专利名称：一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种菌株的筛选方法，尤其是涉及一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法。
背景技术：
达托霉素(Daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵产生的新型环状酸性脂肽类抗生素，该菌种最早由Falcao de Morias和Dailia Maia在1961 年代从土耳其Ararat山土样中分离筛选得到。达托霉素早在20世纪80年代就由礼莱公司研究人员发现并随后制成静脉针剂用于治疗革兰氏阳性菌感染。在20世纪80年代和90年代早期，进行了 I期和II期试验，其中参与人员超过370名。试验发现，达托霉素对皮肤和软组织感染和菌血症的效果令人鼓舞。剂量的提高对感染性心内膜炎也有效。1997年，Cubist公司从礼莱公司取得达托霉素的专利权，并分别在菌血病和复杂的皮肤和软组织感染中进行了 I期和II期临床试验。为了满足病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。通过静脉注射，达托霉素产生的药代动力学为线性，半衰期为8h。在各种动物模型中，达托霉素对药物敏感与耐药性革兰氏阳性菌均有效力。正在进行的第三阶段研究在每天给药一次的基础上研究达托霉素对革兰氏阳性菌引起的严重感染的药效，包括皮肤和软组织感染，群落获得性肺炎和VRE感染。其副作用小，安全性高。玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)具有以下特征孢子链呈直型，没有卷曲，每个链上多于10个孢子，孢子表面光滑可产生红色及浅棕色水溶性色素；在琼脂-葡萄糖平板培养基上生成质地致密、丝绒状或有皱折、干燥，不透明的白色的干粉；菌落正反面的颜色因基内菌丝和孢子所产生色素各异而不一致，因基内菌丝与培养基结合较紧，故不易挑起；且不产生水溶性色素。由于其孢子颜色为红色或红褐色，生理生化试验表明其菌物学特征与已知模式菌株不同，因此被分类定义为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)。抗生素作为代谢终产物对其产生菌可能有几个方面的作用1)作为终产物对参与抗生素生物合成的有关酶进行反馈调节；2)对产生菌本身有抑制、杀死作用。因此筛选产生菌对自身代谢产物的耐受性的提高，将有利于抗生素产量的提高。如杜润泮将原始的卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)用I 10万伦琴的、射线照射其孢子悬液后，菌株由原来耐受100 500 u g/mL浓度的自身代谢产物达到耐2000 20000 u g/ mL高浓度的菌株，发酵单位比原始菌株分别提高33. 3%。王锦经过紫外诱变处理小诺霉素产生菌，利用菌株抗自身代谢物特征选育获得小诺霉素生产突变株发酵单位比出发菌株提闻 了 34. 39 %。
近年来，虽然存在玫瑰孢链霉菌选育工作的相关报导，卢文玉(卢文玉.天津大学学报，2006，39 20-14)报道了癸酸抗性突变株流加发酵法生产达托霉素的相关研究，周剑 (周剑.辐射研究与辐射工艺学报，2008，26 (5) :317-320)报道了利用氮离子注入玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的研究。但是利用联合抗性法来进行筛选一直被人们忽略。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法。本发明的技术方案是以玫瑰孢链霉菌为出发菌株，以葡萄糖、麦芽提取物、酵母提取物、CaCO3、琼脂粉作为培养基的主要原料用于培养菌株孢子，应用于菌株筛选工作。本发明采用的菌种为玫瑰孢链霉菌D1000-S3-2 (Streptomyces roseosporus D1000-S3-2)，已于2011年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏中心保藏编号CCTCC NO :M2011236，该菌种也可购买于美国菌种保藏中心 (ATCC),菌株编号Streptomyces roseosporus ATCC 11379。本发明包括以下步骤I)将无菌水和玻璃珠装入离心管，灭菌备用；2)将DAl合成培养基平板上长好的孢子刮入离心管；3)将离心管置于振荡器上震荡，将孢子打散并均匀分散，得孢子悬液；4)配制DAl合成培养基,分装至三角瓶,灭菌备用；5)分别配制达托霉素标准液和链霉素标准液，经无菌微孔滤膜过滤后备用；6)分别取达托霉素标准液添加入DAl合成培养基，迅速倒板，制成100、200、300、 400、500、600、700mg/L的达托霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；7)分别取链霉素标准液添加入DAl合成培养基，迅速倒板，制成0. 2,0. 4,0. 6、 0. 