专利名称：一种链霉菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种链霉菌菌株及其应用。
技术背景
真菌引起的感染分为浅表真菌感染和深部真菌感染。浅表真菌感染的传染性强， 其常见致病菌是各种癣菌，主要侵犯皮肤、毛发、指(趾)甲等，这些真菌病虽然顽固但不致命。深部真菌感染常见的病原菌为念珠菌属和曲霉菌，主要侵犯内脏器官和深部组织，危害性极大，常可危及生命，其中，白色念珠菌(Candida albicans)是造成深部真菌感染的一类主要的病源真菌，它是造成医院血液感染的主要原因，在伤口和体液中感染时具有很强的致死性，而且临床研究发现其致死率并不随常规抗真菌药物的使用而下降。
过去，真菌感染一般只发生在特定的亚群患者中，然而随着化疗、移植、HIV/ADIS 感染或糖尿病等免疫受损患者数量的增多，真菌感染的发病率也不断提高，侵入性真菌感染(Invasive Fungal Infections，简写为IFIs)的预防和治疗领域正逐渐向接受化疗、移植以及HIV/ADIS或糖尿病患者等人群扩展，因此抗真菌药物市场具有巨大的发展空间。目前微生物来源的抗真菌抗生素也已得到了飞速发展，从微生物次级代谢产物中发现新型抗真菌抗生素是获得抗真菌抗生素的一条重要途径。
在临床上，随着真菌感染率的上升，对抗真菌药物的使用率不断提高，随之而来的是耐药菌株也不断增多，已有抗真菌抗生素的疗效大幅度降低，给临床的治疗也带来一定的困难，因此寻找安全、高效、低毒、广谱的新型抗真菌抗生素已越来越引起人们的重视。
近10年来(1996 2005)，各国报道的新抗真菌抗生素约有174种，化学结构多达30余个类型，其中有一部分抗生素专抗植物真菌，而大多数抗动物真菌的抗生素或因抗真菌谱过窄，体内活性微弱，或因细胞毒性较强等，天然物本身与经过结构修饰的产物，具有发展前景者不多。
放线菌(Actinomycete)是一类具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性细菌，因菌落呈放射状而得名，大多数有发达的分枝菌丝。放线菌重要的属包括链霉菌属和小单孢菌属等， 其中，链霉菌是放线菌中最大的一个类群，是抗生素的重要生物来源。
rDNA由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。其中16S rRNA序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法。现在人们对16S rDNA序列有了清晰的认识，目前已经明确细菌的16S rDNA全长约1540bp，片段长度适中，信息量较大且易于分析。在细菌的16S rDNA中有多个区段高度保守，根据这些保守区人们可以设计出细菌的通用引物，用它们可以扩增出所有细菌的16S rDNA片段，扩增得到的细菌的16S rDNA片段根据扩增产物分析方法的不同，发展了多个分支，如16S rDNA的限制性片段长度多态性(RFLP)分析(ARDRA)、末端限制性片段长度多态性(TRFLP)分析、单链构象多态性(SSCP)、DGGE的巢式PCR扩增。发明内容
本发明提供了一种链霉菌菌株及其应用，该链霉菌菌株抑制真菌效果好，尤其对白色念珠菌具有很好的抑制效果，对于真菌病的治疗具有重要意义。
一种链霉菌菌株，命名为链霉菌(Streptomyces sp. ) ZJU088，其保藏号为CGMCC No.4889。
所述的链霉菌ZJU088于2011年5月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4889，该菌株的分类命名为链霉菌Mi^ptomyces sp. ο
所述的链霉菌ZJU088的生物学特征为菌落颜色是灰色，菌落形态较圆整，表面有褶皱，中间突起呈白色，直径大小为中型(约5mm左右)，菌株产芽孢的时间在培养4d达到高峰，7d完全成熟。
所述的链霉菌ZJU088的16S rDNA序列如SEQ ID NO 1所示。
本发明还提供了一种如所述的链霉菌ZJU088在抑制白色念珠菌生长中的应用。
通过对本发明的链霉菌菌株进行抑菌试验，发现该菌株对白色念珠菌(Candida albicans)具有强烈的抑菌效果；通过对链霉菌ZJU088的形态观察、培养特征及16S rDNA序列分析，链霉菌ZJU088具备典型的放线菌形态特征，16S rDNA序列与链霉菌 (Stroeptomyces)的同源性为 99%。
