快速检测大豆凝集素的胶体金免疫层析试纸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及一种快速检测大豆凝集素 SBA的胶体金免疫层析试纸。
【背景技术】
[0002] 大豆中蛋白质含量丰富，一般为35°/『38%，氨基酸组成平衡，且富含不饱和脂肪酸， 是人体和动物体重要的植物蛋白和植物油来源。由于其种植面积广，产量大，长久以来一直 被广泛应用于食品和饲料的加工原料，对于人类健康和动物营养具有极高的使用价值。然 而，大豆中也含有多种抗营养因子，这些抗营养因子在很大程度上影响了大豆的开发与利 用。大豆凝集素（SBA)是大豆中主要抗营养因子之一，也是大豆中唯一的含量较高的生物 活性蛋白。SBA是能够特异结合N-乙酰基D-半乳糖胺/D-半乳糖，分子量约120kD的一类 糖蛋白，其抗营养作用主要表现在：对动物生长的抑制作用，影响营养物质的消化吸收，影 响的小肠结构及功能，促进胰腺增生，触发肥大细胞脱粒和暂时性过敏反应等。这些抗营养 作用对于人类和动物尤其是幼龄动物的生长和健康造成潜在危害，因此，建立一种快速、灵 敏、准确的检测食品及饲料中的大豆凝集素含量的方法具有重要意义。
[0003] 大豆凝集素是一种大分子蛋白，可以利用SBA抗体通过免疫学的方法对其含量进 行检测。目前国内外应用较为广泛的免疫学检测方法包括火箭免疫电泳、酶联免疫吸附法 和功能性凝集素免疫测定法等。免疫层析试纸检测方法相对于其他免疫学检测方法更为快 速，且具有成本低、便携、易操作等优点，可以用于大批量样品的定性与定量检测，在准确性 和灵敏度上也能够满足要求。该法分析过程简单，用作SBA的检测有独特优势，是需要优先 发展的检测技术。但目前仍没有关于SBA免疫层析试纸检测方法的报道，所以该方法将会 成为未来大豆抗营养因子检测方法的一个发展方向。 【实用新型内容】
[0004] 本实用新型要解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，提供一种特异、灵敏、 简便、安全、快速检测SBA的免疫层析试纸。
[0005] 本实用新型的技术方案：
[0006] -种快速检测SBA的胶体金免疫层析试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护 层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫。在纤维素 膜设有用SBA兔源多克隆抗体溶液喷点的检测线以及用羊抗小鼠 IgG抗体或兔抗小鼠 IgG 抗体溶液喷点的质控线；所述结合垫吸附有胶体金纳米颗粒标记的SBA鼠源单克隆抗体。
[0007] 所述支撑层用不吸水的韧性材料制成；样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙 烯膜或聚酯膜制成；结合垫用玻璃纤维棉、聚酯膜、醋酸纤维或尼龙膜制成；纤维素膜用硝 酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水垫用吸水滤纸或滤油纸制成。纤维素膜 上的隐形检测线和隐形质控线为平行排列的" I I "直线式，或为其他类似印记。
[0008] 快速检测SBA的胶体金免疫层析试纸的制备方法：包括用胶体金纳米颗粒标记的 SBA鼠源单克隆抗体(金标单抗)制备结合垫，用SBA兔源多克隆抗体溶液喷点隐形检测线， 用羊抗小鼠 IgG抗体或兔抗小鼠 IgG抗体溶液喷点隐形质控线，然后在支撑层上黏贴样品 垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫。在所述样品垫、结合垫及吸水垫上覆盖有保护膜，在样品垫 与结合垫交界处对应的保护膜上喷点有样品标记线，最后加上保护层。
[0009] 该试纸利用了双抗体夹心检测抗原的原理，当试纸测试端插入待测样品溶液后， 待测溶液通过虹吸作用带动待测SBA及结合垫中的金标单抗一起向纤维素膜扩散，并最终 渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测SBA可先与金标单抗相结合，进而与纤维素 膜上喷点的兔源多克隆抗体检测线结合，金标抗体和兔源多克隆抗体分别与样品中被检测 的SBA分子上的不同抗原决定簇结合，SBA被夹在金标单抗和兔源多克隆抗体之间，形成金 标单抗-抗原-兔源多抗复合物，即双抗体夹心模式，显示红色检测印记" I ";纤维素膜上 喷点的羊或兔抗小鼠 IgG抗体质控线也可与金标抗体结合，形成红色质控印记" I "，即两 条红色印记" I Γ表示为阳性；反之样品溶液中无 SBA时，则不能与金标抗体结合，同样也 不能与纤维素膜上喷点的兔源多克隆抗体检测线结合，不显示红色检测印记，而纤维素膜 上喷点的羊或兔抗小鼠 IgG抗体质控线可与金标抗体结合，显示红色质控线印记" I "，形 成一条红色印记" I "表示为阴性。无论结果为阳性还是阴性，都会显示红色质控印记，若 不显示则表示试纸失效。
[0010] 本实用新型的积极有益效果：
[0011] (1)特异性强，灵敏度高。本实用新型试纸以双抗体夹心原理为基础制备而成， 两种抗体分别为胶体金纳米颗粒标记的鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体。金标抗体中 金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标 记对抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。试验表明，该试纸具有较 高的灵敏度，可检测l〇〇ng/mL的微量SBA ;用该试纸检测分别检测高浓度的glycinin、 β -conglycinin、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子和大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子， 浓度为20 μ g/mL，结果检测线均不显色，说明该试纸与这几种大豆蛋白均没有交叉反应，具 有良好的特异性。
