一种vi型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用，属于生物技术领域。一种VI型胶原蛋白单克隆抗体，包括抗原结合位点，所述的抗原结合位点位于序列VI型胶原蛋白a1片段，核苷酸序列为SEQ ID No:1。本发明选择VI型胶原a1片段中的抗原作为免疫原，使用大肠杆菌表达系统，得到的单克隆抗体，能够与人体血清内中VI型胶原蛋白进行特异性结合，用于检测血清中VI型胶原的含量变化，可大大提高临床对不明原因性肝病的诊断水平。
【专利说明】
-种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，设及一种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] VI型胶原蛋白（collagen VI)属于胶原类蛋白之一，普遍存在于胞外基质的功能 蛋白，其显著特征是分子量大和半脫氨酸含量高，由al，a2，a3 =亚基组成。由于其良好的生 物学特性，可W促进间质细胞和软骨细胞的生成与迁移而维持组织的完整性，并且机械性 能良好。VI型胶原、IV型胶原和层粘连蛋白是肝细胞外基质的主要成份，VI型胶原蛋白在肝 细胞成熟过程中起一定作用。当细胞发生炎症时，VI型胶原会被酶最先作用释放一些VI型 胶原蛋白肤，血清中VI型胶原的含量会明显升高。
[0003] 通过维持细胞外基质的结构和功能，VI型胶原能够维持血管、肺、软骨、肌肉及皮 肤等组织的完整性，如果编码VI型胶原蛋白的基因发生突变，将会形成Bethle肌病和 叫Irich综合征，导致肌肉无力和消瘦;VI型胶原蛋白的缺失还可W导致线粒体功能的丧失 和细胞调亡。另一方面，VI型胶原的增加或积累同样会导致疾病的发生，如浅表性纤维瘤、 神经纤维瘤、癒痕瘡落、肺纤维化、肝纤维化、糖尿病肾损伤W及风湿性关节炎等。VI型胶原 还影响了细胞的分化、粘附、迁移、增殖W及生存。将屯、肌纤维细胞置于含有VI型胶原的基 质中培养，发现由于VI型胶原的诱导，成肌纤维细胞出现了分化，体内实验同样证实了运个 结果。在VI型胶原功能研究中，VI型胶原对各种定向造血干细胞具有较强的粘附性，发挥运 种粘附性的位置限定在3个肤链的螺旋区。VI胶原还能够促进各种细胞的增殖，运种促进增 殖作用可W被VI型胶原的单独的肤链所阻断。而增强纤维细胞的扩散和移动是通过VI型胶 原同细胞表面蛋白聚糖N G、核屯、蛋白聚糖、多配体聚糖、透明质酸W及其他类型胶原相结 合而实现的。
[0004] 胶原蛋白作为肝纤维化增生结缔组织的主要成份，其细胞来源一直是肝纤维化的 研究重点。研究表明，胶原蛋白可由多种细胞产生，如胆脂细胞、肝细胞、内皮细胞等，而胆 脂细胞是ECM，尤其是胶原蛋白的主要细胞来源。胆脂细胞在炎症刺激下，转化为能表达平 滑肌肌动蛋白的肌纤维母细胞，合成许多ECM成份如胶原蛋白、蛋白多糖、纤维连接蛋白、层 粘连蛋白、内动蛋白、健蛋白和透明质酸。
[0005] 临床诊断上，VI型胶原蛋白由于其结构的复杂性，使用基因工程的办法很难在体 外再现出生物活性高的抗原，导致没有高准确度的体外诊断试剂原料，影响到临床案例被 误诊和漏诊，影响到相关疾病的早发现、早治疗。
[0006] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明公开了 VI型胶原蛋白抗原诊断试剂抗 体产品，有效解决了临床诊断试剂原料质量低下的问题，大大提高了对临床不明原因性肝 病的诊断水平，推动我国肝病诊断试剂的整体水平的提高。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种VI型胶原蛋白抗体、制备方法及其应用。
[0008] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0009] -种VI型胶原蛋白单克隆抗体，包括抗原结合位点，所述的抗原结合位点位于序 列VI型胶原蛋白al片段，核巧酸序列为SEQ ID No: 1。
[0010] 进一步地，上述VI型胶原蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤为:选择 VI型胶原蛋白al片段作为抗原，转入大肠杆菌进行抗原蛋白表达，分4次将筛选的抗原免疫 SPF级小鼠，将小鼠产生的效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到单克隆细胞株，由单克隆 细胞株分泌获得。
[0011] 更进一步地，上述VI型胶原蛋白单克隆抗体可W用于制备VI型胶原蛋白检测试剂 盒，检测血清中VI型胶原蛋白含量的试剂盒，用于临床上对肝病的辅助诊断。
[0012] 本发明选择VI型胶原al片段中的抗原作为免疫原，弥补W为抗原的缺陷，使用大 肠杆菌表达系统，该系统采用植物细胞启动因子表达量高，成本低廉，得到的单克隆抗体， 能够与人体血清内中VI型胶原蛋白进行特异性结合，用于检测血清中VI型胶原的含量变 化，可大大提高临床对不明原因性肝病的诊断水平，推动我国肝病诊断试剂的整体水平的 提局。
