专利名称：一种水稻缺氮特异性诱导表达的启动子y5及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻缺氮特异性诱导表达的启动子Y5及应用。
背景技术：
目前转基因研究主要以组成型启动子驱动目的基因表达，最典型的是花椰菜花叶病毒中分离的 CaMV35S 启动子(Hirt et al.，1990 ；Battraw et al.，1990)，以及近年来一些植物来源的启动子，如从水稻中克隆的肌动蛋白基因Actinl的启动子和玉米中克隆的泛素基因ubiquitin启动子(Schledzewski et al., 1994)。但是外源基因的组成型表达往往会造成资源的非必要浪费，同时大量异源蛋白的积累也会打破植物原有的代谢平衡，阻碍植物的正常生长(聂丽娜等，2008 ；Rai et al.,2009)。Kasuga等(1999)在研究中发现，使用强的组成型表达启动子CaMV35S启动DREBlA的表达时，对植物的生长可能起到某种程度的阻碍作用，而用诱导型的启动子可以减轻这种状况。诱导型的启动子可以快速有效地诱导转录基因的“开、关”:可根据需要在植物特定发育阶段、组织器官或生长环境下接受诱导信号，诱导基因表达，也可以随时解除胁迫，停止表达(李杰等，2006)。因此，获得水稻在氮饥饿状态下诱导表达的启动子，不仅可以减少外源基因大量表达带来的负面影响，更能为基因工程改良水稻提供安全有效的调控。在植物生长所需的各种大量元素中，氮素是限制植物生长和形成植物产量的首要因素。氮不仅是遗传物质的基础，更是蛋白质、核酸、叶绿素、酶、维生素、生物碱和植物激素等的重要组成部分(陆景陵，1994)。近半个世纪以来，世界各国都把增施氮肥作为增加水稻产量的重要农业措施，特别是第一次绿色革命之后，随着高产耐肥品种推广应用，农田氮肥施用量迅猛增长，极大提高了水稻的产量(钟代斌等，2001)。农田氮肥的过量施用，随之而来的便是氮素利用率降低以及一系列的环境问题。氮素的大量流失直接导致地下水污染和江河湖泊的富营养化作用(王光火等，200`3)。随着分子生物学和基因工程在植物领域的迅速发展，植物对氮吸收转运的分子机制也越来越清晰。大量的铵盐转运子、硝酸盐转运子被发现，GS/G0GAT(谷氨酸胺合成酶/谷氨酸合成酶)循环同化铵机理被揭示，为基因工程改良水稻氮的吸收利用提供大量的研究素材。虽然通过突变体或者吸收实验等验证了不少基因的吸收转运功能，但是这些基因在水稻体内的超量表达并未达到提高吸收转运铵的目的。Mohammad等(2006)用玉米ubiquitin启动子超量表达水稻中的铵盐转运子OsAMTl-Ι，提高了水稻中铵的吸收能力以及根中总铵含量，但同时产生了铵的毒害，导致地上部生物量大量减少。如果改为缺氮诱导启动子驱动，就有可能根据植株的需要，适当控制铵的吸收，避免毒害。GS是参与NH4+同化合成谷氨酰胺(Gln)的主要酶，Cai等(2009)用35S启动子在水稻品种中花11中超量表达水稻谷氨酰胺合成酶基因GSl ;1、GS1 ；2和大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因glnA，GS活性、总氮含量、氨基酸含量、可溶性蛋白等都得到了显著提高，但是单株生物学产量及籽粒产量都显著下降了。如果改为供氮诱导启动子驱动，不仅可以降低组成型表达造成的“浪费”，更可以保证仅在供氮充足的情况下促进GS的同化，避免单株因氮源不足而造成生物学产量降低。本发明通过芯片发掘了一个缺氮诱导基因表达的启动子，用实时定量realtimePCR在三个不同品种中进行了验证，同时通过水稻稳定转化进一步确定了该启动子是一个缺氮诱导的启动子，为基因工程改良水稻对氮的吸收利用提供了新的材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，提供了一种在水稻中缺氮诱导基因表达启动子的应用。申请人将这个启动子命名为启动子￥5。