专利名称：一种hbd3气管上皮特异性表达载体及其构建的重组细胞的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建， 特别涉及一种HBD3气管上皮特异性表达载体及其构建的重组细胞。
背景技术：
结核分支杆菌是人畜共患的结核病的致病菌，结核分枝杆菌分为人型、牛型和禽型三种类型，三者存在交叉感染现象。而其中牛的结核分支杆菌能够通过感染的牛奶和空气传播感染人和牛，牛型结核分枝杆菌主要侵害牛，牛结核病是由牛分枝杆菌所引起的一种人畜共患的慢性传染病，其病变特征为病牛逐渐消瘦，在组织器官中形成结节性肉芽肿和干酪样坏死。目前，控制牛结核的唯一方法是通过“检疫-扑杀”措施淘汰阳性牛，但是这一方法对对农业生产和人的生命安全造成了很大的影响。结核病的传统的诊断方法有细菌学诊断和血清学诊断(包括一些分子生物学的方法)。准确而及时的诊断方法对该病的控制极为重要，牛型结核菌素皮内变态反应 (Tuberculin skin test TST)是国际卫生组织唯一推荐的检测方法，但该方法存在非特异性反应和因细胞免疫水平下降引起的假阴性反应等不足，使得结核菌素皮内变态反应的准确性受到质疑。此外对于结核病的预防，人的结核病在预防时可以使用卡介苗和结核DNA 疫苗等；但是对于牛结核病的疫苗还没有商品化使用，因此不能通过免疫来预防。同时牛结核病的治疗只能采用抗生素治疗，如链霉素、卡那霉素等。但是，长期使用抗生素不但会使细菌产生抗药性，还存在牛奶中药物残留的问题，所以寻求一种新的治疗结核病的方法迫在眉睫。近几年，分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展与完善为动物抗病育种提供了新的思路，Dolly羊的诞生，从而使体细胞转基因结合克隆技术培育优良动物品种成为基因工程的焦点。体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J, et al. An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha 1-antitrypsin gene [J]. Theriogenology,2006,65(9) 1800-1812.)，该技术的优点是基因转移在体细胞培养阶段进行，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(WHEELER MB, WALTERS EM. Transgenic technology and applications in swine[J]. Theriogenology,2001,56 1345-69.)。2006年，美国科学家Maga等培育出在乳腺中特异表达人溶菌酶的转基因山 ^ (Maga E A etal Consumption of milk from transgenic goat expression human lysozyme in the mammary gland result in modulation of intestinal microfluro[J]. Transgenic Ras, 2006，15 :515-519)。2009年，西北农林科技大学生物工程研究所培育出在乳腺中特异表达人防御素的转基因奶牛。现在对于体细胞转基因和克隆技术掌握的比较成熟。
2005年，Bruno Rivas-Santiago等人发现在结核病发生发展过程中，人的 HBD2表达量明显升高，说明了 HBD2的产生与结核杆菌入侵有直接的关系。(E. Sada， B.Rivas-Santiago, S. K.Schwander, C. Sarabia，G Diamond，Μ.Ε.Klein—Patel， R. Hernandez-Pando, and J. J. Ellner, Human beta—defensin 2 is expressed and associated with Mycobacterium tuberculosis during infection of human alveolar epithelial cells.Infection and Immunity 73(2005)4505-4511.)2006 Bruno Rivas-Smtiago又发现在小鼠模型上的结核杆菌入侵试验时，小鼠的MBD3和MBD4又明显的升高，特别是在结合杆菌感染后期，这说明防御素对结核杆菌有一定的抑制作用 (R. Hernandez-Pando, B. Rivas-Santiago, E. Sada, V. Tsutsumi, D.Aguilar-Leon, and J.L. Contreras, beta—defensin gene expression during the course of experimental tuberculosis infection. Journal of Infectious Diseases 194(2006)697-701·)。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种HBD3气管上皮特异性表达载体及其构建的重组细胞，利用该细胞系作为核供体细胞，为解决奶牛结核病的转基因奶牛提供坚实的基础。本发明是通过以下技术方案来实现一种HBD3气管上皮特异性表达载体，包含目的基因HBD3，在HBD3基因的上游连接有SEQ. ID. NO. 1所示的MUCl启动子序列。所述的HBD3气管上皮特异性表达载体中HBD3基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2 所示，还在MUCl启动子序列的上游设有标记基因EGFP，EGFP基因的上游设有CMV启动子。