【附图说明】
[OOU] 图1为VI型胶原蛋白标记用抗体SDS-PAGE图
[0014] 图中：1-10 . Oug硫锭纯化标记用抗体、2-1 . Oug硫锭纯化标记用抗体、3- 10.0 u曲EAE纯化标记用抗体、4-1. OugDEAE纯化标记用抗体。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0016] 实施例1 VI型胶原蛋白单克隆抗体的制备
[0017] (1)小鼠免疫及脾细胞与杂交瘤的融合
[0018] 取6~8周龄雌性Ba化/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐剂乳化的 Siig重组抗原（总体积50山）；15天后进行二次基础免疫，方法为取相同量的抗原用福氏不完 全佐剂乳化，肌肉注射;30天后，尾静脉加强注射扣g不加佐剂的抗原，并于加强免疫后72小 时，杀死小鼠，收集血液，取脾制备脾细胞悬液(悬于RPMI 1640培养基中），细胞计数板细胞 计数。
[0019] 按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，混合后离屯、，利用聚乙二 醇(PEG 1500)使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合;将细胞悬液与等体积的饲养细胞混 合后，分置于96孔细胞培养板中（200山/孔)于5%二氧化碳培养箱化SPEC BNA-311)37°C培 养;3天后，用肌培养基(黄嚷岭1.361111旨+胸腺喀晚核巧0.388111旨，加1?^11640(618〇)公司）培 养基至IOOmL,45~50°C条件下溶解后，过滤除菌；半保留换液;7天后，用重组抗原包被板， 利用如下述酶联免疫吸附法化LISA)检测96孔细胞培养板中所得杂交瘤细胞上清培养液； 对于化ISA检测为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进行克隆化。
[0020] (2化LISA检测法
[0021] 如上WVI型胶原蛋白作为抗原包被的化ISA板，检测时，于每孔中加入10化I细胞 培养液上清;每块96孔微量滴定板设一阳性对照，加入10化1小鼠抗肥V-Ag多抗血清（1:100 稀释使用）；另设一阴性对照，加入10化1 HT细胞培养液。
[0022] 37°C溫浴30分钟，用PBST洗涂液洗5遍，拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫 球蛋白化RP-GAM Ig，DAKO公司），37°C溫浴30分钟，取出后用PBST洗涂液洗5遍，拍干后先后 加入底物液A、B各50山（底物液A成分为：13.42g Na2HP04 ? 12肥0、4.2g巧樣酸? H20和0.3g 过氧化氨，用去离子水中调节体积为700ml;显色液B成分为:0.?四甲基联苯胺、20ml二甲 基甲酯胺用去离子水中调节体积为700ml)，37°C显色10分钟，加入SOiil终止液(2M H2S04) 终止反应，并于酶标仪上检测各孔的0D450值，W0D450值高于阴性对照2倍W上者视为阳 性。
[0023] (3)单克隆抗体腹水的获得及纯化
[0024] 取10周龄的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐剂，每只0.5ml ;7天后，收集 克隆化的杂交瘤细胞，离屯、去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度至2 X 105~2 X 106个/ml，每只小鼠注射0.5ml;7天后小鼠腹部增大，开始收集腹水;300化pm离屯、30分钟， 吸取上清部分的液体，0.45WI1的微孔滤膜过滤除菌，分装后-70°C保存。
[0025] 将腹水进行辛酸一饱和硫酸锭处理后，用PBS复溶;装入透析带中，放入化0.02M pH7.2憐酸盐缓冲液中，4°C揽拌下脱盐12小时左右，期间更换3次W上透析液；DEAE (Pharmacia公司）柱层析纯化，上样缓冲液为0.02M PB，洗脱缓冲液为0.2M PBS，并收集 0.2M PBS洗脱组份;取出后分装-20°C保存。
[00%] (4)抗体纯化方法
[0027] 将腹水或血清用0.02mol/L、pH7.4的PBSlO倍稀释，揽拌下逐滴缓慢加入硫酸锭 (浓度达到50%饱和度），4°C过夜。4°C，12000巧m离屯、15分钟，弃上清，将沉淀溶于适量的 PBS 中，-20 °C 保存。
[0028] 实施例2 VI型胶原蛋白单克隆抗体的检定 [00巧](1)单抗纯度：
[0030] 用SDS-PAGE蛋白电泳法，泳道1、巧日样量为lOiig，泳道2、巧日样量为1.化g，同时用 已知分子量的标准系列作为参照，经考马斯亮蓝染色，纯度大于90%，结果如图1所示。
[0031] (2)蛋白含量：
[0032] 采用紫外吸收法对蛋白含量进行检测，蛋白含量不低于0.5mg/ml。
[0033] (3)免疫活性：