￥5在水稻中缺氮诱导基因表达的用途如下:芯片结果显示，在水稻品种日本晴和珍汕97在缺氮胁迫3 7d时，启动子Y5控制的下游基因分别在根中诱导表达10倍和70倍左右，而在地上部组织中则不诱导表达。在第三个品种中花11中，通过realtime PCR验证发现启动子Y5控制的下游基因在缺氮3 7d时诱导20倍以上。从中花11 (又称ZH11)材料中扩增启动子Y5全长序列融合GUS基因稳定转化水稻，将转基因阳性材料进行缺氮胁迫处理，发现缺氮胁迫后GUS基因在根中表达量显著诱导表达，而⑶S蛋白活性相比诱导前明显上升。进一步验证了启动子Y5缺氮诱导表达的特性。本发明是这样实现的:本发明以水稻日本晴(英文名称:Nipponbare，一个公知公用的水稻品种材料，且已经完成全基因组测序的水稻品种)和珍汕97( —个中国公知公用的水稻品种，来自江西省农业科学院)作为基础材料，水培幼苗至5叶期，分不同时间点缺氮胁迫处理取样(缺氮lh、缺氮IcU缺氮3d、缺氮7d、缺氮7d后恢复供氮2h、恢复供氮Id)，以持续正常营养液(见实施例)培养的幼苗作为对照，利用全基因组cDNA芯片表达谱作为技术手段(杨蓉等，1999)，得到了一个在两个品种的根中缺氮都高倍诱导表达的基因，根据这些基因的信息在NCBI网站(www.ncb1.nlm.nih.gov )获得了基因上游序列即其启动子序列，同时，申请人按同样的处理方法处理了第三个水稻品种中花11 (又称ZH11，来自于中国农业科学院作物科学研究所的公知公用品种)，并通过realtime PCR验证了该基因缺氮诱导的表达模式。将启动子序列融合GUS报告基因构建到启动子载体DX2181b(由申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室对商业载体PCAMBIA1381改造⑶S连接方向和酶切位点而来，见图2)上，再进行农杆菌介导的遗传转化，转化水稻品种中花11，得到阳性转化植株。检测转化阳性植株的⑶S基因表达量发现，缺氮处理3d后的⑶S表达量显著上升，⑶S蛋白检测发现缺氮处理后其活性明显增强。本发明的优点在于:(I)本发明提供了一种在水稻中缺氮诱导基因表达启动子的应用。在三个不同的水稻品种中验证了该启动子下游基因的表达量缺氮高倍诱导的表达模式。启动子融合GUS基因稳定转化水稻阳性植株中，⑶S表达量和⑶S活性缺氮处理后均显著上升。(2)本发明首次发现了启动子Y5是一个缺氮高倍诱导基因表达的启动子，并且功能区段在其调控基因起始密码子ATG的上游546bp内，为基因工程改良水稻中如何有效控制氮素的吸收同化提供了新的材料。(3)本发明中应用的启动子及其下游基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物的营养代谢研究提供支持。
序列表SEQ ID NO:1是启动子Y5A(即本发明的启动子Y5，A表示该启动子全序列)的核苷酸序列，序列全长1305bp。序列表SEQ ID NO:2是启动子Y5A的其中一个截短的启动子区段Y5B的核苷酸序列，序列全长为1062bp。序列表SEQ ID NO:3是启动子Y5A的其中一个截短的启动子区段Y5C的核苷酸序列，序列全长为784bp。序列表SEQ ID NO:4是启动子Y5A的其中一个截短的启动子区段Y 的核苷酸序列，序列全长为546bp。序列表SEQ ID NO:5是Y5调控的下游基因的编码序列，序列全长477bp，编码158