所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，还在目的基因HBD3的下游设有抗生素筛选基因neo基因。所述的neo基因的两侧还设有同向的Loxp序列。所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，包括有以下元件CMV-EGFP-MUC1-HBD3-L oxp-neo-Loxpu所述的HBD3气管上皮特异性表达载体为Mucl-loXp-EGFP-HBD3表达载体，所述的Mucl-loxp-EGFP-HBD3表达载体，先通过Ml I和Me II多克隆位点将HBD3基因克隆到loxp-EGFP-Cl载体上，然后再通过BspEI和HindIII多克隆位点将Mucl启动子克隆到 Loxp-EGFP-HBD3载体上而得到。一种基于HBD3气管上皮特异性表达载体构建的重组细胞，其宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过转染Mucl-loXp-EGFP-HBD3外源性表达载体，将目的基因HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。所述的宿主细胞为3 10代的牛胎儿成纤维细胞。所述的牛胎儿成纤维细胞通过电转染法转染外源性表达载体 Mucl-loxp-EGFP-HBD3。所述的包含目的基因HBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明构建了一种HBD3气管上皮细胞特异性表达载体，通过在HBD3基因5'插
4入Mucl启动子，使得目的基因HBD3在牛的气管上皮细胞中特异的高效表达。气管和肺的上皮细胞是结核杆菌入侵的第一道屏障，气管和肺上皮细胞在结核杆菌侵入机体时会产生一些相应的炎性因子，这些炎性因子能够在一定程度上阻止结核杆菌的入侵，但是并不能杀死入侵的结核杆菌，因此利用上皮细胞启动子产生HBD3，HBD3在牛的气管上皮细胞中特异表达时能够提高牛机体对结核杆菌的抵抗作用。2、本发明将目的基因HBD3克隆到基础载体改造过的Loxp-EGFP-Cl上，构建了 HBD3气管上皮细胞特异性表达载体Mucl-l0Xp-EGFP-HBD3，将其转染到牛胎儿成纤维细胞，构建转基因的牛胎儿成纤维细胞系；荧光显微观察标记基因EGFP的表达情况，并经 G418筛选获得阳性细胞，并进行PCR鉴定证实目的基因HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。3、以包含目的基因HBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转HBD3 基因的牛，该转基因牛可预防结核病的发生。
图1目的基因HBD3连接到骨架载体Ιοχ-EGFP质粒后的酶切鉴定图；图2是PCR扩增的mucl启动子序列连接到loXp-EGFP_HBD3鉴定结果图；图3是Mucl-loxp-EGFP_HBD3质粒的质粒图谱；图4-1 4-2是转染Mucl-loxp-EGFP-HBD3质粒后获得的A549细胞单克隆细胞图；图5是M. bovis结核杆菌感染细胞图；图6是细胞在感染细菌M小时后的荷菌数检测；图7-1 7-2为牛的成纤维细胞的单克隆图；图8单克隆细胞的PCR鉴定结果图；图9用绝对定量的方法做拷贝数分析时获得的目的基因的溶解曲线图；图10-1 10-2是包含Mucl-loxp-EGFP_HBD3表达载体的重组胚的囊胚发育图。
具体实施例方式本发明首先构建含有HBD3和绿色荧光蛋白(EGFP)基因的气管上皮细胞特异性表达载体Mucl-EGFP-HBD3，然后用电转染法将外源性表达载体Mucl-EGFP_HBD3导入牛胎儿成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，经 PCR鉴定，证实目的基因HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；最后，将转染HBD3基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。具体所涉及的试剂和材料如下G418、DMEM培养基购自美国GIBICO(Invitrogen) 公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，胎牛血清购自GIBICO(Invitrogen)公司，细胞培养板和培养皿为丹麦Nimclon公司产品，质粒提取试剂盒购自上海生物工程公司，细胞基因组提取试剂盒购自天根公司，Hot start DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自Takara公司，电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司，限制性内切酶购自MBI公司。Opti-MEM I Reduced Serum Media 购自 Invitrogen 公司。