[0034] 用双抗原夹屯、法检测抗体滴度，滴度:100
[0035] 实施例3VI型胶原蛋白单克隆抗体的初步鉴定
[0036] (1)单抗亲和力及表位分组抗原和抗体进行包被
[0037] 使用96孔聚苯乙締板进行包被，使用0.05M化HC03缓冲液(P朋.6)将抗体稀释至 合适浓度，抗原稀释为2.5ug/ml，每孔加入IOOul，37°C 2小时，用pH7.4的含0.1 %Tween PBS(PBST)洗涂3遍后，每孔加入含20%牛血清的包被缓冲液200ul，37°C封闭2小时，PBST洗 涂3遍，保存于4°C备用。
[0038] (2)采用不同检测方法
[0039] a.间接ELISA
[0040]间接化ISA中，使用含5%牛血清的PBS門尋待检抗体稀释至合适浓度，加入包被有 抗原的微孔板中，IOOul/孔，37°C解育1小时，PBST洗涂5遍;然后每孔加入IOOul使用含5% 牛血清PBST 1:5000稀释的皿P标记羊抗鼠 IgG抗体，37 °C解育30分钟后，PBST洗涂五遍，加 入TMB底物，37 °C显色15分钟;在波长450nm处读取各孔A值。
[0041 ] b.竞争化 ISA
[0042] 根据标记抗体的滴定结果，将标记抗体浓度稀释至A值约为2.00左右，同时将竞争 抗体浓度稀释为标记抗体现浓度的20倍;竞争抗体和标记抗体各50ul加入微孔板中，平行 双孔测定。与竞争抗体浓度相同的无关单抗作为阴性对照，与竞争抗体浓度相同与标记抗 体同株的未标记抗体作为阳性对照。37 °C解育1小时后，洗板，TMB显色，450皿处读取A值，计 算竞争抗体对标记抗体的抑制率。
[0043] 抑制率=A竞争-A阳性/A阴性-A阳性
[0044] 如抑制率>75%为两株单抗所识别位点完全不相关；>50%<75%为不完全相关； > 25 %巧0 %为相关;<25 %为完全相关。
[0045] C.双抗体夹屯、ELISA，间接双抗体夹屯、ELISA，LAB间接双抗体夹屯、ELISA
[0046] 包被有捕获抗体的酶标板条中加入使用含5 %牛血清PBST 10倍稀释的待测血清， 37 °C解育2小时，PBST洗涂3遍。
[0047] (1)经典双抗体夹屯、法:加入皿P标记的一抗，37°C解育1小时，PBST洗涂5遍后，加 入底物显色；
[004引（2)间接双抗体夹屯、：加入羊抗肥V多抗，37 °C解育1小时后，PBST洗涂5遍，然后加 入HRP标记兔抗羊IgG抗体，37 °C解育30分钟后，PBST洗涂5遍，加入底物显色；
[00例 （3) LAB间接双抗体夹屯、:加入羊抗肥V多抗，37 °C解育1小时后，PBST洗涂5遍，然后 加入生物素标记兔抗羊IgG抗体，37°C解育30分钟后，PBST洗涂5遍，再加入HRP标记亲和素， 37 °C解育30分钟后，PBST洗涂5遍，加入底物显色。
[0050] W上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明掲露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该W权利要求的保护范围 为准。
【主权项】
1. 一种VI型胶原蛋白单克隆抗体，其特征在于，包括抗原结合位点，所述的抗原结合位 点位于序列VI型胶原蛋白al片段。2. 根据权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述的抗原结合位点 的核苷酸序列为SEQ ID No: 1。3. 根据权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体，其特征在于，以VI型胶原蛋白al片 段作为抗原，转入大肠杆菌进行抗原蛋白表达，以SPF级小鼠作为免疫对象，将小鼠产生的 效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，由获得单克隆细胞株分泌产生。4. 权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤为:选择 VI型胶原蛋白al片段作为抗原，转入大肠杆菌进行抗原蛋白表达，分4次将筛选的抗原免疫 SPF级小鼠，将小鼠产生的效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到单克隆细胞株，由单克隆 细胞株分泌获得。5. 权利要求1所述的VI型胶原蛋白单克隆抗体在制备VI型胶原蛋白检测试剂盒中的应 用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒是检测血清中VI型胶原蛋白 含量的试剂盒。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒用于临床上对肝病的辅助诊 断。
【文档编号】G01N33/577GK105924522SQ201610257955
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】李玉璞
【申请人】四川耀康生物科技有限公司