个氨基酸。序列表SEQ ID NO:6是Y5调控的下游基因的编码的蛋白质的序列。图1.是本发明的总体技术路线图。图2.载体DX2181b的结构示意图。图2a是DX2181b改造前载体pCAMBIA1381载体结构图；图2b是载体DX2181b的结构示意图；图2c是载体DX2181b的多克隆位点结构。图3.启动子融合GUS表达载体稳定转化水稻片段的结构示意图。图4.启动子Y5下 游基因在芯片材料中的表达模式。图4a是芯片数据，显示在日本晴(nip)和珍汕97 (ZS)两个品种的芯片数据中该基因缺氮强烈诱导；图4b是以芯片同批珍汕97材料重新抽提RNA做realtime验证表达量结果，同样显示缺氮强烈诱导。图5.启动子Y5下游基因用realtime验证中花11中的表达模式。图5a是地上部分结果(shoot);图5b是根结果(root)。图6.启动子Y5融合GUS稳定转化水稻后，各个截短模式的不同阳性单株中GUS基因表达量随缺氮前后的变化。图61、62、63、64依次为启动子全长Y5A及启动子区段Y5B、Y5C、Y 的结果，后面的不同数字编号代表不同的转基因阳性株系。图7.启动子Y5融合GUS稳定转化水稻后，各个截短模式的不同阳性单株中GUS蛋白活性随缺氮前后的变化。图71、72、73、74依次为启动子全长Y5A及启动子区段Y5B、Y5C、Y 的结果，后面的不同数字编号代表不同的转基因阳性株系。
具体实施例方式以下实施例进一步定义本发明，并描述了启动子Y5及其截短启动子区段调节基因表达的模式、遗传转化、以及表达水平和GUS活性的测定方法和该启动子在水稻中的调控表达的模式。根据以下的描述和这些实施事例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。下面结合附图对本发明作进一步具体描述:实施例1启动子Y5的调控模式的确定和序列的获得为发掘水稻中缺氮诱导基因表达的启动子，为基因工程改良水稻氮素吸收提供新的启动子材料，我们设计了附图1中的技术路线图，并选用了两种公知公用的常规水稻品种作为实验材料:日本晴和珍汕97。应用芯片技术，挑选对氮胁迫有明显反应的新基因，该技术可用于定量检测大量基因在不同时间表达水平(杨蓉等，1999)。将日本晴和珍汕97的种子37°C浸种3天，催芽2天，沙培一周出苗，移苗于水稻全营养液水培(水培营养液成分:1.44mM NH4NO3,0.3mM NaH2P04,0.5mM K2SO4,1.0mMCaCl2,1.6mM MgSO4,0.17mM NaSiO3, 50 μ M Fe_EDTA，0.06 μ M(NH4)6Mo7O24,15 μ M Η3Β03，8μΜMnCl2,0.12 μ M CuSO4,0.12 μ M ZnSO4, 29 μ M FeCl3,40.5 μ M Citric acid, pH 值 5.5，具体参见Yoshida et al.，1976)，培养至5叶期，将部分水稻苗移至缺氮的营养液(上述营养液中不加NH4NO3即可)中进行氮胁迫处理，以继续用全营养液培养的苗做为对照。根据实验需要，处理时间点设计如下:缺氮lh、缺氮IcU缺氮3d、缺氮7d、缺氮7d后恢复供氮2h、恢复供氮Id。取样时分开地上部和根部，分别用锡箔纸包好，置于液氮中保存。抽提样品RNA并反转录成cDNA(具体步骤参见invitrogen公司的SSIII反转录试剂盒说明书,货号:Cat.N0.18080-093)，将各个时间点的样品送至北京博奥生物有限公司制作全基因组cDNA芯片(杨蓉等，1999)，对反馈 的芯片数据进行分析，从芯片结果中发现，由启动子Y5调控的下游基因在这两个水稻品种中缺氮3 7d后根部有高倍诱导表达，地上部无反应(图4a、图4b)。为了确信该启动子是不是在不同品种中都有同样的调控模式，申请人又用另一个水稻品种中花11种了一批胁迫材料，验证该启动子下游基因对氮的反应。Realtime验证结果(Realtime PCR的方法参见TAKARA商业试剂盒的使用说明书，货号code:DRR041A):在中花11中缺氮3 7d根也有30倍的诱导(图5a、图5b)。说明启动子Y5的调控模式确实与芯片结果相符。申请人将芯片探针序列输入RGAP网站(//rice, plantbiology.msu.edu/)进行Blast得到被调控基因的全基因序列及登录号号L0C_0sl2g36840。