下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。1、气管上皮细胞特异性表达载体Mucl-EGFP_HBD3的构建1. 1. 1目的基因HBD3的克隆根据GeneID :55894所公布的HBD3基因序列设计引物Pl和P2，提取人血液总DNA， 以DNA为模板用引物P1、P2进行PCR扩增，所述的引物对序列如下正向弓丨物 Pl :agagtcgaca gcagctatga ggatc 25;反向弓丨物 P2 :ctccgcggtt ttatttcttt cttc 24;其中，P1、P2分别进入了 Ml I.Sac II位点;50μ L 的 PCR 反应体系为10 X PCR Buffer :5μ L，dNTP (2. 5mmol/L) :2 μ L， Pl (10 μ mol/L) 1 μ L, Ρ2 (10 μ mol/L) : 1 μ L，LATaq 酶0· 5 μ L，模板 1 μ L，加超纯水至 50 μ L0PCR反应条件为95 °C预变性5min ；95°C变性30s，60°C退火45s，72 °C延伸Im 20s, 35 个 PCR 循环；72°C再延伸 IOmin ；PCR扩增完成后，将扩增产物纯化，将纯化的PCR产物与pMD-18T载体在4°C于DNA 连接酶作用下过夜连接(TA克隆)，然后将重组的载体转化感受态细胞E. coli DH5ci，通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，摇菌、提质粒，酶切鉴定正确的质粒命名为重组质粒 PTA-HBD3。将质粒送交南京金斯特公司测序。测序结果表明，HBD3基因克隆成功。1. 1. 2Mucl启动子区片段的扩增及其TA扩增MUCl是mucins粘蛋白家族成员，存在于正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面，正常组织MUCl分布于腺管上皮细胞分泌极，与免疫细胞相对隔离，而在肿瘤组织其广泛分布并异常丰富地表达于肿瘤细胞。MUCl在怀孕期的肺部高水平的表达，然而在成年人的肺部，支气管上皮比主支气管的MUCl表达量高。对老鼠的研究中表明Mucl的表达和很多组织中的极性的上皮细胞形态有关，包括肺部组织。Mucl能够用来作为启动子启动HBD3 在上皮细胞的表达。Mucl启动子区的扩增采用Takara公司的La taq with GC Buffer扩增获得，具体设计P3/P4所示的扩增引物，以牛的基因组为模板扩增M97bp的片段的Mucl启动子。P3 :cgctccggat agtagaatgt aagttagaP4:tataagcttg gtggtggcaa agtggPCR扩增完成后，将扩增产物纯化，将纯化的PCR产物与PMD-19T (TA克隆)于4°C 在DNA连接酶作用下连接过夜。所扩增的Mucl启动子的序列如SEQ. ID. NO. 1所示，其中序列中连续的η为基因组的gap接头，为任意碱基。1. 2Mucl-EGFP-HBD3表达载体的构建过程1. 2. 1 Loxp-EGFP (LPEP)骨架载体的准备Loxp-EGFP是一种包含G418抗性筛选基因neo和带有CMV启动子的标记基因EGFP 绿色荧光蛋白的表达载体。为了在neo序列两侧加上Loxp序列，同时简化载体，该载体的构建是在PEGFP-Cl载体的基础上切除了 fl ori的一部分(1647-2075)，然后在其neo元件的两侧加上两个同方向的Loxp序列(ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat)，构建成功的表达载体大小为4261 bp。Loxp-EGFP载体转染哺乳动物细胞中，标记基因EGFP被表达后产生绿色荧光。1. 2. 2 Loxp-EGFP-HBD3 载体的构建Loxp-EGFP-HBD3载体构建如下从PTA-HBD3质粒中扩增HBD3序列(HBD3序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示)，经过胶回收后得到的HBD3序列和Loxp-EGFP载体分别用MlI和Hind III双酶切，回收酶切片段，T4 DNA连接酶过夜，转化感受态大肠杆菌 DH5 α，次日挑取阳性克隆，提取质粒用Mil/Hind III双酶切和Mil单酶切鉴定，正确的命名为Loxp-EGFP-Cl-HBD3。Loxp-EGFP-Cl-HBD3的酶切鉴定结果如图1所示，可以看到Mil酶切之后，获得 5417bp大小的片段，Sall/SacII双酶切之后获得4261bp和1156bp的片段。