8、I. O、I. 2、I. 4mg/L的链霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；8)将步骤3)制得的孢子悬液稀释后涂布在达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板上培养；9)观察达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板的菌落生长情况，以与对照相比菌落有明显减少的浓度为该抗生素对菌株的最小抑制浓度(MIC)；10)制备2 5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板；11)制备2 5倍链霉素MIC浓度的抗性平板；12)制备2 5倍链霉素MIC浓度和2 5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板；13)将孢子悬液稀释后涂布在步骤10) 12)所得的2 5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板、2 5倍链霉素MIC浓度的抗性平板、2 5倍链霉素MIC浓度和2 5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板上，设置不添加抗生素的平板作为对照；14)将涂布好孢子的平板培养，长出的菌落即为达托霉素与链霉素抗性突变株；15)挑取形态和颜色变化较大的突变子到同等浓度的抗性平板纯化后转接到DAl 培养基上培养，进行生物活性测定实验，挑选高产菌株进行保藏。在步骤2)中，所述刮入离心管可采用接种环刮入离心管。在步骤3)中，所述震荡的时间可为3 5min。在步骤4)中，所述DAl合成培养基的组成可为葡萄糖4. 0g/L,麦芽提取物10g/L，酵母提取物4g/L，CaC032g/L，琼脂15g/L。在步骤8)中，所述稀释的倍数可为10 100倍；所述孢子悬液可加入20%甘油； 所述培养的条件可为培养7 9天，培养温度28 30°C。在步骤14)中，所述平板培养的条件可于28 30°C培养箱中培养7 9天。本发明筛选所得的抗性菌株摇瓶发酵生物量达到30g/L，达托霉素产量达到 59mg/L,相对原始菌株产量提高63. 8%。相对于其他筛选方法,本发明的菌株筛选方法简便、高效，可用于菌株的大量筛选，对于玫瑰孢链霉菌的达托霉素生产能力有显著的提高。 而达托霉素的作为一种新的脂肽类抗生素，具有很好的医用市场前景，因此该发明的菌株筛选方法具有显著的经济和社会意义。
图I为达托霉素标准品的HPLC图。在图I中，横坐标为时间/min ;峰7. 171相应的峰面积为966. 878。图2为发酵液样品的HPLC图。在图2中，横坐标为时间/min ;左峰7. 202相应的峰面积为1726. 35，右峰为14. 631。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例I :达托霉素最低抑菌浓度的确定采用固体培养基DAl包括葡萄糖4. Og/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物4g/L， CaC032g/L,琼脂15g/L ;分别取达托霉素标准液滤液适量添加入DAl合成培养基，迅速倒板，制成100、200、300、400、500、600、700mg/L的达托霉素浓度梯度平板。同时设置不添加抗生素的平板作为对照。将孢子悬液稀释10 100倍后均匀的涂布在达托霉素浓度梯度平板上。培养7 9天，培养温度28 30°C，观察各平板的菌落生长情况。不同浓度的达托霉素对玫瑰孢链霉菌生长的影响参见表I。表I不同浓度的达托霉素对玫瑰孢链霉菌生长的影响
达托霉素浓度(mg/L) (〕 100 200 300 400 500 600 700生长情况 +_f+ +++ +++ +++---注+++表示长得好；++表示长得一般；+表示长得差表示单菌落数量稀少由表I可知，随着达托霉素浓度的增加，玫瑰孢链霉菌在筛选平板上的单菌落逐渐减少，当达托霉素浓度达到400mg/L时，平板上菌落形态很差，而浓度达到500mg/L时单菌落的数量已经很稀少，故可以确定玫瑰孢链霉菌对达托霉素的最低抑制浓度(MIC)为 400mg/L。实施例2 :链霉素最低抑菌浓度的确定采用如实施例I所述培养条件，考察不同浓度链霉素对菌体生长的影响。其区别在于所使用的抗生素为链霉素。取链霉素标准液滤液适量添加入DAl合成培养基，迅速倒板，制成0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4mg/L的链霉素浓度梯度平板。同时设置不添加抗生素的平板作为对照。将孢子悬液稀释10 100倍后均匀的涂布在链霉素浓度梯度平板上。培养7 9天，培养温度28 30°C，观察各平板的菌落生长情况。不同浓度的链霉素对玫瑰孢链霉菌生长的影响参见表2。表2不同浓度的链霉素对玫瑰孢链霉菌生长的影响
权利要求
