专利名称：提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性以及利用其培育抗病植物的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和植物基因工程技术领域。主要涉及利用分子生物学技术改造基因，获得性能更好的新基因，以及利用植物基因工程技术将获得的新基因用于制备抗病转基因植物，进一步提高植物的抗病性。
背景技术：
自从人类开始栽培作物以来，由病原菌引起的作物病害一直是限制农业生产的主要因素之一。病害每年可造成全世界作物减产15%以上，直接经济损失达300 500亿美元 (李润植等，2001 ；Osusky等，2000)。此外，病害还引起作物产品品质下降，病原菌产生的毒素严重危害人体健康。在作物病害综合防治策略中，培育和推广应用抗病品种是最经济有效的措施。由于病原菌变异迅速，植物抗性资源有限以及常规育种方法耗时费力，所培育的抗病品种远不能满足生产需要。利用现代生物技术分离、克隆和转化抗性基因，不仅定向性强、基因型来源丰富，而且不受抗源亲缘关系限制、育种周期短、理论上也不存在性状的负相关连锁，可对单一性状进行根本改良。此外，将某些抗病基因转入植物中，不仅可以提高植物对病原真菌致病因子的解毒能力，而且可以提高植物获得性系统抗性能力。通过这种方法获得的抗病植物，具有抗性不易丧失、抗性基因来源广容易转育等优点(Cornelissen 等，1993)。因此，基因工程技术已成为植物抗病育种的重要途径。几丁质酶是一种水解酶，广泛存在于植物和微生物中，具有降解几丁质的作用。植物病原真菌中绝大多数真菌细胞壁的主要成分是几丁质，而植物中还未发现几丁质酶的作用底物。因此，在植物内表达不同来源的几丁酶基因，其产物不会对植物的生长发育产生不利影响，而这些表达的异源几丁酶却可作用于侵入植物体内病原真菌的细胞壁。此外，真菌细胞壁的降解产物还可进一步诱导植物的防御反应(Grison ei a人，1996; Velazhahan et al.，2000 ；Lorito et al.，1998)。因此，几丁质酶基因在植物抗病基因工程中的应用于一直受到人们关注。几丁质酶在结构上一般具有催化域和几丁质结合域以及连接它们的铰链区。研究表明，几丁质结合域对几丁质酶的作用不一定是必须的，但可以显著提高几丁质酶结合几丁质和降解几丁质的能力。球孢白僵菌是一种生防真菌，广泛应用于生物治虫。研究表明， 球孢白僵菌几丁酶基因具有一定的抗病性，但是直接利用该基因提高植物的抗病性很不理想，很难获得抗性显著提高的转基因植物。因此，该基因在植物抗病基因工程中的应用受到很大的限制。序列分析表明，球孢白僵菌几丁酶基因不具有几丁质结合域，这是球孢白僵菌几丁酶基因抗病性不理想的主要原因
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是解决球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的问题，提供一种提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性的方法。本发明的另一目的是利用球孢白僵菌几丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法。为解决上述问题，本发明采用的技术手段是，一种提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，该方法是将球孢白僵菌几丁酶基因Bbchitl与来自家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域序列SwChBD融合，获得抗病性更优的新基因SwBbchitl0具体步骤包括
(1)获得球孢白僵菌几丁酶基因助以球孢白僵菌基因组DNA为模板，序列1和序列2为引物进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD18载体，然后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆获得助Mi 7基因序列；
(2)获得家蚕几丁质酶基因的几丁质结合结构域SwChBD序列提取家蚕4至5龄蜕皮期的mRNA，然后利用mRNA进行反转录合成cDNA，以cDNA为模板，序列3和序列4为引物进行PCR扩增，扩增产物克隆入pBS载体，转化大肠杆菌XL-blue感受态细胞，筛选阳性克隆获得SwChBD序列；
