一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法

一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒，所述检测试剂盒包括：1)重组乙型肝炎病毒X蛋白；2)HBx蛋白抗体阴、阳性对照品；3)酶标记结合物；4)显色底物；以及5)浓缩洗涤液。本发明的试剂盒检测灵敏度高，检测耗时短，有助于尽早地诊断肝癌患者，及时治疗，提高生存率。并且，与仅检测AFP标志物相比，在检测AFP标志物的同时采用本发明的试剂盒检测HBx蛋白抗体可显著提高肝癌的诊断敏感性。
【专利说明】一种抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其 制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体涉及检测肝癌标志物乙型肝炎病毒X蛋 白（HBx)抗体的试剂盒。

【背景技术】
[0002] 人体我国每年约有11?13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。 近年来，通过提高肝癌早期诊断率、改进肝癌切除方法和实施肝移植等手段，我国部分肝癌 高发地区的死亡率有所下降，但是肝癌总体的发病率仍然呈上升趋势。
[0003] 目前，影像学诊断、细胞与组织学诊断及化学诊断是肿瘤诊断的三大主要方法。影 像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一 定的局限。超声检查或CT阳性结果，结合血清甲胎蛋白（a-fetoprotein，AFP)水平高于 400ng/ml的检测结果，可对肝癌做出确诊。但是，通常当这些条件都符合时，己经错过了治 疗的最佳时机。无论是超声波检查、CT扫描还是核磁共振，对小病灶的鉴定都有一定的局 限性，尤其是肝硬化结节在影象学上与小肝癌结节有许多的相似之处。因此，虽然影像学技 术在今年来取得了巨大的进步，但临床上仍需结合肝癌的分子标志物，在较为复杂的病例 中将良恶性肝病进行区分。
[0004] 目前肝癌诊断最常用的标志物是甲胎蛋白（AFP)，在症状和影像学改变发生前数 月即可出现异常。正常人血清中AFP含量一般小于10ng/ml。当AFP的诊断值定为20ng/ ml时，其敏感性为50 % -60 %，但在肿瘤较小的病例中，敏感性显著降低，有报道仅为40 %。 单独使用AFP作为肝癌诊断标志物的另一个问题是缺乏特异性，在相当多的慢性肝炎患者 尤其是肝硬化患者中，AFP含量也达20-200ng/ml。目前认为可与AFP互补诊断的标志物有 AFP异质体、Y -谷氨酞转移酶同工酶II和异常凝血酶原等，但由于它们在敏感性和特异性 上的不足，以及检测方法的繁琐复杂，使其始终停留在实验室研究水平，未能转化成临床常 规检查项目。因此，探索新的肿瘤分子标志物，以及建立相应的易于推广的检测方法，仍是 当今肝癌研究领域的重要课题之一。
[0005] 随着对HBV和原发性肝癌研究的深入，人们发现HBV中的X基因表达产物（HBx) 在肝癌形成过程中起着关键的作用。在诱发肝细胞癌的众多因素中，乙型肝炎病毒感染占 到50%以上。最新的研究显示，HBx具有广泛的基因转录调控作用，与慢性HBV感染者发展 成为HCC密切相关。X基因位于HBV基因组的1374-1836位置，编码155个氨基酸的多肽， 即HBx。X基因常随HBV基因组一同整合于肝细胞的染色体中，利用宿主细胞转录和翻译 体系合成HBx。HBx具有广泛的基因转录调控作用，不仅能够激活病毒基因调控序列，而且 能够与宿主细胞多种蛋白相互作用，从而影响宿主细胞周期、影响细胞增殖分化与凋亡、使 肝细胞发生恶性转化。HBx可与转录因子XPA-1、DDB1、RPB5和TFIIB结合，以提高基因转 录水平、抑制DNA的修复、促进病毒自身复制；HBx还具有反式激活作用，可上调多种细胞因 子及其受体，如血管内皮生长因子（VEGF)、胰岛素样生长因子（IGF)及其受体的表达；激活 C-myt、N-ras等癌基因，与抑癌基因 p53结合，抑制P53的核转移及正常的转录调节功能。 此外，HBx还可上调Η印G-2的细胞端粒酶活性，改变抑癌基因 p55负调控功能，抑制细胞凋 亡，四细胞发生恶性转化，与HCC的发生密切相关。近几年国外研究显示，在HBV感染后约 60%肝癌患者血清中可检测到HBx抗体。血清HBx抗体水平可能成为一种新型的肝癌标志 物。
[0006] 目前，免疫分析技术在乙型肝炎病毒X蛋白抗体免疫分析产品的应用方面仍未 见。因此，本领域迫切需要开发可灵敏检测乙型肝炎病毒X蛋白抗体的检测系统及检测方 法，为临床肿瘤的诊断提供良好的途径。


【发明内容】

[0007] 本发明提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测乙型肝炎病毒X蛋白抗体的 试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。
[0008] 本发明提供了一种抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制 备方法。
