专利名称：基于重组ul51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法
技术领域：
本发明涉及动物医学领域，特别涉及基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方 法。
背景技术：
鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等 水禽的一种高度致死性传染病，在世界各养鸭地区都有分布，其预防和控制已直接关系到 水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效 生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程 序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法主要有中和试验(neutralization test，NT)、 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、 Dot-ELISA测定法和被动血凝试验。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理 想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、 易于操作等特点，是DPV感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段；但是，由于DPV全 病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA) 的大规模应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的鸭瘟病毒抗 体检测方法，该方法避免了繁琐的病毒纯化步骤，且操作简单，特异性、灵敏性较高。为实现上述目的，本发明的技术方案为基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，具体步骤为a固相抗原的制备将包被浓度大于或等于2. 5μ g/ΙΟΟμ L的重组UL51蛋白液与 固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b 一抗结合将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通 过保温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去 除固相载体上杂质；c 二抗结合将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将 所述酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合，得抗原_抗体_ 二抗复合物；d显色在步骤c所得抗原_抗体_ 二抗复合物中加入色原底物避光显色后，加入 终止液终止反应得显色样品液；e检测及结果判定将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD45tlnm值，当OD45tlnm值 > 0. 216时判为阳性，当OD45tlnm彡0. 216时判为阴性。进一步，所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于，具体 步骤为a固相抗原的制备将包被浓度等于2. 5μ g/ΙΟΟμ L的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b 一抗结合将待检血清作等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反 应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂 质；c 二抗结合将酶标二抗作等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二 抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原_抗体_ 二抗复合物；d显色在步骤c所得抗原_抗体_ 二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终 止液终止反应得显色样品液；e检测并判定将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 216为阳性，所述OD450nm彡0. 216则为阴性；进一步，步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述 酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μ L ；进一步，步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP ；进一步，步骤a中所述的封闭液为体积百分浓度为的牛血清白蛋白溶液；进一步，步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺；进一步，步骤d中避光显色的时间为20分钟；进一步，所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。本发明的有益效果在于本发明基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法， 其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)和鸭大肠杆菌(E.coli)的 阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法对批内或批间重复试验显示变异系数均小于 10%，能检出经1 3200倍稀释的DPV阳性血清。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图I-A为DPV UL51基因的PCR扩增M指DL2000相对分子质量标准；1指以正常 DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩 增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp)；图I-B为重组质粒pMD18-UL51的双 酶切鉴定M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶 切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图I-C为重组表达载体 pET28a-UL51的双酶切鉴定M指相对分子质量标准III ； 1指重组表达载体pET28a_UL51，2 指重组表达载体pET28a-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片 段的分子量大小约为760bp)。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定M为蛋白质相对分子质量标准；1为阴性 对照(未加IPTG诱导)；2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD)；图2-B 为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果1-7的IPTG浓度分别为0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0 和1. 2mmol/L ；图2-C为不同温度诱导pET28a_UL51表达结果1_3的温度分别为20、30和 37°C ；图2-D为不同时间诱导pET28a-UL51表达结果1_8的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、 7 和 8h。
图3为重组UL51蛋白的检测(a) SDS-PAGE分析M为蛋白标准(KD) ；1为发酵培 养的全菌液；2为包涵体洗涤法纯化的重组UL51蛋白；3为透析复性后的重组UL51蛋白； (b) Western blotting分析1是以兔抗DPV抗体为一抗检测重组UL51蛋白(约为34KD)。图4为敏感性试验检测结果。图5为特异性试验结果。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选 实施例进行详细的描述。本实施例首先对所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达 质粒pET28a-UL51、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀， 再通过超声波破碎菌体、重组UL51蛋白包涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的；同时，用 Westernblotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应；进一步确定 了重组UL51蛋白的包被浓度及一抗、二抗的稀释度，从而制备了鸭瘟病毒抗体检测方法。实施例基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及UL51蛋白的纯化1、材料方法以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1. 1菌株、质粒和毒株质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET28a(+)，Novagen 公司产品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由 四川农业大学禽病研究中心提供。