图1为本发明链霉菌菌株ZJU088的形态学结构特征图2是对本发明链霉菌菌株ZJU088的16S rDNA序列的PCR扩增产物的电泳图 (图中 M 为 DL3000Marker，1 为 Sti^ptomyces sp.)。
具体实施方式
培养基
(1)斜面培养基(高氏一号培养基，g/L)淀粉 2. 0，NaCl 0. 5，KNO3 0. 1，K2HPO4 0. 05，MgSO4 0. 05，FeSO4 0. 001，琼脂 2. 0，土豆汁 10. 0，调 pH 7. 2 7. 4。
(2)种子培养基(g/L)葡萄糖 1. 5，酵母粉 1. 0，K2HPO4 0. 1，MgSO4O. 05，FeSO4 0. 001，调 pH7. 0 后加 CaCO3 0. 04。
(3)发酵培养基(g/L)黄豆粉0. 6，可溶性淀粉3. 0，酵母粉1. 0，K2HPO4 0. LNaCl 0. 2，MgSO4 0. 05，FeSO4 0. 002，pH 7. 0。
(4)白色念珠菌培养基(g/L):葡萄糖2. 0，蛋白胨1. 0，琼脂2. 0。
供试菌株
白色念珠菌(Candida albicans)菌株为实验菌株，无特异性要求。
实施例1菌株分离纯化
土壤样品在浙江东海划定的区域内进行五点交叉采样，每点采取土样10g，放入锥形瓶内，混勻后取土壤样品10g，加到一个装有90ml无菌水的锥形瓶中，置于摇床上振荡 30min，使土样中的菌体充分分散于水中，即为KT1菌液。接种环火焰灭菌冷却后蘸取一环稀释度为10—1菌液，在高氏一号培养基平板上作四区划线接种，28°C培养5d，然后挑取单菌4落划线，进一步纯化。
将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，移入无培养基平皿二8°C 培养4d后移入涂布白色念珠菌的平板，琼脂块中心间隔距离为km，培养过夜，根据抑制圈大小选择单菌落进行复筛。
复筛采用摇瓶培养法进行，取初筛得到的50株菌种，接入到种子瓶中，250ml锥形瓶中装25ml种子培养基，初始pH 7.0J8°C下200r/min培养Mh。再将种子液以10% (ν/ν) 的接种量接入到发酵培养基中，250ml三角瓶中装40ml发酵培养基，28°C、pH 7. 0下200r/ min培养4d，离心取上清液，注入白色念珠菌培养基中，比较50株菌种所产抗真菌物质抑制白色念珠菌的程度，最终获得1株最高效抑制白色念珠菌的菌株，编号为ZJU088。斜面培养基保藏菌株于4°C冰箱中，长期保藏采用甘油管保藏法于-20°C冻存。
实施例2菌株鉴定
(1)形态观察
在高氏一号培养基上生长良好，菌落颜色是灰色，菌落形态较圆整，表面有褶皱， 中间突起呈白色，直径大小为中型(约5mm左右)，菌株产芽孢的时间在培养4d达到高峰， 7d完全成熟。在平板上培养4d后，挑取单菌落，在光学显微镜下观察，结果如图1所示，根据形态观察和光学显微镜下孢子及菌丝体的观察，可初步鉴定为一种放线菌。
(2) 16S rDNA 序列分析
取1环经活化的放线菌菌种，接入种子培养基中培养Mh，然后按10% (ν/ν)的接种量接入发酵培养基中下200r/min培养4d，用纱布过滤，收集菌体在60°C下烘干，然后用液氮破壁，并在-80°C下保藏。利用下述改良CTAB法进行菌种基因组DNA提取， 在-20°C下保存。
改良CTAB 法
①取1.5ml EP管，挑取覆盖管底Imm破壁后的菌体，加入545 μ L TE缓冲液 (10mmol/L Tris. HCl, pH 8. 0 ； lmmol/L EDTA, pH 8. 0)，加入 20 μ L 溶菌酶 QOmg/ml)，用枪头反复吹打使之重悬，然后加入30 μ L 10%305和61^ 10mg/ml的蛋白酶K，37°C温浴 3h ；
②力口5yL 10mg/ml RNaseIh ；
③加IOOyL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加 80 μ L CTAB/NaCl，混勻，65 °C 温浴 IOmin ；
