专利名称：基于重组ul51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物医学领域中鸭瘟病毒抗体的检测，特别涉及基于重组UL51蛋白 的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用。
背景技术：
鸭瘟(Duckplague，DP),又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是
鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出 血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也 有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV), DPV是一种泛嗜性全身
性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已 报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间 接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和 试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微 量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和 光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4 5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设 备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生 的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成 分，而导致许多假阳性结果出现。随着分子生物学的飞速发展，对蛋白功能的研究日趋增强，特别是对有免疫原 性蛋白的研究日益增多，以克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病毒抗血清的ELISA方 法和胶体金免疫层析法已被大量报道。但是，基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测 方法尚未报到，重组UL51蛋白是否与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应、是否可用 于鸭瘟病毒抗体的检测尚需证实。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的胶体金 免疫层析试纸检测鸭瘟病毒抗体，所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒 pET28a-UL51、转化并发酵培养，收集到了大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀；为保 证包被蛋白成分单一，降低非特异性结合，接着对重组UL51蛋白进行了纯化；且将纯化 的蛋白再依次分步梯度透析，以降低尿素浓度使该蛋白恢复其空间结构，复性后的蛋白 具有较好的抗原性；同时，用Western blotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生 强烈的免疫反应；进一步确定重组UL51蛋白标记浓度、兔免疫球蛋白的包被浓度及金标 垫的包被参数后，制备了胶体金免疫层析试纸，该试纸检测鸭瘟病毒抗体的特异性、灵 敏性较高。
为实现上述目的，本发明的技术方案为基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金 标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度 大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于lmg/mL的兔免 疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋 白和胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。进一步，所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，所述硝基纤维膜上 的测试线由浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度等于lmg/mL的 兔免疫球蛋白包被而成，所述金标垫由胶体金标记的浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白 和胶体金标记的浓度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。本发明的目的之二在于提供所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，该方法简单 实用。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述胶体金免疫层析试纸的制备步骤具体步骤为a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制将浓度22mg/mL的重组UL51蛋白喷 点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度Mmg/mL的兔免疫球蛋白喷点于硝基纤维膜上形 成对照线，干燥后低温密封保存备用；b金标垫的制备将玻璃纤维素膜浸于由胶体金标记的浓度^2mg/mL的重组 UL51蛋白和胶体金标记的浓度》mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液中，再将该 膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点，干燥后得金标垫；C胶体金免疫层析试纸条的组装分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫、吸收垫 依次粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样 品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存；进一步，所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线 距硝基纤维膜的边距分别为0.9厘米。本发明的目的之三在于提供所述胶体金免疫层析试的运用，所述运用能够保证 在灵敏性和特异性较高的情况下快速检测鸭瘟病毒抗体。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述的胶体金免疫层析试纸在制备鸭瘟病毒抗体检测试纸中的运用。有益效果本胶体金试纸敏感性高，即使将DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按 体积稀释到128倍，也可以被本胶体金免疫层析试纸检测到；运用该试纸分别检测非免 疫鸭阴性血清、鸭DPV阳性血清、鸭DHV阳性血清、鸭RA阳性血清和鸭E.coli阳性血 清，结果显示仅鸭DPV阳性血清可见两条清晰的红色条带，其它血清均仅在C线处出现 一条清晰的红色条带，表明本试纸具有很好的特异性；另外，运用本试纸检测鸭瘟病毒 具有良好的批内及批间重复性；本方法制备的试纸至少可在4°C或25°C保存一年，本运 用首次将重组UL51蛋白制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗体。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图I-A为DPV UL51基因的PCR扩增M指DL2000相对分子质量标准；1指 以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为 模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp);图I-B为重组质粒 PMD18-UL51的双酶切鉴定M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18_UL51用 EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图 I-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定M指相对分子质量标准III ； 1指重组 表达载体pET28a_UL51，2指重组表达载体pET28a_UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到 的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定M为蛋白质相对分子质量标准； 1为阴性对照(未加I PTG诱导)；2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为 34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果1_7的IPTG浓度分别为O、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 禾口 1.2mmol/L ；图 2-C 为不同温度诱导 pET28a_UL51 表达结果: 1-3的温度分别为20、30和37°C;图2-D为不同时间诱导pET28a_UL51表达结果1-7 的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。图3为重组UL51蛋白的检测(a) SDS-PAGE分析M为蛋白标准(KD) ； 1为 ImL发酵培养的菌液；2为包涵体洗涤法纯化的重组UL51蛋白；O为透析复性后的重组 UL51蛋白；(b) Western blotting分析1是以兔抗DPV抗体为一抗检测重组UL51蛋白 (约为 34KD)。图4为胶体金免疫层析试纸条的组装示意图。图5为胶体金免疫层析试纸条的判定结果。图6为所述胶体金免疫层析试纸的敏感度。图7为所述胶体金免疫层析试纸的特异性。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优 选实施例进行详细的描述。实施例鸭瘟病毒UL51胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及产物纯化1、材料方法优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆 实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。1.1菌株、质粒和毒株质粒pMD18_T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET28a(+)， Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表达宿主菌E.coli BL21 (DE3)和DPV CHv 强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。1.2试验鸭胚10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性.