说明HBD3片段已经连接到载体上。1. 2. 3在骨架载体构建完成之后，Mucl-loxp-EGFP-HBD3载体的构建如下将Loxp-EGFP-HBD3和纯化的扩增的mucl启动子序列分别用BspE I和HindIII双酶切，分别回收以后，用T4DNA连接酶4°C连接过夜，连接完成之后转化感受态细胞E. coli DH5 α，通过α -互补的蓝白斑筛选挑选重组子，提取质粒后用BspE I和Hind III双酶切鉴定阳性重组质粒，获得Mucl-loXp-EGFP-HBD3表达载体。Mucl-loXp-EGFP-HBD3的酶切鉴定结果如图2所示，可以看到BspEI单酶切之后获得大小为7914bp大小的片段，BspE I和Hind III双酶切后获得大小为5417bp和2497bp 大小的片段，说明载体已经构建成功。参见图3所示的质粒图谱，其中CMV和P SV40分别是两个真核表达的启动子。Mucl 启动子后加上HBD3启动其表达。TAA为终止密码子，其作用是终止EGFP蛋白的表达。SV40 poly A为真核表达载体的终止子，能够稳定HBD3的表达。1. 3 Mucl-loxp-EGFP-HBD3表达载体抗菌性的验证1. 3. 1由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，所以本发明使用了去内毒素的质粒提取试剂盒，以减少内毒素对试验结果的负面影响。用promega公司的去内毒素的质粒纯化试剂盒提取质粒后用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度，经测定，质粒的浓度为910. 5ng/y 1, 0D260/280为1. 82，说明质粒较纯，可用于后续的细胞转染。1. 3. 2Mucl-loxp-EGFP-HBD3表达载体转染A549人非小细胞肺癌细胞具体采用电转染法，将表达载体Mucl-loxp-EGFP_HBD3转染A549细胞。细胞达到90%汇合时，消化细胞后离心(lOOOr/minJmin)收集细胞，然后用Opti-MEM I Reduced Serum Media洗涤细胞2次，每次清洗的过程中要轻轻慢慢的吹打细胞，防止细胞受到损害，将电转染液(cell 盐opti = 3 1V/V ；cell 盐KCl :120mm ；CaCl2 :0. 15mm ； K2HPO4 :10mm ;Mgcl2 :50mM ；调 PH 至 7. 6 ;opti (即Opti-MEM I Reduced Serum Media) 和线性化的表达载体灿01-10即46 -冊03(2(^0的混合液(800 μ 1)加到经离心弃去培养液的离心管中(加完质粒后加opti至800 μ L)，轻轻吹打细胞，使其完全吹散，混勻。将上述细胞悬液转移到BTX电击杯中(4mm间隙，黄色盖子，800 μ L容积)，静置IOmin ；将电转染参数设置如下电压500V ；脉冲时间1ms ；电击次数2次，静置完成之后进行电转染。
转染完成后，细胞静置lOmin，然后将细胞悬液全部转移到60mm培养皿中；加入 37°预温的含10%胎牛血清的DMEM完全培养液3mL，将培养液置于37°、5%的CO2培养箱中，待细胞贴壁后，弃去培养液(培养液中含有电转染液影响细胞生长)，换成经37°温育的DMEM完全培养液4mL，24h后加入G418至终浓度为600 μ g/ml。经过15天的筛选后获得A549阳性克隆细胞。如图4-1 4-2所示，其中图4_1为筛出的A549单克隆的正常光图片，图4-2为单克隆细胞的荧光图。1. 3. 3 A549细胞及A549细胞单克隆细胞的细菌感染将Middlebrook 7H10上处于对数生长期的M. bovis菌落，按照Hmama等人的方法在感染细胞前对M. bovis进行处理，制成浓度为1 X IOVml细菌悬液，在细菌感染前1天， 将转HBD3的A549细胞和正常的A549细胞分别按2X IO4个细胞接种到12孔板。将准备的细菌悬液按细胞细菌=1 10加入各组细胞孔中，5% C02，37°C培养4小时，PBS吸去细菌，加入新鲜DMEM培养液继续培养M小时，其中取一孔做抗酸染色确定M. bovis细菌的入侵。然后分别将两种细胞的培养液洗掉，用100 Triton X_100裂解两组细胞，用M7H9液体培养基进行IO3倍稀释，吸取100 μ 1涂布于Μ7Η10培养基上，置于37°C培养箱培养三周后进行菌落计数。如图5为M.bovis细胞对转HBD3细胞和正常A549细胞的入侵。其中细胞周围的小红色点点为入侵的结核杆菌。图6为细菌感染正常A549细胞和转基因以后的A549细胞 (H-A549 cells)细胞内的荷菌数，从图中可以看到转基因细胞内的细菌数显著减少。2,Mucl-loxp-EGFP-HBD3表达载体转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞系2. 1牛胎儿成纤维细胞的培养从液氮中取一管第三代荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞于38°C解冻，离心。