[0009] 该抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒包括：1)重组乙型肝炎病毒X 蛋白；2)抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品；3)酶标记结合物；4)显色底物；5)浓 缩洗漆液。
[0010] 在本发明中，重组乙型肝炎病毒X蛋白包含至少一个乙型肝炎病毒X蛋白的抗原 表位，以便结合于抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗体。该重组乙型肝炎病毒X蛋白可进一步含 有乙型肝炎病毒X蛋白的全长或部分氨基酸序列，以增加特异性免疫反应。并且各个该乙 型肝炎病毒X蛋白的抗原表位之间、各个该乙型肝炎病毒X蛋白的部分氨基酸序列之间以 及乙型肝炎病毒X蛋白的抗原决定位与乙型肝炎病毒X蛋白的部分氨基酸序列之间可进 一步由连接片段连接。在本发明的一个实施例中，重组乙型肝炎病毒X蛋白序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 理想的固相载体应与重组乙型肝炎病毒X蛋白有较高的结合容量，且结合稳定极 少脱落；并且其可结合抗原或抗体免疫反应物，以及如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白 质；重组乙型肝炎病毒X蛋白固相化后仍应保持活性，而且为有利于反应充分进行，最好其 活性基团朝向反应溶液；此外，固相化方法应简便易行、快速经济。在本发明中，固相载体 可以采用塑料制品，使得重组乙型肝炎病毒X蛋白可通过非共价或物理吸附机制结合到固 相载体表面，比如：聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板。固相载体也可以采用微颗 粒，此类固相载体系由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米（μ m)，由于带有 能与蛋白质结合功能团（如一 NH2、一 C00H、一 0H、一 CH0或一 NH - NH2等），易与抗体（抗 原）形成化学偶联，且结合容量大。并且，固相载体还可以采用膜载体，包括硝酸纤维素膜 (nitrocellulose, NC)玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。优选地，在本发明的一个实施 例中，包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体为微孔板。
[0012] 在本发明中，酶标记结合物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记 结合物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。优选地，酶 标记结合物为酶标记抗体，其将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。更优选地，酶标记结 合物为辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AP)、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、溶菌酶和 苹果酸脱氢酶等。进一步优选地，酶标记结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检 测抗体。
[0013] 在本发明中，显色底物可以是易于配制、保存且产生的信号产物易于观察和检测 并且对人无害且价廉、易得等特点的任何显色底物。优选地，显色底物为邻苯二胺（0PD)、四 甲基联苯胺（TMB)和对硝基苯磷酸酯（p-NPP)。更优选地，显色底物为3, 3'，5, 5' -四甲基 联苯胺。
[0014] 在本发明中，还提供了抗乙型肝炎病毒X (HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒在 检测抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体中的应用。
[0015] 在本发明中，又提供了抗乙型肝炎病毒X (HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒在 制备用于肝癌诊断的试剂盒中的应用。
[0016] 此外，本发明还进一步提供了一种制备抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免 疫测定试剂盒的方法，包括以下步骤：1)通过原核载体表达重组乙型肝炎病毒X蛋白；2) 制备包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体；3)以抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、 阳性血清制备对照品；4)以酶标记检测抗体；5)配制显色底物；6)配制浓缩洗涤液；7)分 装所述抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品、酶标记结合、显色底物及浓缩洗涤液； 8)组装为成品。
