价产生的结合。将重组可溶性CD40-Ig(25μg/ml)在冰上与增加浓度的S2C6单克隆抗体预温育1小时。抗-CD40单克隆抗体G28-5、M3和抗假单胞菌外毒素(一种同种型对照品)被用于比较。可溶性重组人CD40配体(CD154-muCD8)作为与鼠CD8的融合蛋白产生并用FITC标记，该配体得自Research Diagnostics，Inc.(Flanders，NJ)。以4倍终浓度稀释可溶性CD40-Ig和抗-CD40单克隆抗体，在冰上预温育1小时，然后在冰上与Jurkat细胞混合1小时。洗涤细胞，并用FITC-山羊抗人F(ab′)2(Jackson Labs，Fc特异性#109-096-098)标记。通过流式细胞仪测定CD40结合的程度。
7.2结果7.2.1体外研究S2C6单克隆抗体促进CD40/CD40L的相互作用为评价抗CD40单克隆抗体对可溶性CD40与在激活T细胞表面表达的CD40L的结合的影响，将增加浓度的各种CD40单克隆抗体与25μg/ml可溶性CD40-Ig预温育，接着与Jurkat/CD40L细胞的复合体(complex)温育。首先通过流式细胞仪用FITC标记的抗CD40L核实在选择的CD40L+Jurkat T细胞上的CD40L表达(未列出数据)。然后使用FITC-山羊抗人Ig对Jurkat/CD40L细胞进行流式细胞计量，测定结合在这些靶细胞上的CD40L的CD40，以检测结合的CD40-Ig。用CD40-Ig滴定显示受体饱和度约为25μg/ml CD40-Ig。使用饱和浓度的可溶性CD40，S2C6与CD40以0.25-2∶1(质量∶质量)的比率混合，导致CD40与CD40L的结合剂量依赖性增加(在约6μg/ml、13μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的浓度分别为约50％、100％、146％和220％)(图4)。采用抑制性抗体M3的相似滴定以剂量依赖方式阻断CD40/CD40L结合。相对于对照EXA2-1H8 Ig，G28-5单克隆抗体在高至25μg/ml的浓度显示对CD40/CD40L结合没有影响，在测试的最高浓度(50μg/ml)仅具有轻微刺激性。
这些数据清楚表明，S2C6单克隆抗体促进CD40/CD40L相互作用。此外，S2C6在增加CD40/CD40L相互作用的能力方面与G28-5和M3不同。
在交互测定中，评价抗CD40单克隆抗体对可溶性CD40L与在B细胞表面表达的膜结合CD40的结合的影响。用可溶性CD40L滴定显示，Ramos B细胞表面CD40饱和度约为10μg/ml。将增加浓度的各种抗CD40单克隆抗体与表达CD40的B细胞预温育，接着将所述细胞与FITC标记的可溶性CD40L温育。然后通过对Ramos细胞进行流式细胞计量，测定与靶B细胞上的CD40结合的标记CD40L。使用饱和浓度的可溶性CD40L，将浓度范围为0.04-2μg/ml的S2C6单克隆抗体与表达CD40的细胞混合，导致CD40L结合最大增加约51％-68％(图5)。
在以上可溶性CD40的结果中，单克隆抗体G28-5对CD40/CD40L的相互作用几乎没有影响，与其相反，G28-5在所有的测试浓度均显示抑制可溶性配体与CD40的结合。采用抑制性单克隆抗体M3的相似滴定也以剂量依赖方式阻断CD40L/CD40结合。
这些数据表明，S2C6在增加CD40L/CD40相互作用的能力方面令人惊奇地与G28-5和M3不同。而且，在这些条件下，单克隆抗体G28-5和单克隆抗体M3在低至40ng/ml的浓度抑制可溶性CD40L与CD40的相互作用。7.2.2体外研究单克隆抗体S2C6增加B细胞对CD40/CD40L的反应在存在抗CD40单克隆抗体(S2C6、G28-5或M3)的情况下，检测原代外周B细胞对表达CD40L的细胞的生长应答。首先，在存在或不存在固定水平(30ng/ml)的各种单克隆抗体的情况下，将B细胞与增加数目的非增殖性Jurkat/CD40L细胞混合。然后通过在刺激后72小时加入3H-胸苷，检测B细胞对处理的活化反应。存在单克隆抗体M3时滴定T细胞导致B细胞增殖，与对照Ig观察到的相似(图6)。
尽管在没有配体时单克隆抗体G28-5使某些B细胞活化(图7)，但在存在G28-5时CD40L+T细胞滴定仅略微地增加B细胞增殖，超过单独用G28-5观察到的水平1.3倍。相反，在S2C6存在下B细胞增殖随着T细胞刺激细胞数目的增加以剂量依赖方式增加，当B细胞对T细胞刺激物的比率为4∶1时，B细胞增殖增加至仅用单克隆抗体刺激时的3倍以上。
这些数据证明，与M3和G28-5不同，S2C6令人惊奇地可与CD40L协同作用，通过CD40促进B细胞增殖。
在该类型的第二个测定中，或者用抗CD40单克隆抗体滴定B细胞，或者将B细胞与非增殖性CD40L+T刺激细胞以固定比率4∶1(B∶T)混合，并用抗CD40单克隆抗体滴定B细胞(图7)。
这些结果证明，在这些条件下，和单独的G28-5相比，10μg/ml的单克隆抗体G28-5和配体使原始人外周血B细胞的活化增加2倍。S2C6明显更具有活性，与单独的S2C6相比，在配体存在下10μg/ml(最高测试水平)的S2C6以剂量依赖方式使B细胞增殖增加至16.2倍，达到令人吃惊的程度。
总而言之，这些数据表明，S2C6与CD40混合增加CD40L结合。尽管S2C6自身以类似于G28-5的方式刺激B细胞增殖，但S2C6在其增加CD40L结合的能力以及随后的CD40L介导的活化信号强度方面与G28-5不同。
