专利名称：制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法
技术领域：
本发明涉及制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法。
背景技术：
重组白细胞介素-1受体拮抗剂(简称IL-Ira)是一种存在于人体的蛋白质类细 胞因子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-I(IL-I)受体，特异性地封闭IL-I的活性。自Arend等1990年克隆出人IL-lra的cDNA以来，各国学者都在对IL-lra进行 更为全面、深入的研究。同时，众多制药厂商也都在致力于IL-Ira的开发，2003年美国FDA 批准Amgen公司生产的重组人IL_lra(商品名Kineret)用于治疗类风湿性关节炎。我国 SFDA 2008年批准西藏华西药业生产的重组人IL-Ira用于治疗眼部非感染性炎症，虽然也 有厂家申请IL-Ira用于治疗类风湿性关节炎，但是至今未有产品正式上市销售。目前制备重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的方法有真核表达和原核表达两种。 真核表达产量低，成本高，但蛋白活性好。原核表达(大肠杆菌)表达分包涵体表达和可溶 性表达。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基。本发明所提供的发酵培养基，由以下成分组成胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸 镁、维生素B1、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0. 5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠 15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0. 011g/L、硫酸镁0. 96g/L、维生素BIO. 033g/L、丙三醇聚 氧丙烯聚氧乙烯醚0. 2ml/L。本发明的另一个目的是提供制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法。本发明所提供的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤将重 组菌接种于所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆 菌，所述序列中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌将序列中序列1所示 基因插入PET_30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。所述方法中，在所述发酵培养前，包括如下种子培养的步骤(1) 一级种子培养将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7. 2、37°C和200rpm 的条件下培养12小时得到一级种子液；所述种子培养基A由以下成分组成
胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L ；(2) 二级种子培养将步骤(1)得到的一级种子液按接种量接入种子培养基 B，在PH值为7. 2、37°C和200rpm的条件下培养7_8小时得到二级种子液；所述种子培养基B由以下成分组成胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。所述发酵培养的温度为37°C ；所述接种量为9% -10%，具体为9%和10% ；所述发酵培养中，使发酵体系的溶氧量保持在30% -50%，具体为30%、40%和 50% ；所述发酵体系的pH值为7. 0-7. 2，具体为7. 0、7. 1和7. 2 ；所述发酵体系为发酵容器内的所有物质。所述发酵培养过程中，包括如下补料的步骤在所述发酵体系的0D600达到 7. 0-9. 0时，开始向发酵体系中补加补料培养基；所述补加的补料培养基与所述发酵培养基的体积比为1 3;所述补料培养基由以下成分组成酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、维生素B1和水；以上成分在所述补料培养基中浓度分别为酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸 镁 5g/L、维生素 B1O. lg/L。所述发酵培养中，包括如下诱导培养步骤在发酵体系的0D_值达到35-45时，向 发酵体系中加入异丙基_ β -D硫代半乳糖苷进行诱导培养，使异丙基_ β -D硫代半乳糖苷 在发酵体系中的浓度为0. lmmol/L-0. 2mmol/L，诱导培养的时间为3h_4h ；所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。本发明的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法，适合 重组大肠杆菌的生长和目标蛋白的表达。本工艺可重复性好；菌体生长快，可大幅缩短发酵 周期；菌体产量高，可满足高密度发酵需要和目标蛋白表达率高，且可溶性良好。
图1为PET-30a-IL_lRa表达质粒构建示意图。图 2 为 IL-Ira PCR 鉴定图。图3为pET-hlL-lra表达质粒酶切图谱
图4为IL-Ira大肠杆菌表达结果。图5为IL-Ira工程菌划种LB琼脂平板的结果。图6为电镜检查IL-Ira工程菌的形态。图 7 为 20100623 批发酵 SDS-PAGE 电泳。
图8为20100205批发酵菌体生长曲线图。图9为质谱分析测定IL-Ira工程菌发酵液样品的C末端序列结果。图10为EDMAN降解蛋白质N-末端氨基酸的序列分析方法测定IL-Ira工程菌发 酵液样品的N-末端氨基酸的序列。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、构建IL-Ira工程菌 大肠杆菌表达载体PET_30a购自Novagen公司，产品目录号69909_3 ；大肠杆菌JM109菌株购自Promega公司；大肠杆菌菌株BL21 (DE3)购自MERCK公司；PHA刺激的人外周血T细胞cDNA文库，购自美国Clontech Laboratories. Inc。一、获得 IL-Ira 基因1、IL-Ira cDNA 的 PCR 扩增以PHA刺激的人外周血T细胞cDNA文库为模板，加入合成的IL-Ira 引物和dNTP，上游引物为5 ‘ -GGCATATGCGACCCTCTGGGA-3 ‘，下游引物为 5' -GGAGGACGAGTAAGTCGACAA-3‘，上游引物引入NdeI酶切位点，从编码成熟人IL-Ira的 第一个氨基酸开始，下游引物导入大肠杆菌高效终止密码TAA和SalI酶切位点。95°C 5’ 变性后加入Pfu DNA聚合酶2. 5U，95°C 1，，50°C 1，30",72°C 1，30” 一轮，经35轮反应，最 后一轮72°C 15’，得到的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图2所示。 利用美国Promega公司的Magic PCR纯化试剂盒纯化IL-IraPCR产物。2、IL-Ira表达质粒的构建将大肠杆菌表达载体PET_30a用NdeI和SalI酶切，将步骤1的PCR产物用NdeI 和SalI酶切，与上面处理好的PET-30a连接，所用连接酶为T4DNA连接酶，构建成IL-Ira 表达质粒 PET-30a-IL-lRa(图 1)。3、质粒酶切鉴定将表达质粒PET-30a-IL-lRa转入大肠杆菌JM109菌株，抗性筛选，挑取阳性克 隆，将阳性克隆进行液体培养，提纯PET-30a-IL-lRa表达质粒，经酚抽提，乙醇沉淀后，经 内切酶Kpnl、Sail消化，1 %琼脂糖电泳鉴定，其酶谱与预期结果一致(图3 泳道1为 λ DNA+Hind III 分子量标准；泳道 2 为 PET-30a-IL_lRa/Kpn I ；泳道 3 为 PET-30a-IL_lRa/ Sail ；泳道 4 未切的 pET-hlL-lra。