专利名称：一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用。
背景技术：
鬼白毒素是重要的芳基四氢萘内酯类木脂素，具有广泛生物学活性的天然化合物，有拟雌激素样、抗雌激素样、抗癌、抗病毒、抗免疫、抑菌杀虫、治疗牛皮癣、疟疾、 类风湿性关节炎、多发性硬化、抑制植物生长、抗氧化等作用，是近年来合成抗癌药物 VP-16(etoposide)和VM-洸(teniposide)等的前体物质。VP-16和VM-洸对小细胞肺癌、 淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效，已开发成为抗癌药物应用于临床。目前鬼白毒素主要是从野生鬼白类植物的根茎中提取，而这类植物在全世界仅有 4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭、西藏等高海拔地区。野生鬼白类植物生长缓慢，且其中鬼白毒素类物质的含量较低。随着医学和农林防治方面对鬼白毒素类物质需求量日益增加，随着对野生鬼白类植物原料的采集的加剧，其资源遭到严重破坏，造成了生物多样性和生态环境的不可逆损失；由于鬼白毒素类物质化学结构复杂，对其进行化学全合成的难度较大；基因工程学手段构建工程菌也由于参与形成该类物质的酶数量过多而无法进行。因此需要寻找有效可行的制备鬼白毒素类物质的方法。近年来，已有学者从鬼臼类植物(包括八角莲属、桃儿七属、足叶草(鬼臼)属和山荷叶属)中分离到产鬼白毒素类似物内生真菌，其培养物经TLC检测和HPLC检测，与鬼臼毒素标准品有相同的Rf值和保留时间(川八角莲内生真菌产鬼臼毒素类似物的初步研究，郭仕平、蒋斌等，生物技术，2004. 14(2) 55-56 ；鬼白类植物产鬼白毒素内生菌的筛选， 杨显志，郭仕平等，2003. 15(5) =419-422 ；从南方山荷叶分离出一株产鬼臼毒素类似物的内生真菌，曾松荣，邵华等，微生物学杂志，2004, ) :1-2.)。因此，利用内生菌具有产生和宿主相同或相似的生物活性物质的性质，可能是一种解决鬼白毒素的来源问题的有效方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种镰孢(Fusarium sp. ) TG-9。本发明提供的镰孢(Fusarium sp. ) TG-9，其保藏号为CGMCC No. 55观。上述镰孢(Fusarium sp. )TG_9 CGMCC No. 55 在制备鬼臼毒素中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种制备鬼臼毒素的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤发酵上述的镰孢(Fusarium sp. )TG-9CGMCC No. 5528,收集发酵产物，即得到鬼白毒素。上述方法中，所述发酵的温度为-30°C，所述发酵的转速为100rpm-150rpm， 所述发酵的旋转半径为2cm，所述发酵的时间为5天-9天。上述方法中，所述发酵的温度具体为27°C，所述发酵的转速具体为120r/min，所述发酵的时间具体为8天。上述发酵采用的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，是按照如下方法配制的称取马铃薯200g (去皮、切成约2cm2的小块)，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补足水至IOOOmL,自然pH。上述方法中，在所述发酵后，还包括如下步骤1)将所述发酵产物抽滤，收集滤液；2)将步骤1)得到的滤液加入氯仿萃取，收集有机相，得到鬼白毒素。上述方法中，所述滤液和所述氯仿的体积比为1 1。上述提到的菌株TG-9于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5528，其分类命名为镰孢(Fusarium sp.)。本发明的实验证明，本发明提供了一株菌株，其可以用于制备鬼臼毒素。本发明的制备鬼白毒素的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点，为制备鬼臼毒素提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。
图1为镰刀菌属真菌的菌落图2为镰刀菌属真菌的菌丝体和孢子形态图3为混标与样品TG-9提取物在HPLC-MS检测中HPLC图谱图4为混标与样品TG-9提取物的EIC图谱图5为标准品鬼臼毒素与样品TG-9提取物在保留时间Hmin时的MS图谱
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、菌株TG-9的分离与鉴定一、分离从甘肃省兰州市兴隆山(海拔2300m)采集新鲜植物桃儿七(Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying)。将采集的植物材料进行粗处理，选取健康的为霉烂货干枯的植物组织，并将所需部分(主要是根或根状茎以及茎)用清水洗去泥沙及其它杂质，然后用滤纸洗去植物组织表面残留的水分。在超净工作台中，用75 %乙醇处理lmin，无菌水冲洗5次，而后用10%次氯酸钠处理6min，再用无菌水冲洗5次，每次lmin，最后再用75%酒精漂洗30s，无菌水漂洗5次，每次lmin。用灭菌的镊子和刀片将材料外皮剥去，再切成0. 5cmX Icm大小的小片种植于PDA固体培养基上，培养10天。同时将同样灭菌处理过的材料不做剥皮及切割，在PDA培养基上滚动一周，同条件培养，作为对照观察，以排除表面微生物。