8.实施例单克隆抗体S2C6抑制肿瘤生长为评价天然单克隆抗体S2C6的抗肿瘤活性，将雌性C.B.-17 SCID小鼠分为两组(20只小鼠/组)。每组的一半小鼠用抗-脱唾液酸-GM1处理，以钝化宿主天然杀伤细胞活性(Murphy等，1992，Eur.J.Immunol.22241)。第二天，用Ramos、HS Sultan或IM-9细胞(1×106细胞)静脉内注射小鼠。然后用1mg/kg的如前文第7单元的材料和方法中所述的单克隆抗体S2C6 IgG腹膜内注射小鼠，并监测部分瘫痪或其它疾病发作体征。
用单克隆抗体S2C6治疗患有Ramos人B细胞淋巴瘤(图8A)、HS Sultan多发性骨髓瘤(图8B)或IM-9多发性骨髓瘤(图8C)的动物，明显减小了肿瘤块以及所后的与肿瘤相关的发病率和死亡率。在平行研究中，存在抗-脱唾液酸-GM1时疗效得到维持，提示在单克隆抗体S2C6存在时存活率增加不是缘于非特异性NK细胞的活性。IM-9细胞系是一种类似于多发性骨髓瘤的侵袭性肿瘤模型，该细胞系分泌作为疾病替代标志的人Ig。
用单克隆抗体S2C6治疗患IM-9疾病的小鼠明显增加动物的存活。这些研究清楚显示，S2C6对小鼠中移入的人肿瘤具有有效的抗肿瘤活性。
9.实施例单链抗-CD40免疫毒素融合蛋白结合CD40-Ig在大肠杆菌中以包含体表达BD1-S2C6 sFv(单链抗-CD40免疫毒素，一种由bryodin 1(BD1)的氨基酸序列(Francisco等，1997，J.Biol.Chem.272(39)24165-24169)融合至单克隆抗体S2C6可变区组成的融合蛋白)，使其变性和重折叠。
简而言之，使用TRIZOL试剂(Life Technologies)，按照生产商的建议由S2C6杂交瘤细胞分离总RNA。基本上按照Gilliland等所述(Tissue Antigens，471-20(1996))，使用与J-C接点下游约100个碱基的序列互补的引物，进行轻链可变区和重链可变区的cDNA第一链的合成。然后给所述第一链加聚鸟苷酸尾，并通过使用与聚鸟苷酸尾互补的poly-C锚式引物和将约50个碱基嵌套入用于第一链合成的引物中的引物的PCR进行扩增。设计PCR引物以在PCR产物的5′和3′末端产生独特限制位点。用EcoRI和HindIII消化含有轻链可变区编码序列和重链可变区编码序列的两个PCR产物，并将其连接入已用相同酶消化的pUC19中。获得的质粒pSG5和pSG10包含分别编码S2C6 VL和S2C6 VH的DNA。对两种质粒的DNA测序，并验证其与亲代单克隆抗体的氨基酸末端序列匹配。
按照Gilliland等所述以VH-VL取向将S2C6的VH片段和VL片段“缝合”在一起(重叠延伸PCR)，并连接到克隆载体中。随后通过限制酶消化将BD1-G28-5 sFv的sFv片段(Francisco等，1997，J.Biol.Chem.27224165-24169)从pSE151中去除，并在其原位连接S2C6sFv。获得的质粒pSG40含有在诱导型T7启动子控制下的BD1-S2C6sFv编码基因。
为了表达pSG40，将其转化入感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS细胞中，并在T-肉汤培养基中于37℃培养所述细胞。当培养物达到OD600＝1.0时，用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞3小时。随后，通过离心收获细胞，经超声波裂解，并通过离心分离为不溶性包含体的BD1-S2C6 sFv融合蛋白，如下对其进行变性和重折叠在7M胍中以5mg/ml溶解包含体，通过快速稀释(1∶100)到含0.3M L-精氨酸和2mM DTT的PBS中重折叠，并对20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)透析，以随后纯化。
使用Blue Sepharose随后在固定化CD40-Ig上亲和层析，分离重折叠的蛋白。
然后在ELISA中测试纯化蛋白对固定化CD40-Ig的结合。用0.5μg/ml的CD40-Ig包被微量滴定板，接着在25μg/ml S2C6单克隆抗体(▲)、25μg/ml对照抗体BR96(●)或无过量抗体(■)存在下，加入纯化BD1-S2C6 sFv在含1％牛血清白蛋白和0.05％Tween-20的PBS(pH7.4)中的稀释液。通过加入BD1特异性兔抗血清(Seattle Genetics，Inc.，Bothell，Washington)，接着加入缀合山羊抗兔Ig的辣根过氧化物酶，检测BD1-S2C6 sFv与固定化受体的结合。
加入过量S2C6单克隆抗体完全抑制BD1-S2C6 sFv与CD40-Ig的结合，但加入对照单克隆抗体不能完全抑制BD1-S2C6 sFv与CD40-Ig的结合(图9)。
10.实施例在治疗CD40阳性恶性肿瘤时给予重组S2C6给患CD40阳性恶性肿瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤和结肠癌或其它癌症)的患者注射重组人源化S2C6-抗-CD40单克隆抗体(具有鼠CDR和人构架区)或重组嵌合抗体(包含S2C6可变区和人抗体恒定区)。体外制备重组抗体。治疗可在病程中的任意时间开始，可伴随或不伴随化疗。
治疗方案包括每周注射一次在盐水或其它生理上相容的溶液中稀释的所述药物。