1.一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于所述玫瑰孢链霉菌 D1000-S3-2 (Streptomyces roseosporus D1000-S3-2),已于 2011 年 7 月 5 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号CCTCC NO M2011236 ；所述筛选方法包括以下步骤1)将无菌水和玻璃珠装入离心管，灭菌备用；2)将DAl合成培养基平板上长好的孢子刮入离心管；3)将离心管置于振荡器上震荡，将孢子打散并均匀分散，得孢子悬液；4)配制DAl合成培养基，分装至三角瓶，灭菌备用；5)分别配制达托霉素标准液和链霉素标准液，经无菌微孔滤膜过滤后备用；6)分别取达托霉素标准液添加入DAl合成培养基，迅速倒板，制成100、200、300、400、 500、600、700mg/L的达托霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；7)分别取链霉素标准液添加入DAl合成培养基，迅速倒板，制成O.2,0. 4,0. 6,0. 8、 I. O、I. 2、I. 4mg/L的链霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；8)将步骤3)制得的孢子悬液稀释后涂布在达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板上培养；9)观察达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板的菌落生长情况，以与对照相比菌落有明显减少的浓度为该抗生素对菌株的最小抑制浓度；10)制备2 5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板；11)制备2 5倍链霉素MIC浓度的抗性平板；12)制备2 5倍链霉素MIC浓度和2 5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板；13)将孢子悬液稀释后涂布在步骤10) 12)所得的2 5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板、2 5倍链霉素MIC浓度的抗性平板、2 5倍链霉素MIC浓度和2 5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板上，设置不添加抗生素的平板作为对照；14)将涂布好孢子的平板培养，长出的菌落即为达托霉素与链霉素抗性突变株；15)挑取形态和颜色变化较大的突变子到同等浓度的抗性平板纯化后转接到DAl培养基上培养，进行生物活性测定实验，挑选高产菌株进行保藏。
2.如权利要求I所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤2)中，所述刮入离心管采用接种环刮入离心管。
3.如权利要求I所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤3)中，所述震荡的时间为3 5min。
4.如权利要求I所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤4)中，所述DAl合成培养基的组成为葡萄糖4. Og/L,麦芽提取物10g/L，酵母提取物 4g/L，CaC032g/L，琼脂 15g/L。
5.如权利要求I所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，所述稀释的倍数为10 100倍。
6.如权利要求I所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，所述孢子悬液加入20%甘油。
7.如权利要求I所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，所述培养的条件为培养7 9天，培养温度28 30°C。
8.如权利要求I所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，在步骤14)中，所述平板培养的条件于28 30°C培养箱中培养7 9天。
全文摘要
一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，涉及一种菌株的筛选方法。以玫瑰孢链霉菌为出发菌株，以葡萄糖、麦芽提取物、酵母提取物、CaCO3、琼脂粉作为培养基的主要原料用于培养菌株孢子，应用于菌株筛选工作。筛选所得的抗性菌株摇瓶发酵生物量达到30g/L，达托霉素产量达到59mg/L，相对原始菌株产量提高63.8％。相对于其他筛选方法，菌株筛选方法简便、高效，可用于菌株的大量筛选，对于玫瑰孢链霉菌的达托霉素生产能力有显著的提高。而达托霉素的作为一种新的脂肽类抗生素，具有很好的医用市场前景，菌株筛选方法具有显著的经济和社会意义。
文档编号C12N1/20GK102586147SQ20121003842
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者卢英华, 吴意珣, 张智翔, 敬科举 申请人:厦门大学