弃去废液，加3ml细胞悬浮液(含10% FBS的DMEM)重悬，接种于60mm的培养皿中(含10% FBS的DMEM)，置于(X)2培养箱中37°C条件下培养。待牛胎儿成纤维细胞达到80%汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，在倒置显微镜下观察细胞。待大多数细胞变圆、细胞间隙扩大时，用等体积含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打混勻后，离心收集，悬浮，按1 3的比例接种于60mm培养皿，放入CO2培养箱中培养，选取3 10代传代的细胞达到90%汇合的牛胎儿成纤维细胞，作为用于转染的宿主细胞。本发明以G418作为筛选药物，由于表达载体Mucl-loXp-EGFP-HBD3的骨架上有 G418抗性基因neo，外源基因Mucl-loXp-EGFP-HBD3得到表达的牛胎儿成纤维细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。G418最小致死浓度的测定在牛胎儿成纤维细胞培养液(DMEM细胞培养液)中分别加入浓度梯度的G418筛选1周，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中 G418的浓度大于或等于600 μ g/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600 μ g/ml。2. 2载体质粒Mucl-loxp-EGFP_HBD3的线性化准备将提纯后的Mucl-loXp-EGFP-HBD3质粒用ApaL I限制性内切酶切成线性化质粒， 然后用promage的Wizard DNA Clean-up System回收酶切好的质粒，测浓度为900ng/μ 1
8CN 102533857 A
2. 3 Mucl-loxp-EGFP-HBD3表达载体转染牛胎儿成纤维细胞本发明具体采用电转染法，将表达载体Mucl-l0Xp-EGFP-HBD3转染牛胎儿成纤维细胞。细胞达到90%汇合时，消化细胞后离心(lOOOr/minJmin)收集细胞，然后用 Opti-MEM I Reduced Serum Media洗涤细胞2次，每次清洗的过程中要轻轻慢慢的吹打细胞，防止细胞受到损害，将电转染液(cell盐opti = 3 1 V/V ；cell盐KCI 120mm ；CaCl2 0. 15mm ；K2HPO4 :10mm ；Mgcl2 :50mM ；调 PH 至 7· 6 ；opti (即 Opti-MEM I Reduced S erum Media)和线性化的表达载体 Mucl-loxp-EGFP_HBD3 (20 μ g)的混合液 (800 μ 1)加到经离心弃去培养液的离心管中(加完质粒后加opti至800 μ L)，轻轻吹打细胞，使其完全吹散，混勻。将上述细胞悬液转移到BTX电击杯中(4mm间隙，黄色盖子，800 μ L 容积)，静置IOmin ；将电转染参数设置如下电压500V ；脉冲时间1ms ；电击次数2次，静置完成之后进行电转染。转染完成后，细胞静置lOmin，然后将细胞悬液全部转移到60mm培养皿中；加入 37°预温的含10%胎牛血清的DMEM完全培养液3mL，将培养液置于37°、5%的CO2培养箱中，待细胞贴壁后，弃去培养液(培养液中含有电转染液影响细胞生长)，换成经37°温育的DMEM完全培养液％iL，24h后加入G418至终浓度为600 μ g/ml。2.4 Mucl-loxp-EGFP_HBD3载体阳性表达的细胞筛选Mucl-loxp-EGFP-HBD3转染牛胎儿成纤维细胞24h后，在含血清的DMEM细胞培养液中添加600 μ g/ml的最小致死浓度的G418筛选；以未转染Mucl-loxp-EGFP_HBD3的牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418(600y g/ml)。Mucl-loxp-EGFP-HBD3转染细胞24h后，表达载体被表达之后能够在荧光显微镜下可以看到绿色荧光。当转基因的牛胎儿成纤维细胞发出如图7-1 7-2所示的绿色荧光， 说明Mucl-loxp-EGFP-HBD3已经进入细胞并且阳性表达；Mucl-loxp-EGFP_HBD3转染细胞 7d后，对照组的细胞全部死亡，将包含Mucl-loxp-EGFP-HBD3转染阳性的细胞组的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，可见到阳性细胞形成岛屿状细胞群，在荧光显微镜下仍然可以看到绿色荧光；然后消化细胞用不加G418的正常培养液扩大培养。所筛选的阳性细胞都是稳定转染Mucl-l0Xp-EGFP-HBD3的细胞，目的基因 HBD3整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外；在稳定转染的过程中，质粒 Mucl-loxp-EGFP-HBD3上携带的基因会整合到宿主细胞的基因组上；通过G418筛选7天再半剂量持续筛选来达到稳定转染的目的，表现为报告基因在被转染的阳性细胞内持续表达，因此筛选的阳性细胞持续发出绿色荧光并呈现G418抗性。