4、目的基因的序列分析PET-30a-IL-lRa质粒高保真Taq酶PCR (上游弓| 物为 5' -GGCATATGCGACCCTCTGGGA-3‘，下游引物为5' -GGAGGACGAGTAAGTCGACAA-3‘)，产物 片段连入PGEM-T质粒(购自Promega公司)的克隆位点，构建成pGEM-T-IL_lRa质粒，利 用Pharmacia Biotech公司的自动DNA测序仪进行DNA的自动测序。目的基因的DNA序列分析结果如下pGEM-T-IL-IRa质粒的插入片段的序列为序列表中序列1，经序列分析证明与公布的序列完全一致，无突变点出现。序列表中序列1为完整的成熟区IL-Ira cDNA序列。成 熟区IL-Ira cDNA编码152个氨基酸，包括N端附加的甲硫氨酸共为153个氨基酸(序列 表中序列2)。二、构建表达载体1、人重组IL-Ira在大肠杆菌的表达表达载体PET-30a-IL_lRa转化宿主菌BL21 (DE3)细胞，构建IL-lra工程菌。同 时用转空载体对照质粒PET-30a转化宿主菌BL21(DE3)细胞，构建转空载体对照菌。挑取 单个菌落，接种IL-Ira工程菌和转空载体对照菌于LB培养基中(含100 μ g/ml Kana)在 37 °C培养振荡过夜，再以2%浓度接种于LB培养液中，到OD6tltl为0. 4左右，添加0. 2mMIPTG 开始诱导，继续培养4小时。将诱导表达的细菌离心，收集菌体，直接加入含SDS的裂解液 进行SDS-PAGE分析及等电点分析。诱导表达后的细菌裂解物通过SDS-PAGE分析，发现pET-30a-hIL-lra克隆出现 明显的表达带，分子量20KD，与文献报道分子量一致，而转空载体对照菌未出现分子量为 20KD的表达带(见图4，图4为IL-Ira大肠杆菌表达结果，其中，泳道1为蛋白质分子量标 准；泳道2为转空载体对照菌；泳道3为诱导后全菌；泳道4为菌体超声上清。)。经薄层 扫描结果，表达量占菌体总蛋白的30%以上。三、鉴定IL-Ira工程菌(一)种子库鉴定(1)菌种检定划种LB琼脂平板IL-Ira工程菌呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。菌落圆形、小、隆起、透 明或半透明、整齐、发亮(图5)。(2)涂片革兰氏染色在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌。(3)电镜检查IL-Ira工程菌呈典型的大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染 (图 6)。(4)生化反应IL-Ira工程菌生化反应检测结果如表1所示。表IIL-Ira工程菌生化反应检测结果
权利要求
1.一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基，由以下成分组成胰蛋 白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素Bi、 丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0. 5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、 磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0. 011g/L、硫酸镁0. 96g/L、维生素B1O. 033g/L、丙三醇聚氧丙烯 聚氧乙烯醚0. 2ml/L。
2.制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤将重组菌接种于权利要 求1所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所 述序列表中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌将序列中序列1所示基 因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述发酵培养前，包括如 下种子培养的步骤(1)一级种子培养将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7. 2、37°C和200rpm的条 件下培养12小时得到一级种子液；所述种子培养基A由以下成分组成 胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水； 以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为 胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L ；(2)二级种子培养将步骤(1)得到的一级种子液按接种量接入种子培养基B，在 PH值为7. 2、37°C和200rpm的条件下培养7_8小时得到二级种子液；所述种子培养基B由以下成分组成 胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水； 以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为 胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于 所述发酵培养的温度为37°C ；所述接种量为9% -10%，具体为9%和10% ；所述发酵培养中，使发酵体系的溶氧量保持在30% -50%，具体为30%、40%和50% ； 所述发酵体系的PH值为7. 0-7. 2，具体为7. 0,7. 1和7. 2 ； 所述发酵体系为发酵容器内的所有物质。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养过程中，包括如下 补料的步骤在所述发酵体系的0D_值达到7. 0-9. 0时，开始向发酵体系中补加补料培养 基；所述补加的补料培养基与权利要求1所述发酵培养基的体积比为13; 所述补料培养基由以下成分组成酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、维生素B1和水； 以上成分在所述补料培养基中浓度分别为酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸镁 5g/L 和维生素 B1O. lg/L。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养中，包括如下诱 导培养步骤在发酵体系的0D_值达到35-45时，向发酵体系中加入异丙基-β-D硫代 半乳糖苷进行诱导培养，使异丙基_ β -D硫代半乳糖苷在发酵体系中的浓度为0. Immol/ L-0. 2mmol/L，诱导培养的时间为3h_4h。
全文摘要
本发明公开了制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法。本发明所提供的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵方法包括以下步骤将重组菌接种于所述发酵培养基，发酵培养，得到发酵液，即得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。本方法可重复性好；菌体生长快，可大幅缩短发酵周期；菌体产量高，可满足高密度发酵需要和目标蛋白表达率高，且可溶性良好。
文档编号C12P21/00GK102002517SQ20101029939
公开日2011年4月6日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者揣文华, 梁伟锋, 洪海燕, 王瑞琳, 韩普 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司