根据基因序列信息，在NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)查得了基因上游序列，申请人将该基因ATG上游1305bp作为启动子全长并命名为Y5A，通过PCR方法，以水稻品种中花11的总DNA为模板，扩增得到了该片段。为进一步验证并且缩小该启动子对氮反应调控元件的范围，申请人又同时将该启动子全长序列按5'端截短模式截短为三段，分别命名为:Y5B(ATG上游1062bp)，Y5C (ATG上游784bp)，Y5D (ATG上游546bp)，用PCR的方法得到截短的片段，再把片段连接到启动子融合GUS报告基因的载体DX2181b上，再进行农杆菌介导的遗传转化，转化水稻品种中花11，得到阳性转化植株。检测转化阳性植株的GUS基因表达量发现，缺氮处理3 7d后的⑶S表达量显著上升，⑶S蛋白检测发现缺氮处理后其活性明显增强。实施例2:启动子表达转化载体的构建根据基因Y5的已知全长启动子序列(见序列表SEQ ID NO:1所述)及其截短序列Y5B (见序列表SEQ IDNO:2所述)，Y5C (见序列表SEQ ID NO:3所述)，Y5D (见序列表SEQID NO:4所述)设计引物(引物序列见表I)，以水稻品种中花11的总DNA为模板，扩增分别得到启动子Y5A全长序列(1305bp)及截短的Y2B(1062bp)、Y2C(784bp)和Y5D(546bp)。扩增这四个片段时，在四对引物的5'端均添加了相同的限制性内切酶位点HindIII (如表1-1所示)，，因此扩增得到的片段可以用限制性核酸内切酶HindIII进行酶切，然后连接到启动子载体DX218 Ib上(载体DX218 Ib是申请人所在作物遗传国家重点实验室研究人员在商业载体PCAMBIA1381，一个来自澳大利亚公开报道和使用的质粒的基础上改造得到的。该载体包含有潮霉素的筛选基因:hygromyCin(R)，载体DX2181b的结构参见图2所述)，然后再用表1-2所示的引物对得到的克隆进行测序，确定基因按正确的方向连接到DX2181b载体上(见图2所示)。利用经典的农杆菌介导的转化方法(农杆菌EHA105，来自澳大利亚CAMBIA实验室，转化的具体操作方法参见=Elizabeth et.al.，1993)，在水稻品种中花11中用Y5A及其截短启动子启动GUS基因的表达。考察转基因阳性植株，发现缺氮3d后会导致GUS表达量显著上升，⑶S蛋白活性明显增加。表1-1本发明设计的PCR弓丨物对
权利要求
1.一种水稻缺氮特异性诱导表达的启动子Y5A，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N01所示。
2.一种水稻缺氮特异性诱导表达的启动子Y5A，它还包括截短的启动子区段Y5B，Y5C和Y5D，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNO 2, SEQ IDNO :3和SEQ IDNO :4所示。
3.权利要求I或2所述的启动子在缺氮下诱导基因在水稻中表达的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻缺氮特异性诱导表达的启动子Y5(又称Y5A)及应用。利用芯片技术，得到了启动子Y5(Y5A)下游基因供氮诱导表达的信息，通过不同水稻品种验证了Y5A下游基因供氮诱导的表达模式。通过PCR方法，扩增出启动子Y5A全长和其5`端截短的片段，连接到启动子载体DX2181b上，构建得到启动子融合GUS表达的载体。再将构建好的载体对水稻品种中花11进行遗传转化，在转化阳性植株中验证该启动子对GUS基因表达的调控，通过Realtime表达量验证和GUS蛋白活性的检测，进一步确证该启动子属于一种水稻缺氮特异性诱导表达的启动子，其功能区段在ATG上游546bp。
文档编号C12N15/84GK103255141SQ20121003961
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者练兴明, 张星, 杨猛 申请人:华中农业大学