(3)构建家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域与球孢白僵菌几丁酶基因的融合基因 SwBbchitl 用KpnI与)(ba I双酶切pMD18_Bbchitl质粒，回收助基因片段，然后克隆入用Spe I与EcoRI消化的pBS_SwChBD质粒，得到pBS_SwBbchitl载体。转化大肠杆菌后筛选阳性克隆即获得抗病性提高的新基因SwBbchitl序列。本发明提供的利用基因提高植物抗病性的方法，是利用基因工程技术炮會SwBbchitl基因的植物表达载体p5-35S-SwBbchitl，然后将该载体转入根癌农杆菌 LBA4404获得转化子。利用转化子将SwBbchitl基因转入棉花或番茄，经组织培养和抗生素抗性筛选获得再生的转基因植株，再经抗病鉴定后获得抗病效果更好的转基因植物新资源。本发明提供的一种利用抗病性提高的几丁酶基因培育抗病植物的方法，其特征在于，构建该基因的植物表达载体后，利用基因工程技术转入植物，获得抗病性更好的转基因植物。进一步，利用球孢白僵菌几丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)利用基因工程技术将获得的新基因序列SwBbchitl可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体，获得组成型表达基因的植物表达载体，该载体具有图2所示的 p5-35S-SwBbchitl 的特征；
(2)将上述步骤(1)获得的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得转化子；
(3)将上述步骤(2)获得的农杆菌转化子转化棉花或番茄，经组织培养和抗生素抗性筛选获得转基因棉花或番茄。(4)将上述步骤(3)获得的转基因棉花和番茄进行抗病鉴定和比较，获得较球孢子白僵菌几丁酶基因抗性更好的转基因棉花和番茄。进一步，将上述基因的植物表达载体转入棉花或番茄基因组，实现该基因的组成型表达，进一步提高棉花或番茄的抗病能力。一种利用球孢白僵菌几丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，所述基
4因的植物表达载体在制备转基因抗病植物中的应用。本发明的有益效果在于，利用分子生物学和基因工程相关技术，首先构建了来自家蚕几丁酶的几丁质结合结构域SwChBD与球孢白僵菌几丁酶基因的融合基因，获得了抗病性较球孢白僵菌几丁酶基因助Mi 7显著提高的新基因5k助；然后构建该基因的植物表达载体，并将该基因转入棉花和番茄内，再生植株经严格的分子验证后，利用离体叶片接种法进行抗病鉴定。转基因番茄Ttl代植株离体叶片喷施浓度为IO8个孢子/mL的早疫病病原菌菌液 5d，野生型对照植株叶片全部发病，病情指数达到100 ·，Π今SwBbchitl转基因株系中有3 个株系的病情指数低于20，有4个株系的病情指数为30-40 ；而11今Bbchitl转基因株系中没有病情指数低于20的，病情指数20-40的仅有2个株系。转基因棉花Ttl代植株离体叶片于101°个孢子/mL的落叶型黄萎病菌液中浸染过夜，接种7d，野生型对照病情指数达到100 {I今SwBbchitl转基因株系中有2个株系的病情指数低于20，7今Bbchitl转基因株系中有1个株系的病情指数为24. 3，其余株系都高于 40，没有病情指数低于是20的株系。定量PCR检测结果显示，抗性更好的SwBbchitl转基因植株与Bbchitl转基因植株相比，前者助Mi^基因的表达量反而更低。病情指数或病级基本一致的转基因株系相比，SwBbchitl转基因株系中助基因的表达量较助转基因株系内的表达量更低。结果表明-.Bbchitl几丁酶基因添加家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域后可有效提高助4#7基因的抗病性，进一步有效提高了转基因棉花和番茄对不同病害的抗性。本发明利用来自家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域融合球孢白僵菌几丁酶基因，获得了一个抗病性显著提高的新的几丁酶基因。利用转基因技术实现该基因在棉花和番茄内的组成型表达，进一步提高转基因植株对不同病害的抗性。本发明方法简便易行，效果显著，获得的抗病材料可为植物抗病育种提供新的资源，服务于生产，并产生巨大的经济和社会效益。本发明方法不仅适用于培育抗病的棉花和番茄，同样也适用于其它植物抗病材料的培育。
附图表说明
图1为SwBbchitl基因获得的流程图2为p5-35S-SwBbchitl载体构建流程图3为pBI121载体改造为p5载体流程图4为转基因番茄根和叶片GUS组织化学染色结果；
图5为接种早疫病菌5d，SwBbchitl转基因番茄的病情指数；
WT 野生型对照；Sw-I、Sw-3、Sw-5、Sw-7、Sw-10、Sw-IU Sw_12、Sw_13、Sw_14、Sw_15、 Sw-17、Sw-20和Sw-21 :SwBbchitl转基因番茄不同株系。Transgenic lines 转基因株系； Disease index 病情指数。图6为接种早疫病菌HBbchitl转基因番茄的病情指数；
WT 野生型对照；Bb-I、Bb-2、Bb_3、Bb_5、Bb_6、Bb_7、Bb_8、Bb_9、Bb_10、Bb-13 和 Bb-15 :Bbchitl转基因番茄不同株系。Transgenic lines 转基因株系；Disease index 病情指数。图7为接种早疫病菌Bbchitl转基因番茄不同病情指数株系的百分比分布； 图8为接种早疫病菌5d，SwBbchitl转基因番茄不同病情指数株系的百分比分布；