重组S2C6使用的剂量范围为0.1mg/m2(患者的体表面积)至1000mg/m2，优选剂量为100-500mg/m2。
注射途径为通过或外周静脉连线(access line)或中枢静脉连接线静脉内注射。所述药物作为输注液而不是静脉推注给药。
通过检测a)在外周血中的总淋巴细胞数目以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的数目；b)T淋巴细胞(辅助T4淋巴细胞和溶细胞T8淋巴细胞)的体外活性；和/或c)使用诸如计算层析X射线照相术(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描、X射线成像、骨扫描成像和肿瘤活检采样包括骨髓抽提(BMA)的技术检测肿瘤形态学的变化，监测重组S2C6的治疗功效。
根据以上获得的结果，开发最适宜治疗CD40阳性恶性肿瘤的治疗方案，即对免疫系统能力的影响最小，并达到肿瘤消退和完全根除肿瘤细胞的最终目标。
11.微生物保藏根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，1999年5月25日将分泌天然单克隆抗体S2C6的杂交瘤S2C6保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassass，Virginia 20110-2209，指定的的保藏号为PTA-110。
12.具体的实施方案、参考文献的引用本文所述的具体实施方案不限制本发明的范围。实际上，除了本文描述的本发明以外，根据前述和附图对本发明进行各种修改对本领域技术人员而言是显而易见的。这样的修改应包括在所附权利要求书的范围内。
本文引用的各种参考文献，包括专利申请、专利和科学出版物，其公开的内容都通过引用整体结合到本文中。
说明书的核苷酸和氨基酸序列<110>SEATTLE GENETICS，INC.<120>重组抗-CD40抗体及其用途<130>9632-009-228<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>336<212>DNA<213>小家鼠<220><221>CDS<222>(1)..(336)<400>1gat gtt gtg gtg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga 48Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15gct caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt gta cac agt 96Ala Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30aat gga aac acc ttt tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct 144Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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1.一种包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的分子，所述分子(a)免疫特异性地结合CD40，和(b)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在一级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
2.一种包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的分子，所述分子(a)免疫特异性地结合CD40，和(b)不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。
3.权利要求1或2的分子，所述分子含有SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者含有SEQ ID NO7的氨基酸序列，或者既含有SEQ IDNO2的氨基酸序列，也含有SEQ ID NO7的氨基酸序列。
4.权利要求1或2的分子，它是一种抗体。
5.权利要求1或2的分子，它是一种融合蛋白，含有为非抗体的第二种分子的氨基酸序列。
6.权利要求5的分子，它含有融合至SEQ ID NO7或融合至SEQ ID NO2的bryodin(BD1)的氨基酸序列。
7.权利要求1或2的分子，它是一种抗体，包含由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6的可变区和人恒定区。
8.权利要求1-4中任一项的分子，该分子是纯化的。
9.一种纯化的蛋白，它含有的氨基酸序列与SEQ ID NO2或SEQ ID NO7具有至少95％的同一性，所述蛋白(a)免疫特异性地结合CD40；和(b)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
10.一种纯化的蛋白，所述蛋白(a)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(b)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(c)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