[0017] 其中，制备包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体的步骤2)采用以下方 法：1)包被：用〇. 02M PH值为8. 5的磷酸缓冲液配制成所需浓度的所述重组乙型肝炎病毒 X蛋白包被液，并将包被液负载于固相载体上；2)封闭：用含5%酪蛋白或5%脱脂奶粉PH 值为6. 8-7. 3,浓度为0. 01M的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭所述固相载体。
[0018] 在本发明中，优选地，包被重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体为微孔板、 塑料珠、塑料管；酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体；显色底物为 3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺。
[0019] 本发明的抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒采用间接酶联免 疫分析法，检测HBx抗体。样品中的抗体首先被包被于微孔板上的乙型肝炎病毒重组抗原 捕获，在洗掉样品的其它部分，再加入辣根过氧化物酶（HRP)标记的羊抗人抗体，就可以形 成标记物复合物，洗板加入显色液A、显色液B以及加入终止液后，用酶联免疫分析仪测量 吸光值，吸光值与样本中抗体浓度呈正相关，与临界值相比较，从而判断阴阳性。
[0020] 为了提高本发明的抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒的性能 稳定性，本发明首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗 体的活性、载体（微孔板）的吸附性能和变异大小、酶的活性、显色底物的灵敏度及稳定性 等，从而提高本发明的试剂盒的灵敏度和稳定性。并且还对包被方法进行了研究，用不同的 包被缓冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗原不同包被 浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比 实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了 长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。本发明对试剂盒 的各个组件进行了优化，使得试剂盒在应用中每个步骤都发挥最优的效果，综合上提高试 剂盒特异及高效的检测效果。
[0021] 本发明的HBx抗体免疫分析测定试剂盒可以非常专一地检测出感染乙型肝炎病 毒后人体中的HBx抗体，可以根据HBx抗体变化情况判断治疗效果及其病情的变化。它具 有简便、快速、灵敏、稳定等优点。且根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需 要昂贵的全自动分析仪，更能适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供 一种非常有价值的检测手段。
[0022] 此外，本发明还证实了 HBx抗体与AFP在肝癌中表达无相关性。因此，可以采用本 发明的试剂盒和HCC肿瘤标记物AFP二者联合检测，并且通过本发明的实施例证实二者联 合检测能够将敏感性提高到75. 95%，漏诊率降至24. 05%。因此，本发明在作为新型肝癌 检测手段的同时，还可以通过肿瘤标志物的联合应用能提高肝癌的检出率，是解决AFP假 阳性和假阴性问题的有效途径，是肝癌血清学诊断方法发展的必然趋势。
[0023] 此外，本发明还提供了一种用于肝癌诊断的定量检测试剂盒，包括相互独立的抗 乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检测单元和甲胎蛋白定量检测单元。在本发明中，可以分别 采用抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检测单元和甲胎蛋白定量检测单元对样品进行检测， 从而提高肝癌的检出率，解决AFP假阳性和假阴性问题。
[0024] 在本发明的一个实施例中，抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检测单元可以至少包 括包被抗乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体和抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品；甲 胎蛋白定量检测单元可以至少包括包被甲胎蛋白抗体的固相载体和甲胎蛋白阴、阳性对照 品。其中，抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检测单元还可以包括酶标记结合物、显色底物和 浓缩洗涤液。甲胎蛋白定量检测单元还可以包括酶标记结合物、显色底物和浓缩洗涤液。通 过抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检测单元定量检测抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体，判断肝 癌阳性的情况，并通过甲胎蛋白定量检测单元定量检测甲胎蛋白，判断肝癌阳性的情况。由 于HBx抗体与AFP在肝癌中表达无相关性，因此二者联合检测能够最终提高肝癌的检出率， 解决AFP假阳性和假阴性问题。