以上构建的通过整合Mucl-loXp-EGFP-HBD3载体到细胞基因组，得到包含目的基因HBD3的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞。2. 5Mucl-loxp-EGFP-HBD3载体阳性表达细胞的PCR鉴定根据载体上的3段序列设计3段引物，这三段引物包含整个载体的序列，分别是 GFP-Epro F GGCGTGGATAGCGGTTTGACT 2IbpGFP-Epro R GGGTGCGTGATTTGGGAAGAC 2IbpEpro-HBD3 F GAGGAGTTGGGTTCACCTTGGAG 23bpEpro-HBD3 R :TCTTTCTTCGGCAGCATTTTCG 22bpHBD3-ApaL FCAGACTGGGTGACAGGGTGAGAG 23bp
HBD3-ApaL R CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATG 23bp三对引物的扩增片段大小分别是GFP-Epro :2059bp，Epro_HBD3 3256bpHBD3-ApaL :3000bp其中前两对引物用Takara LA Taq with GC Buffer扩增，最后一对引物用Takara LA Taq扩增。最后获得阳性结果，PCR鉴定结果如图8所示，其中图中前三个电泳到分别为2059bp，3256bp和3000bp，证明此单克隆细胞中已经成功转染细胞(阳性细胞)，后三个泳道为阴性对照。上述PCR鉴定结果证明了所挑取的单克隆基因组已经整合了目的基因腳3。2. 6所挑取的单克隆细胞的拷贝数分析因为所获得的单克隆包含了整个质粒的部分，所以要做其拷贝数分析可以利用整个质粒上任意一段序列作为目的序列来扩增其拷贝数。具体根据EGFP序列设计了如下一对引物QEGFP-F CAGAAGAACGGCATCAAGGTGQEGFP-R CTCGTTGGGGTCTTTGCTCA然后根据定量PCR中基因组的用量(SOng)和质粒的大小推算出当基因组中存在一个拷贝时所用的质粒的用量(0. 12pg)，倍比稀释后获得标准样品，目的基因的溶解曲线图具体如9所示，只有一个峰值，说明所扩的片段特异性很好。根据标准样品获得的标准曲线推算出所获得的阳性克隆的拷贝数为1，即每一个细胞中大约有一个拷贝的质粒存在。3.获得的转基因牛胎儿成纤维细胞为核供体细胞，构建转基因克隆胚3. 1卵母细胞的成熟培养卵巢采自西安市屠宰场，无菌采取荷斯坦奶牛卵巢，在37°C无菌生理盐水中4 6 小时内运回实验室，抽取3 8mm直径的卵泡，收集卵丘卵母细胞复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞，胞质均勻的卵母细胞用于成熟培养。卵母细胞的成熟培养液为TCM199 (Gibico)加10%胎牛血清，10ng/ml的表皮生长因子，培养条件为38. 5°C, 5% C02，95%空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2%透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体的排放作为卵母细胞成熟的判定标志，挑选成熟卵母细胞用于核移植试验。3. 2转基因克隆胚的构建采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中，其中，整合有外源基因的供体细胞是关键，本发明将供体细胞控制到10代以内，这主要考虑减少体外培养导致的突变在培养过程中的积累。核移植具体为显微操作液为含10% FBS,5yg/ml细胞松弛素B的PBS，用内径 20 μ m的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10 μ g/mlHoechst 33342染色lOmin，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。卵母细胞的注核与融合，具体过程如下0. 25%胰蛋白酶消化接触抑制3d的6 10代的转染Mucl-l0Xp-EGFP-HBD3的荷斯坦牛胎儿成纤维细胞用做供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下。核质复合体在电融合液中平衡3min，用微电极法进行融合，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予电脉冲进行电融合。融合电压为^V，融合时间为