[0012] (2)简便、快速。使用本实用新型试纸，无需其他任何试剂和仪器，可现场操作。只 需将试纸插入被检样品液中，IOmin后即可判定检测结果。
[0013] (3)结果显示形象、直观、准确。本实用新型试纸以显示红色印记" I I "和" I " (或类似性状）作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示两条红色印记" I I "（检 测线和质控线)，表示被检样品中含有SBA ;显示一条红色印记" I "(质控线)，表示被检样品 中不含SBA。此结果可用肉眼直接观测，判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和 假阴性等人为误判。
[0014] (6)节省费用。适用于进行现场检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用。
[0015] (7)适用范围广，便于推广应用。本实用新型实现了基于双抗体夹心的原理在快速 检测SBA胶体金免疫层析试纸中的应用，该试纸操作简便，能满足不同层次人员的需要，包 括海关检疫、卫生检疫、质量监测、农畜产品生产企业和饲料加工企业等。本实用新型在保 障食品安全、保护对于大豆过敏的消费者健康以及保障畜禽饲料安全等方面具有极其重要 的意义，将具有明显的经济效益和社会
[0016] 效益。
【附图说明】
[0017] 图1为本实用新型的免疫层析试纸的结构示意图。
[0018] 图2为本实用新型的免疫层析试纸的俯视结构示意图。
[0019] 图中，1为支撑层，2为样品垫，3为结合垫，4为纤维素膜，5为吸水垫，6为检测线， 7为质控线，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例是为了更好的解释本实用新型，但并不表示对本实用新型的特别限 定，如果没有特别说明，其中的百分含量均可理解为重量百分比。
[0021] 本实用新型试纸的制备过程包括：SBA兔源多克隆抗体的制备、SBA鼠源单克隆抗 体的制备、结合垫的制备、样品垫的制备、纤维素膜的制备和试纸的组装等步骤。
[0022] 1、SBA兔源多克隆抗体的制备：
[0023] 取清洁级3月龄新西兰大白兔，用SBA溶液进行免疫，颈部皮下分4~6点注射。首 次免疫剂量为20(^g/只，用无菌PBS稀释SBA与等量弗氏完全佐剂（FCA)混合，25000r/ min充分乳化IOmin ;加强免疫剂量增大，为30(^g/只，免疫4次，用无菌PBS稀释SBA与等 量弗氏不完全佐剂（FIA)混合，25000r/min充分乳化lOmin。共免疫4次，每次免疫间隔3 周，最后一次免疫30天后，以ELISA法测定效价，并鉴定其敏感性和特异性，心脏采血并分 离收集血清。以饱和硫酸铵盐析法纯化兔源多克隆抗体，即取1份血清加2份PBS(pH7. 2) 混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4°C冰箱12h，4°C、1000 Orpm离心30min，弃上清， 再以适量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33 %，置4°C冰箱12h，4°C、 1000 Orpm离心30min，弃上清，以适量PBS (ρΗ7· 2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS (ρΗ7· 2) 透析48~72h，中间换液6~8次，4°C、12000rpm离心15min，收集上清，得初步纯化的SBA兔 源多克隆抗体。
[0024] 然后采用Protein G亲和层析柱进行进一步纯化，先用10倍柱体积的PBS起始 缓冲液平衡层析柱，将初步纯化的SBA兔源多克隆抗体用起始缓冲液1:1稀释后，通过 0. 22 μm-次性无菌过滤器过滤后加样，随后用10倍柱体积的起始缓冲液流洗，除去未结 合抗体，最后用2倍柱体积的洗脱缓冲液（0. lmol/L甘氨酸-盐酸，pH 2. 5)洗脱，用盛有中 和液（0. lmol/L Tris-HCl pH 9.0)的离心管收集，再用PBS充分透析备用。
[0025] 2、SBA鼠源单克隆抗体的制备：
[0026] 取SPF级6~8周龄BALB/c小鼠，用SBA溶液进行免疫。剂量为5(^g/只，背部皮 下分4~6点注射。免疫4次，首次免疫用无菌PBS稀释SBA与等量FCA混合，加强免疫用无 菌PBS稀释SBA与等量FIA混合，25000r/min充分乳化lOmin，免疫间隔3周。确定抗体效 价符合要求后以5(^g/只的剂量不加佐剂进行超强免疫，之后3~4天将免疫小鼠眶下窦采 血，分离阳性血清；脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5~10min消毒体表，无菌操作取其脾 脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000 rpm离心10min，收集脾细胞。将I X IO8的脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000 rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀物 于37°C水浴中缓慢加入0. 7~1. OmL的PEG1500作用lmin，然后缓慢加入无血清1640培养 基15mL，以终止PEG的作用；37°C水浴静置5min，1000 rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀 物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔（10〇μL^20〇μL7孔)，置于37°C、5% 的CO2培养箱中培养。培养10~14天，用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性孔筛选， 选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行2~3次有限稀释