[0025] 其中，所述抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检测单元可以是如权利要求1-4所述 的抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒。
[0026] 在本发明中，还提供了用于肝癌诊断的定量检测试剂盒在制备用于肝癌诊断的免 疫测定试剂盒中的应用。
[0027] 本发明证实了 HBx抗体与AFP在肝癌中表达无相关性。因此，可以采用本发明的联 合检测试剂盒对HBx抗体与AFP二者联合检测，并且能够提高肝癌诊断的敏感性，解决AFP 假阳性和假阴性问题。本发明的联合检测试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。且根 据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动分析仪，更能适合广大 的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1示出纯化HBx的SDS-PAGE图。
[0029] 图2示出HBx抗体浓度与吸光度线性关系。

【具体实施方式】
[0030] 以下通过实施例并结合附图来进一步详细说明本发明，但不用来限制本发明的范 围。
[0031] 实施例ΙΗΒχ重组蛋白诱导表达和纯化
[0032] HBx的诱导表达：将已转化了含有HBx蛋白的PET-30a_X重组质粒的菌体挑单菌 落接种于15ml含卡那抗性的LB溶液中，37°C振荡培养过液。次日，取10ml菌液转种于 1000ml卡那抗性的LB培养液中，37°C继续振荡培养约2-3小时。当0D_达到0. 4-0. 6之 间时，加入200mg/ml的IPTG 583μ 1，继续培养4小时以上。
[0033] 其中，HBx 重组蛋白的氨基酸序列（SEQ ID No. 1)为：MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAE SRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLS AMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA 〇
[0034] HBx融合蛋白的纯化：8000r/min，10分钟离心收集经过IPTG诱导表达的菌体于 50ml离心管中，倒去上清，用30ml洗涤缓冲液（缓冲液A)洗涤沉淀。洗涤两次后，10000r/ min离心约10分钟，冰上超声破碎菌体，再离心，收集上清。沉淀即为包涵体，用于下一步的 处理。
[0035] 取适量的包涵体制备过程中的上清和包涵体沉淀，用2XSDS-PAGE缓冲液进行 SDS-PAGE电泳。用考马斯亮蓝染色，确定目的蛋白位置。
[0036] 包涵体的溶解：取部分制备好的包涵体沉淀，称湿重。每克菌体加入5ml缓冲液B， 于室温轻轻混合，降低粘稠度，直至液体变透明状为止。离心除去残余的细胞碎片，取上清。 置于冰上或-20°C保存。
[0037] 亲和层析纯化HBx融合蛋白：采用PET系统表达出带6个组氨酸标记的融合蛋白 是以包涵体形式存在，所以需在变性条件下用Ni-NTA树脂从包涵体中纯化带His-Tag的融 合蛋白。
[0038] 1)取4ml制得的包涵体的溶液，加入1ml 50%的Ni-NTA树脂，室温轻轻混合约30 分钟。将以上混合液轻轻转移至一个空的层析柱管中。
[0039] 2)除去柱管的底帽，收集流出液体，留待SDS-PAGE检测。
[0040] 3)用4ml缓冲液C清洗2次，收集每一次流出液体，留待SDS-PAGE检测。
[0041] 4)用0. 5ml缓冲液D清洗4次，取样留待SDS-PAGE检测。
[0042] 5)最后，用0. 5ml缓冲液E清洗4次，取样留待SDS-PAGE检测。
[0043] SDS-PAGE电泳：用SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，通过对凝胶的 扫描，检测纯化出蛋白的纯度。
[0044] 通过SDS-PAGE电泳判断（图1)，将HBx重组载体在宿主菌中进行了高效表达。经 过镍柱亲和层析纯化并透析复性脱盐，得到高纯度的HBx，纯度可达95%以上。
[0045] 实施例2制备本发明的HBx抗体免疫分析测定试剂盒