10IOym0融合后的重组体放入10% FBS的M199中，38. 5°C、5% CO2、饱合湿度下培养，2h后观察融合情况。3. 3转基因克隆胚的激活及体外培养融合的重组胚在含10% FBS的M199中平衡池后，用含5 μ mol/L离子霉素 (Ionomycin,购自SIGMA公司)的mSOF培养液(购自SIGMA公司)处理5min，然后在含 2mmol/L 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在(X)2培养箱中平衡至少池的mSOFaa中培养，培养密度为5 μ L每个重组胚，在 38. 5°C,5% CO2、饱和湿度下培养，第7 9天检查囊胚发育情况，如图10_1所示，克隆胚正常发育至囊胚，图中黑色部分为内细胞团，外围为滋养层细胞。图10-2所示为囊胚的发育荧光图，说明目的基因已经整合进了胚胎中，同时证明表达载体MUCl-loXp-EGFP-HBD3的转基因克隆胚的构建成功，为预防牛结核病提供了坚实的基础。
权利要求
1.一种HBD3气管上皮特异性表达载体，其特征在于，包含目的基因HBD3，在HBD3基因的上游连接有SEQ. ID. NO. 1所示的MUCl启动子序列。
2.如权利要求1所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，其特征在于，所述的HBD3基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；还在MUCl启动子序列的上游设有标记基因EGFP，EGFP基因的上游设有CMV启动子。
3.如权利要求1所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，其特征在于，所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，还在目的基因HBD3的下游设有抗生素筛选基因neo基因。
4.如权利要求3所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，其特征在于，所述的neo基因的两侧还设有同向的Loxp序列。
5.如权利要求1所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，其特征在于，所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，包括有以下元件CMV-EGFP-MUCl-HBD3-Loxp-neo-Loxp。
6.如权利要求1所述的HBD3气管上皮特异性表达载体，其特征在于，所述的HBD3气管上皮特异性表达载体为Mucl-loxp-EGFP-HBD3表达载体，所述的Mucl-loxp-EGFP_HBD3表达载体，先通过Ml I和Mc II多克隆位点将HBD3基因克隆到loxp-EGFP-Cl载体上，然后再通过BspEI和HindIII多克隆位点将Mucl启动子克隆到Loxp-EGFP-HBD3载体上而得到。
7.一种基于HBD3气管上皮特异性表达载体构建的重组细胞，其特征在于，其宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过转染Mucl-l0Xp-EGFP-HBD3外源性表达载体，将目的基因HBD3 整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。
8.如权利要求7所述的基于HBD3气管上皮特异性表达载体构建的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为3 10代的牛胎儿成纤维细胞。
9.如权利要求7所述的基于HBD3气管上皮特异性表达载体构建的重组细胞，所述的牛胎儿成纤维细胞通过电转染法转染线性化的外源性表达载体Mucl-l0Xp-EGFP-HBD3。
10.权利要求7所述的基于HBD3气管上皮特异性表达载体构建的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
全文摘要
本发明公开了一种包含HBD3气管上皮细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞，构建了一种包含HBD3气管上皮细胞异性表达载体Muc1-loxp-EGFP-HBD3，以及基于该载体的包含HBD3气管上皮细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，利用该细胞系作为核供体细胞，为解决奶牛结核病的转基因奶牛提供坚实的基础。本发明通过电转染法将外源性表达载体Muc1-loxp-EGFP-HBD3导入牛胎儿成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定，证实目的基因HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；最后，将转染HBD3基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。
文档编号C12N15/85GK102533857SQ20121003949
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者余源, 刘军, 张涌, 权富生, 李倩, 王勇胜, 罗艳, 苏峰 申请人:杨凌科元克隆股份有限公司, 西北农林科技大学