培养几天后发现在材料切口处有菌丝长出，取切口处新长出的菌丝，及时转接到新鲜PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落形态，颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取各培养基上的菌落边缘的菌丝接于新的培养基上进行分离培养，直至培养为单一菌株，将此菌株命名为TG-9。二、鉴定将上述菌株TG-9进行如下生理生化、菌形态的鉴定(1)菌落特征菌株TG-9的菌落形态如图1所示，可以看出，菌落直径不断增大，中央颜色也不断加深，并随菌落直径增大而扩大，至培养结束，菌落直径79mm，毡状，厚，呈橙黄色，中央略凹陷，颜色稍浅，边缘白色，反面中央呈褐色或橙色，边缘白色，似无结实。(2)菌丝形态特征菌株TG-9的孢子头和孢子形态如图2所示，A为菌丝体形态，B为孢子形态，可以看出，菌丝分枝生长，有隔膜，呈暗橘黄色；产生大型孢子，呈长柱形，未见小型孢子，有厚垣孢子，菌落呈絮状，生长状态下，菌丝呈束状结合。综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》，本发明菌株TG-9为镰刀菌属真菌(Fusarium)，其分类属是属于半知菌类的真菌，归属于丛梗孢目，瘤座孢科，镰刀菌属。上述提到的菌株TG-9于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5528，其分类命名为镰孢(Fusarium sp.)。实施例2、菌株TG-9制备鬼臼毒素一、发酵液的获得将IOOml制备好的马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中，灭菌，挑镰孢(Fusarium sp.) TG-9CGMCC No. 55 菌丝(也可以是孢子)接种于三角瓶中，，120r/min(旋转半径2cm)摇床培养7天，得到发酵产物。马铃薯葡萄糖液体培养基是按照如下方法配制的称取马铃薯200g(去皮、切成约2cm2的小块)，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补足水至IOOOmL,自然pH。二、发酵液的氯仿提取物的获得用抽滤器将上述一得到的发酵产物抽滤两次，分别收集菌丝体与发酵液(滤液)；将上述发酵液用等体积的氯仿萃取，收集有机相，即为氯仿萃取液。随时取萃取液于紫外检测仪下检测，直至萃取液在紫外检测器下无荧光，收集萃取液，减压蒸馏回收浓缩，得到氯仿提取物。三、氯仿提取物的检测下述实验均重复三次，结果取平均值。下述实验用的标准品为混标或鬼白毒素标准品，为将鬼白毒素标准品、鬼白毒素单葡萄糖苷、表鬼白毒素双葡萄糖苷溶于无水甲醇，得到混标，鬼白毒素标准品在混标中的浓度为2. Omg/ml，鬼臼毒素单葡萄糖苷在混标中的浓度为1. 3mg/ml，表鬼臼毒素双葡萄糖苷在混标中的浓度为1. Omg/ml。鬼臼毒素标准品P购买于中国药品生物制品鉴定所，其分子结构式如下式I
权利要求
1.镰孢(Fusariumsp.) TG-9，其保藏号为 CGMCC NO. 5528。
2.权利要求1所述的镰孢(Fusariumsp.) TG-9CGMCC NO. 5528在制备鬼臼毒素中的应用。
3.一种制备鬼臼毒素的方法，包括如下步骤发酵权利要求1所述的镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No. 5528,收集发酵产物，即得到鬼臼毒素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为^TC_30°C，所述发酵的转速为100rpm-150rpm，所述发酵的旋转半径2cm，所述发酵的时间为5天-9天。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为^°C，所述发酵的转速为120r/min，所述发酵的时间为7天。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于在所述发酵后，还包括如下步骤1)将所述发酵产物抽滤，收集滤液；2)将步骤1)得到的滤液加入氯仿萃取，收集有机相，得到鬼白毒素。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述滤液和所述氯仿的体积比为 1 1。
全文摘要
本发明公开了一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用。本发明提供的镰孢(Fusarium sp.)TG-9，其保藏号为CGMCC No.5528。上述镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No.5528在制备鬼臼毒素中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明提供了一株菌株，其可以用于制备鬼臼毒素。本发明的制备鬼臼毒素的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点。本发明方法为制备鬼臼毒素提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。
文档编号C12N1/14GK102559517SQ201210039269
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者张嘉, 朱妍妍, 梁子臻, 赵长琦, 钱沚莹 申请人:北京师范大学