图9为转基因棉花茎和叶片⑶S组织化学染色结果；
图10为离体叶片接种落叶型黄萎病菌7d, SwBbchitl转基因棉花的病情指数； 图11为离体叶片接种落叶型黄萎病菌HBbchitl转基因棉花的病情指数； 图12为接种黄萎病病菌7d, SwBbchitl转基因棉花不同病情指数株系的百分比分布； 图13为接种黄萎病病菌IlBbchitl转基因棉花不同病情指数株系的百分比分布； 图14为接种早疫病菌5d，SwBbchitl转基因番茄叶片的表型； 图15接种落叶型黄萎病菌7d，5M^dii7转基因棉花叶片的表型。表1为转基因番茄株系的病情指数以及助MiU基因的相对表达量。表2为转基因棉花株系的病情指数以及助基因的相对表达量。
具体实施实例
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。实施例1:DNA的提取 1.1 DNA提取缓冲液
(1)真菌DNA提取缓冲液
Tris-HCKpH 7.5) 0.2 mol/L, NaCl 0.5 mol/L, EDTA 0. 01 mol/L, SDS 1% (w/v)。(2)植物DNA提取缓冲液
CTAB 提取液100 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，20 mmol/L EDTA (pH8. 0)，1. 5 mol/ L NaCl，2% CTAB (w/v), 4% PVP40 (w/v)和2%巯基乙醇(ν/ν)，PVP和巯基乙醇使用前加入。(3)碱裂解法质粒提取缓冲液
STE 0. 1 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。溶液I :50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),10 mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)。溶液II :0. 2 mol/L NaOH, 1% (w/v) SDS。溶液III 50 mL 5 mol/L 乙酸钾，11. 5 mL 冰醋酸，28. 5 mL 水。1.2球孢白僵菌基因组DNA的提取方法
1.5 ml离心管收集球孢白僵菌菌液，10000 rpm离心5 min，弃上清液，加入真菌DNA提取液500 ？ 1，于涡旋器充分混勻，65°C水浴30 min后加入等体积的酚(pH8. 0)氯仿，然后 10000 rpm离心10 min，取上清液，加入等体积氯仿抽提1_2次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀30 min。10000 rpm离心5 min,弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀2次，然后风干。沉淀50-100 1双蒸水溶解后加入2-5U的RNA酶A，37°C静置3 h，10000 rpm离心5 min,取其上清液即为球孢白僵菌基因组DNA溶液。1. 3 质粒DNA的提取
(1)根癌农杆菌质粒DNA的提取按卢圣栋方法(1993)略作修改。取根癌农杆菌菌液1 mL，10 000 rpm离心1 min收集菌体；用200 mL STE重悬菌体后，离心(10000 rpm, 1 min)收集菌体；加入200 mL溶液I和50 mL溶菌酶重悬菌体， 37° C温浴30 min，加入400 mL溶液II，上下颠倒多次，冰浴不超过3 min;再加入300 mL 冰预冷的溶液III，上下颠倒多次，冰浴3 min。12 000 r/min、4° C离心10 min，将上清液转入另一离心管中；加入上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇混和液(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)抽提一次，将上清液转入另一离心管中；再加入上清液相同体积的氯仿和异戊醇混和液(氯仿和异戊醇的体积比为1)抽提一次；再将上清液转入另一离心管， 加入上清液2倍体积的无水乙醇，混勻后室温静置2 min ；12 OOOrpm,4° C离心10 min收集沉淀DNA，然后用75%的乙醇洗涤沉淀一次；室温干燥，50 mL TE溶解沉淀即得到根癌农杆菌质粒DNA。(2 )大肠杆菌质粒DNA的提取
大肠杆菌质粒的提取采用质粒提取试剂盒进行。试剂盒购自Promega公司，按试剂盒说明书进行操作。实施例2: RNA的提取 2.1 RNA提取缓冲液