[0046] 在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和 质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体（微孔板）的吸附性能和变异大小、酶的 活性、显色底物的灵敏度及稳定性等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和 保护液进行实验，选择出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗原不同包被浓度实验找到 最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到 了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实 验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。
[0047] 一、酶标抗体制备
[0048] 捕获抗体用高碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联，用PBS充分透析，加等体积甘 油，-20°C以下保存。
[0049] 二、HBx抗体阴、阳性对照品的制备
[0050] 混合6份以上经western blot检测HBx抗体阳性血清或阴性血清，经HIV、TP以 及HCV抗体测定均为阴性血清，60°C灭活1小时，过滤除菌、适度稀释、分装，低温冻存。
[0051] 三、固相包被板的制备
[0052] (1)包被：将纯化的HBx用50mmol/L碳酸盐缓冲液稀释，稀释至12 μ g/ml，然后加 入包被板条各孔内，37°C放置1?2小时后2?8°C过夜,甩干；
[0053] ⑵封闭：按150 μ 1/孔用含5%酪蛋白或5%脱脂奶粉的PH7. 4的磷酸盐缓冲液， 37°C封闭1小时，甩干；
[0054] (3)保护：按150 μ 1/孔用含20%蔗糖的PH7. 4的磷酸盐缓冲液室温保护3小时；
[0055] (4)干燥：置干燥室干燥后，按48?96孔/包来装入含干燥剂的包装袋中，封口 并冷藏备用。
[0056] 四、酶标抗体浓度选定
[0057] 酶标抗体稀释液：为硼砂1. 43049、硼酸5. 25649、小牛血清200ml、甘油20ml、 Proclin3001ml，双蒸水溶解，定溶 1000ml。
[0058] 采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度1:10000。
[0059] 五、试剂配制
[0060] (1)浓缩洗涤液：含 1 % Tween-20 的 PH7. 4Tris-HCl 缓冲液；
[0061] ⑵样品稀释液：以三蒸水配内含0. 5%?2% BSA的PH7. 4磷酸盐缓冲液；
[0062] (3)酶标工作液：以三蒸水配PH7. 2的磷酸盐缓冲液，内含0. 5%?2% BSA ;0. 5% 酶保护剂；〇. 05% PiOclin-300及以0. 1% Tween-20,以适当的浓度稀释冻存标记的酶；
[0063] (4)显色剂A :以三蒸水配PH 5. 0醋酸盐缓冲液，内含0. 05%过氧化脲；
[0064] (5)显色剂B :用甲醇配0. 16%四甲基联苯胺，溶解后对倍加甘油；
[0065] (6)终止液：以三蒸水配2mol/L硫酸溶液；
[0066] (7)阳性对照：取筛出的阳性血清（0D彡0· 500)加少量红色染料并按1000单位/ ml加青霉素和链霉素，无菌过滤；
[0067] (8)阴性对照：取筛出的阴性血清（0D < 0. 100)，按1000单位/ml加青霉素和链 霉素，无菌过滤。
[0068] 六、半成品及成品组成
[0069] 按每盒1包48?96孔/包的抗原预包被条、1瓶浓缩洗涤液、1瓶样品稀释液、1 瓶酶结合物工作液、1瓶显色剂A、1瓶显色剂B、1瓶终止液、1瓶阳性对照、1瓶阴性对照和 1份使用说明书组装。
[0070] 上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定 性检定合格才能组装成HBx抗体测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
[0071] 实施例3本发明试剂盒的使用方法
[0072] 以上实施例2制备的HBx抗体测定试剂盒的具体操作如下：
[0073] (1)洗涤液：浓缩洗液以1: 20稀释作为工作洗涤液备用；
[0074] (2)将试剂及所需数量的微孔反应条置室温平衡；
[0075] (3)吸取100μ 1乙型肝炎病毒HBx抗体阴阳性对照品及待检样本，按顺序加入微 孔反应条小孔中并加贴封片；
[0076] (4) 37 °C水浴孵育30分钟；
[0077] (5)在第一次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条 放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液200 μ 1，再吸干各孔，重复以上洗涤5次，最后一次 将微孔反应条拍干；
[0078] (6)每孔中加入100 μ 1标记物工作液，并加贴封片；
[0079] (7) 37 °C水浴孵育30分钟；
[0080] (8)第二次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放 入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液200 μ 1，再吸干各孔，重复以上洗涤6次，最后一次将 微孔反应条拍干；
[0081] (9)每孔加显色液Α -滴（约50 μ 1),加显色液Β -滴（约50 μ 1)。封板膜封板 后37 °C避光显色10分钟；