④加入与上述总体积等体积的氯仿/异戊醇(ν/ν 24 1)，混勻后16000Xg，离心5min，重复三次后转移上清液。
⑤加入与上清液等体积的酚氯仿异戊醇(ν/ν/ν 25 24 1)混合溶液，混勻后，16000Xg离心lOmin，转移上清液。
⑥加入上一步上清液0. 6倍体积的异丙醇，轻轻混合到DNA沉淀，16000Xg离心 lOmin，弃上清。
⑦向沉淀中加70%乙醇进行清洗，6000Xg离心lOmin，弃上清，待乙醇挥发干净后，加入50 μ L双蒸水进行溶解。在-20°c下保存。
根据菌株16S rDNA保守序列设计下列引物，并由上海生工生物工程公司合成
上游引物5，-AGTTTGTACATGGCTCAG-3，(SEQID NO 2)
下游引物5，-GTTACCTTGTTACGACTT-3，，(SEQID NO 3)
利用上述引物对该菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR体系为
PCR扩增反应体系20 μ L
ddw10.75 μLIOxPCR Buffer2.0 μLdNTP mixture2.0 μLMg2+2.0 μLTaq聚合酶0.25 μL引物1 (27F)1.0 μL引物 2 ( 1492R)1.0 μLDNA模板1.0汕(根椐浓度定量)
PCR反应条件为95°C预变性5min，循环参数95°C变性lmin，52°C复性45s，72°C 延伸1.5min，重复观个循环后，72°C再延伸lOmin，最后4°C保温。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图2所示，在1500bp附近有清晰条带。选用条带清晰的产物进行纯化。
扩增产物经凝胶电泳回收，并连接到PMD19-T载体后进行测序获得了该菌株16s rDNA 一级结构的1488bp特征序列(其碱基序列如SEQ IDNO 1所示)。通过在Genebank 数据库中进行相似性搜索(blast)，结果发现其与链霉菌(Sti^ptomyces sp. 102P41-la) 的序列同源性为99% (Genebank登记号为Icl | 20339)。
根据上述特征命名该菌株为链霉菌(Sti^ptomyces sp. )ZJU088，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号3号院中科院微生物研究所的中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 4889，保藏时间2011年5月19日。
实施例3菌株抑菌活性的测定
采用管碟法测试链霉菌ZJU088对供试菌株的抑菌活性，并设置霉菌素阳性对照和生理盐水空白对照。
取1环经活化的上述菌种，接入到种子瓶中，250ml锥形瓶中装25ml种子培养基， 初始PH值7.0J8°C下200r/min培养Mh，制得种子液；将种子液按10% (ν/ν)接种到 250ml锥形瓶(装40ml发酵培养基)中，于pH值7. O，观°C下200r/min下培养4d后，发酵液于5000rpm下离心15min，留上清液，以管碟法测定发酵液对白色念珠菌的抑菌作用，结果显示其对白色念珠菌具有较强的抑制作用，抑菌圈直径约为8mm。
权利要求
1.一种链霉菌菌株，其特征在于，命名为链霉菌(Streptomyces sp.) ZJU088，保藏号为 CGMCC No. 4889。
2.如权利要求1所述的链霉菌ZJU088在抑制白色念珠菌生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种链霉菌菌株及其应用，属于生物工程技术领域，该菌株命名为链霉菌(Streptomyces sp.)ZJU088，现保藏在普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2011年5月19日，保藏号为CGMCC No.4889。本发明的链霉菌菌株具有很好的抑制真菌的作用，尤其对白色念球菌具有强烈的抑菌作用，对于真菌病的治疗具有重要意义。
文档编号C12N1/20GK102533614SQ20121003879
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者刘超超, 吴绵斌 申请人:浙江大学