CTAB 提取缓冲液2%CTAB (w/v)，2% 聚乙烯吡咯烷酮 PVP40 (w/v)，1 OOmmo 1/ L Tris-HCl (pH8. 0，DEPC 处理的水配制)，25mmol/L EDTA，0. 5g/L 亚精胺 Spermidine, 2. Omol/L恥(1，^)巯基乙醇(￥八，使用前加入)。SSTE溶解液lmol/L NaCl，0. 5%SDS(w/v), lOmmol/L Tris_HCl(pH8. 0)，1. Ommo 1/ L EDTA02.2植物RNA提取方法
用CTAB法提取棉花或番茄组织的总RNA。取约3g棉花或番茄组织新鲜材料，在液氮中迅速研成粉末，装入DEPC水处理的50ml离心管，然后加入15ml 65°C预热的RNA提取液，颠倒混勻后65°C水浴3min，8，000 rpm,4° C离心10 min,将上清液转入一新的DEPC水处理的50ml离心管，用等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提两次。10，OOOrpmm，室温离心5min后取上清液，加入1/4体积10 mol/L LiCl溶液，4°C放置6h以上，10，000rpm，4° C离心10 min，弃上清液，沉淀用500 μ L SSTE溶解。然后加入500 μ L酚、氯仿和异戊醇混和液(酚、 氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)抽提一次，将上清液转入另一离心管中；再加入上清液相同体积的氯仿和异戊醇混和液(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)抽提一次，10，OOOrpm, 室温离心5min，上清液加入2倍体积-70° C预冷的无水乙醇，-70° C沉淀30min以上。 12，OOOrpm，4° C离心10 min,弃上清液，沉淀用200 μ L的DEPC处理水溶解，非变性凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA质量后，-80° C保存备用。2. 3家蚕RNA提取方法
CTAB提取缓冲液于65° C水浴锅中预热，离心管中加入ME (巯基乙醇，10 ml体系中加入300yL)。取约2g蚕体(去内脏)，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，加入16mL预热的RNA提取液，颠倒混勻；65°C水浴3min，8，000 rpm、4° C离心10 min,将上清液转入一新的DEPC水处理的50mL离心管，用上清液相同体积的氯仿和异戊醇混和液(氯仿和异戊醇的体积比为Μ: 1)抽提两次。10，OOOrpmm，室温离心5min后取上清液，加入1/4 体积10 mol/L LiCl溶液，4°C放置6h以上，10，000rpm，4° C离心10 min，弃上清液，沉淀用500 μ L SSTE溶解。然后加入500 μ L酚、氯仿和异戊醇混和液(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)抽提一次，将上清液转入另一离心管中；再加入上清液相同体积的氯仿和异戊醇混和液(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)抽提一次，10，OOOrpm,室温离心5min，上清液加入2倍体积-70° C预冷的无水乙醇，-70° C沉淀30min以上。12，000rpm，4° C离心 10 min,弃上清液，沉淀用200 μ L的DEPC处理水溶解，非变性凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA质量后，-80 ° C保存备用。实施例3家蚕几丁质酶基因几丁质结合结构域(SwChBD)的获得
提取家蚕(Bombyx mori)4至5龄蜕皮期的RNA，按反转录试剂盒使用说明书反转录合成cDNA (TaKaRa公司产品)。根据家蚕几丁酶基因的cDNA序列(Genebank登录号 AF273695)，设计引物序列3和序列4，扩增家蚕几丁质酶基因的几丁质结合结构域，在其 N-端引入Spe I酶切位点，C端引入EcoRl酶切位点。扩增反应的组分10XDNA聚合酶Buffer (鼎国公司产品》.5 μ L, 10mmol/L dNTP 0.5“1^，5 4 11101/1上下游引物各14 1^，0嫩聚合酶0.7仏00嫩14 1^，加水至25 4 1^。循环条件:95°C,5min ；94°C，lmin ；55°C, Imin ；72°C，lmin，32 个循环；72°C，20min，琼脂糖凝胶电泳检测。回收扩增片段克隆入PBS载体，转化大肠杆菌XL-blue感受态细胞，筛选阳性克隆获得SwChBD序列(序列11)，并测序验证。实施例4球孢白僵菌几丁酶基因助的获得
以球孢白僵菌基因组DNA为模板，序列1和序列2为引物引入式OTl和损<31酶切位点进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD18载体，然后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆得到助基因序列(序列12)，并测序验证。实旋例5 5k助融合基因的获得