[0082] (10)每孔加终止液一滴（约50 μ 1)，终止反应。用空白孔调零，于450nm波长（建 议使用双波长，参考波长为620nm)酶标仪上读取0D值；
[0083] (11)与临界值比较后判断结果。
[0084] 实施例4本发明试剂盒的方法学鉴定
[0085] 按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例2中制备的试剂盒进行检定，见下 表1:
[0086] 表1 HBx抗体检测试剂盒性能分析
[0087]

【权利要求】
1. 一种抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒，包括： 1) 重组乙型肝炎病毒X蛋白； 2) 抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品； 3) 酶标记结合物； 4) 显色底物； 5) 浓缩洗涤液。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重组乙型肝炎病毒X蛋白序列如SEQ ID No. 1 所示。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相 载体为微孔板。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶或 碱性磷酸酶标记的检测抗体。
5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色底物为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯 胺。
6. 权利要求1-5任一项所述的试剂盒在检测抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体中的应用。
7. 权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备用于肝癌诊断的试剂盒中的应用。
8. -种制备权利要求1-5所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 通过原核载体表达重组乙型肝炎病毒X蛋白； 2) 制备包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体； 3) 以抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性血清制备对照品； 4) 以酶标记检测抗体； 5) 配制显色底物； 6) 配制浓缩洗涤液； 7) 分装所述抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、阳性对照品、酶标记结合、显色底物及浓缩 洗涤液； 8) 组装为成品。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，制备包被所述重组乙型肝炎病毒X蛋白的固 相载体的步骤2)采用以下方法： 1) 包被：用〇. 02M PH值为8. 5的磷酸缓冲液配制成所需浓度的所述重组乙型肝炎病 毒X蛋白包被液，并将包被液负载于固相载体上； 2) 封闭：用含5%酪蛋白或5%脱脂奶粉PH值为6. 8-7. 3,浓度为0.01M的磷酸盐缓冲 液作为封闭液封闭所述固相载体。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述包被重组乙型肝炎病毒X蛋白的固相 载体为微孔板、塑料珠、塑料管。
11. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标 记的检测抗体；所述显色底物为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺。
12. -种用于肝癌诊断的定量检测试剂盒，包括相互独立的抗乙型肝炎病毒X蛋白抗 体定量检测单元和甲胎蛋白定量检测单元。
13. 如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检 测单元至少包括包被抗乙型肝炎病毒X蛋白的固相载体和抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体阴、 阳性对照品；所述甲胎蛋白定量检测单元至少包括包被甲胎蛋白抗体的固相载体和甲胎蛋 白阴、阳性对照品。
14. 如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体定量检 测单元是如权利要求1-4所述的抗乙型肝炎病毒X蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒。
15. 如权利要求12-14所述的试剂盒在制备用于肝癌诊断的免疫测定试剂盒中的应 用。
【文档编号】G01N33/68GK104297494SQ201410637265
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】张晓东, 叶丽虹 申请人:天津托普法玛生物科技有限公司