11.一种纯化的蛋白，所述蛋白(a)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(b)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(c)不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。
12.一种分离的核酸，它含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14或SEQ ID NO15。
13.一种分离的核酸，它含有编码含SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的蛋白的核苷酸序列。
14.权利要求13的分离的核酸，它含有编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白包含(a)由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6的重链可变区，和(b)人恒定区。
15.一种分离的核酸，它含有编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白包含的氨基酸序列与SEQ ID NO2或SEQ ID NO7具有至少95％的同一性。
16.一种包含编码蛋白的核苷酸序列的分离的核酸，所述蛋白与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，并且所述蛋白增加CD40配体与CD40的结合至少45％。
17.一种包含编码融合蛋白的核苷酸序列的分离的核酸，所述融合蛋白包含融合至SEQ ID NO7或SEQ ID NO2的bryodin 1(BD1)的氨基酸序列。
18.一种分离的核酸，它在高严格条件下与由编码DNA序列组成的DNA的反向互补物杂交，所述编码DNA序列对由选自SEQ IDNO2和SEQ ID NO7的氨基酸序列组成的蛋白进行编码，所述分离的核酸编码免疫特异性结合CD40的蛋白。
19.一种重组细胞，它含有的重组核酸载体包含编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，并且所述蛋白增加CD40配体与CD40的结合至少45％。
20.一种重组细胞，它含有的重组核酸载体包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO6、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14或SEQ ID NO15。
21.一种生产蛋白的方法，该方法包括(a)培养包含编码蛋白的重组核苷酸序列的细胞，所述蛋白与保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，并且所述蛋白增加CD40配体与CD40的结合至少45％，以使所述蛋白由所述细胞表达；和(b)回收所表达的蛋白。
22.一种生产蛋白的方法，该方法包括(a)培养包含编码蛋白的重组核苷酸序列的细胞，所述蛋白包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10，以使由所述核苷酸序列编码的蛋白由所述细胞表达；和(b)回收所表达的蛋白。
23.一种药用组合物，它包括(a)包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一种分子，其量可有效治疗或预防癌症，所述分子(i)免疫特异性结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入；和(b)一种药学上可接受的载体。
24.一种药用组合物，它包括(a)一种治疗或预防癌症有效量的纯化蛋白，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入；和(b)一种药学上可接受的载体。
25.一种药用组合物，它包括(a)一种治疗或预防癌症有效量的纯化蛋白，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生；和(b)一种药学上可接受的载体。
26.一种药用组合物，它包括(a)包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一种分子，其量可有效激活或增强免疫应答，所述分子(i)免疫特异性结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入；和(b)一种药学上可接受的载体。
27.一种药用组合物，它包括(a)一种纯化蛋白，其量可有效激活或增强免疫应答，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入；和(b)一种药学上可接受的载体。
28.一种药用组合物，它包括(a)一种纯化蛋白，其量可有效激活或增强免疫应答，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生；和(b)一种药学上可接受的载体。