1. 2试验鸭胚和血清10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；兔抗DPV抗体，由四川农业大学禽病研 究中心提供。1. 3主要试剂琼脂糖、2X傻瓜PCRMix、DNA连接酶Mix、限制性内切酶EcoRI和Xhol、 UltraPure 质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPureTMDNA回收试剂盒等分子生物学试剂及 试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad 公司；其它试剂均为分析纯，购自上海生工生物技术有限公司。2实验方法2. IDPV UL51 基因的克隆2. 1. 1引物设计利用Primer Premier5. O 软件，参考 UL51 基因序列(GenBank 登录号DQ072725)， 由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-UL51F 5’-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3，(划线部分为 EcoRI 位点)引物 DPV-UL51R :5，-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3，(划 线部分为XhoI位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20°C
保存备用。
2. 1. 2DPV基因组DNA的提取2. 1. 2. IDEF的制作方法取IOd日龄健康鸭胚，分别用5%碘酒和75%酒精消毒 蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲 洗后将胚体剪成Imm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分 数为2.5%的胰蛋白酶)15(^1/胚，于371水浴中消化31^11。立即将细胞悬液以4000r/ min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入 10%小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于IOOmL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37°C 细胞培养箱中进行培养。2. 1. 2. 2DPV增殖取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细 胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3mL覆盖细胞表面进行吸附，37°C吸附120min后弃病 毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37°C培养。同时做 未接毒的DEF对照。2. 1. 2. 3DNA提取方法直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下 ⑴选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60% 70%的DEF (IOOmL细胞瓶)；同时选 取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500 μ L的细胞裂解液，同时加 蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200 μ g/mL，轻轻混勻后，37°C孵育IOmin ； (3)将细胞悬浮 液倒入EP离心管中，并用500 μ L的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中； (4)用饱和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/ L NaAC,混勻后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min离心 20min,沉淀用预冷的70 %乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1 μ L RNA酶，37°C作用30min，_20°C保存备用。2. 1. 3PCR 扩增 DPV UL51 基因PCR反应体系为
权利要求
1.基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征在于，具体步骤为a固相抗原的制备将包被浓度大于或等于2. 5 μ g/100 μ L的重组UL51蛋白液与固相 载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b 一抗结合将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保 温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固 相载体上杂质；c 二抗结合将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述 酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合，得抗原_抗体_ 二抗复合物；d显色在步骤c所得抗原_抗体_ 二抗复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止 液终止反应得显色样品液；e检测及结果判定将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD45tlnm值，当OD45tlnm值> 0. 216时判为阳性，当OD45tlnm彡0. 216时判为阴性。
2.根据权利要求1所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗的体检测方法，其特征在 于，具体步骤为a固相抗原的制备将包被浓度等于2. 5 μ g/100 μ L的重组UL51蛋白液与固相载体连 接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；b 一抗结合将待检血清作等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所 述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；c 二抗结合将酶标二抗作等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀 释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原_抗体_ 二抗复合物；d显色在步骤c所得抗原_抗体_ 二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液 终止反应得显色样品液；e检测并判定将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 216 为阳性，所述OD45tlnm ( 0. 216则为阴性。
3.根据权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征 在于步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀 释液的加入量为等体积且大于或等于100 μ L。
4.根据权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征 在于步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP。
5.根据权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征 在于步骤a中所述的封闭液为体积百分浓度为的牛血清白蛋白溶液。
6.根据根据权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其 特征在于步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺。
7.根据权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征 在于步骤d中避光显色的时间为20分钟。
8.根据权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征 在于所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。
全文摘要
本发明涉及动物医学领域，特别涉及用于检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体包括固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色及检测并判定等步骤，本方法是基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法的批内或批间重复试验显示变异系数均小于10％，能检出经1∶3200倍稀释的DPV疫苗免疫鸭阳性血清。
文档编号C12N15/38GK102004150SQ201010299560
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者汪铭书, 沈婵娟, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心