2实验方法2.1DPVUL51 基因的克隆2.1.1引物设计禾Ij用Primer Premier5.0软件，参考UL51基因序列(GenBank登录号 DQ072725),由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-UL51F: 5’ -CCGGAATTCA TGTTAGCTTTTATCTCCAG-3，(划线部分为 EcoRI 位点)；引物 DPV-UL51R: 5，-TC CCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’ (划线部分为XhoI位点)。合成后，以适量灭 菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20°C保存备用。2.1.2DPV基因组DNA的提取2.1.2.1DEF的制作方法取IOd日龄健康鸭胚，分别用5%碘酒和75%酒精消毒 蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏， PBS冲洗后将胚体剪成Imm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分 散剂(体积分数为2.5%的胰蛋白酶)150μ1/胚，于37°C水浴中消化3min。立即将细胞 悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布 过滤，向滤液中加入10%小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于IOOmL细胞培养瓶中， 7mL/瓶，水平静置于37°C细胞培养箱中进行培养。2.1.2.2DPV增殖取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清 洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3mL覆盖细胞表面进行吸附，37°C吸附120min 后弃病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37°C培 养。同时做未接毒的DEF对照。2.1.2.3DNA提取方法直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤 如下(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60% 70%的DEF (IOOmL细胞 瓶)；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500yL的细 胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200yg/mL，轻轻混勻后，37°C孵育 IOmin ； (3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500 μ L的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内 的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2 次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混勻后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20°C放置 30 60min ； (6) 13000r/min离心20min,沉淀用预冷的70%乙醇洗涤两次；(7)真空抽 干后，溶于适量TE缓冲液中，加入IyLRNA酶，37°C作用30min，_20°C保存备用。2.1.3PCR 扩增 DPV UL51 基因PCR反应体系为
权利要求
1.基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标 垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，其特征在于所述硝基纤维膜上的 测试线由浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于 lmg/mL的兔免疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL 的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混 合液包被而成。
2.根据权利要求1所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，其特征在于 所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓 度等于lmg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，所述金标垫由胶体金标记的浓度等于2mg/mL 的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包 被而成。
3.权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸制作方法，其特 征在于具体步骤为a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制将浓度』mg/mL的重组UL51蛋白喷点于 硝基纤维膜上形成测试线，将浓度2lmg/mL的兔免疫球蛋白喷点于硝基纤维膜上形成对 照线，干燥后低温密封保存备用；b金标垫的制备将玻璃纤维素膜浸于由胶体金标记的浓度》mg/mL的重组UL51 蛋白和胶体金标记的浓度』mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液中，再将该膜浸于 玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点，干燥后得金标垫；c胶体金免疫层析试纸条的组装分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫、吸收垫依次 粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫 端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存。
4.根据权利要求3所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸制作方法，其特 征在于所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线距硝基纤 维膜的边距分别为0.9厘米。
5.权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸在制备鸭瘟病毒抗体检测试纸中的应用。
全文摘要
本发明特别涉及基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，所述胶体金免疫层析试纸中硝基纤维膜上的测试线由浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，金标垫由胶体金标记的≥2mg/mL重组UL51蛋白和≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白的混合液包被而成；试纸的制作方法包括硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制、金标垫的制备及胶体金免疫层析试纸条的组装；本发明还涉及试纸在检测鸭瘟病毒抗体中的运用；本试纸用于检测鸭瘟病毒抗体的检测灵敏度和特异性高，本制备方法操作简单实用，本运用首次将抗重组UL51蛋白制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗体。
文档编号C12N15/38GK102012432SQ201010299530
公开日2011年4月13日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者汪铭书, 沈婵娟, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心