29.权利要求23-28中任一项的药用组合物，它还含有CD40配体。
30.一种在患者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括给予所述患者一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一种分子，其量可有效治疗或预防癌症，所述分子(i)免疫特异性结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
31.一种在患者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括给予所述患者一定量的一种纯化蛋白，其量可有效治疗或预防癌症，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
32.一种在患者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括给予所述患者一定量的一种纯化蛋白，其量可有效治疗或预防癌症，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。
33.一种激活或增强患者的免疫应答的方法，该方法包括给予所述患者一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一种分子，其量使得所述患者的免疫应答被激活或增强，所述分子(i)免疫特异性结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
34.一种在患者中激活或增强免疫应答的方法，该方法包括给予所述患者一定量的一种纯化蛋白，其量使得所述患者的免疫应答被激活或增强，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
35.一种在患者中激活或增强免疫应答的方法，该方法包括给予所述患者一定量的一种纯化蛋白，其量使得所述患者的免疫应答被激活或增强，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。
36.一种在患者中治疗或预防免疫疾病的方法，该方法包括给予所述患者一定量的包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的一种分子，其量可有效治疗或预防免疫疾病，所述分子(i)免疫特异性结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
37.一种在患者中治疗或预防免疫疾病的方法，该方法包括给予所述患者一定量的一种纯化蛋白，其量可有效治疗或预防免疫疾病，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的天然单克隆抗体S2C6相比，在初级氨基酸序列中包含一个或多个取代或插入。
38.一种在患者中治疗或预防免疫疾病的方法，该方法包括给予所述患者一定量的一种纯化蛋白，其量可有效治疗或预防免疫疾病，所述蛋白(i)与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，(ii)使CD40配体与CD40的结合增加至少45％，和(iii)不是由杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6，且不是由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割S2C6产生。
39.权利要求30-38中任一项的方法，该方法还包括给予所述患者CD40配体。
40.权利要求30-38中任一项的方法，其中所述患者是人。
41.权利要求4的抗体，它不是同种型IgG1。
42.一种人类以外的转基因动物、转基因植物或包含一种或多种编码蛋白的转基因的分离细胞，所述蛋白与杂交瘤(保藏于ATCC，指定的保藏号为PTA-110)分泌的单克隆抗体S2C6竞争结合CD40，并且所述蛋白使CD40配体与CD40的结合增加至少45％。
43.一种药用组合物，它包含(a)免疫特异性结合CD40的一种分子，所述分子增加CD40配体与CD40的结合；(b)CD40配体；和(c)一种药学上可接受的载体，它们的量可有效治疗或预防癌症或免疫疾病，或可有效激活或增强免疫应答。
44.一种在患者中治疗或预防癌症或免疫疾病的方法，该方法包括给予所述患者(a)免疫特异性结合CD40的一种分子，所述分子增加CD40配体与CD40的结合；和(b)CD40配体，它们的量对所述治疗或预防有效。
45.权利要求44的方法，其中所述方法是用于治疗癌症。
46.权利要求30-32和45中任一项的方法，其中所述癌症为实体瘤。
47.权利要求36-38中任一项的方法，其中所述免疫疾病为类风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及预防和治疗癌症、炎症性疾病和免疫系统疾病或缺陷的方法和组合物。本发明的方法包括给予增强CD40与CD40配体结合的CD40结合蛋白。
文档编号C07K19/00GK1369015SQ00811357
公开日2002年9月11日 申请日期2000年6月8日 优先权日1999年6月8日
发明者C·B·西加尔, A·F·瓦尔, J·A·弗兰西斯科, 小H·P·菲尔 申请人:西雅图基因公司