用幻7/ 1禾PifeiI双酶切pMD18-Bbchitl质粒，回收助基因片段，同时用和 EcoRl双酶切pBS-SwChBD质粒，回收SwChBD片段，然后同时将回收片段连接入经和 Kpnl双酶切的pBS载体，得到pBS-Bbchitl-SwChBD载体，转化大肠杆菌XL-blue感受态细胞，筛选阳性克隆获得Bbchitl-SwChBD融合基因，命名为SwBbchitl，并测序验证。获得的流程图见图1。实施例6 SwBbchitl植物表达载体的构建
6. 1 组成型表达5k助基因植物表达载体的构建
W鴻NPTII筛选标记基因和Gtt？报告基因的植物表达载体p5为基本骨架，用EcoRI 和KpnI双酶切p5载体质粒，回收大片段，同时用EcoRI和KpnI双酶切pBS_SwBbchitl载体质粒，回收小片段，然后利用DNA连接酶连接回收的片段，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆即获得p5-SwBbchitl载体。然后再用KpnI和Mil双酶切p5-SwBbchitl 载体质粒，回收大片段，同时用KpnI和Mil双酶切pUC-CaM35S载体质粒，回收小片段，再利用DNA连接酶连接回收的片段，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆即获得组成型表达SwBbchitl基因的植物表达载体，命名为p5-35S-SwBbchitl。p5-;35S-SwBbchitl
8植物表达载体构建流程图见图2。所有限制性内切酶均购自Roche公司，按照使用说明书操作完成。p5植物表达载体为改造常用的PBI121载体而得，改造的流程图见图3。6.2植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404
参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将构建的组成型表达5k助基因的植物表达载体P5-35S-SwBbchitl通过电击转化法导入根癌农杆菌LBA4404。实施例7 番茄的遗传转化 7.1番茄遗传转化用培养基
基本培养基MSBO (MS无机+B5有机+30g/L蔗糖，pH5. 8)。固体培养基加入6g/L的琼脂(Murashige 和 Skoog，1962 ；Gamborg 等，1968)；
共培养培养基MSBl MSBO+2. Omg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤)+0. ang/L IAA (吲哚乙酸) +IOOuM AS (乙酰丁香酮)+6g/L 琼脂，ρΗ5· 4 ；
筛选培养基MSB2: MSBl+500mg/L cb (羧苄青霉素)+ 100mg/L Km (卡那霉素)+6g/L 琼脂，pH5. 8 ；
继代培养基 MSB3: MSB0+200mg/Lcb+ 100mg/L Km+6g/L 琼脂，pH5. 8 ；
生根培养基 MSB4: MSBO+O. 5mg/L IAA+200mg/L Cef +50mg/L Km+6g/L 琼脂，pH6. O。7. 2番茄的遗传转化 (1)转化用农杆菌浸染液的制备
挑取含P5-35S-SwBbchitl载体的根癌农杆菌单菌落，接种入附加50mg/L Km (卡那霉素)和125mg/L Sm (链霉素)IOmL液体YEB (5g/L蔗糖，lg/L细菌用酵母抽提物，10g/L细菌用胰化蛋白胨，0. 5g/L MgSO4 · 7H20，pH7. 0)，、200rpm培养过夜，然后按5%的比例将菌液接种入20mL不含抗生素的液体YEB，28°C>200rpm培养至0D600约为0. 8。取5mL菌液 6000rpm离心5min，倾去上清液，用IOmL MSBO液体培养基重悬菌体，重悬菌液即为浸染外植体的农杆菌浸染液。(2)番茄遗传转化
参考Cortina等(Plant Cell,Tissue and Organ Culture, 2004, 76 (3) : 269 - 275) 的方法，以生长约IOd无菌苗的子叶为外植体，利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。具体操作为番茄种子1%次氯酸钠溶液灭菌10-15min，无菌自来水冲洗5_6次， 25°C、l^i光照/8h黑暗的光周期于固体MSBO萌发约10d，生长健壮的无菌幼苗子叶作为农杆菌介导遗传转化的外植体。农杆菌浸染液浸染外植体IOmin后倾去菌液，无菌吸水纸吸去外植体表面多余菌液，然后接种入铺有一层无菌滤纸的共培养培养基MSB1，25°C暗共培养2d。共培养完成后，将外植体接种入筛选培养基MSB2中进行分化培养，25°C、1 光照 /8h黑暗的光周期培养2周，然后将外植体继代入MSB3培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次。产生Km抗性幼芽后，将幼芽切下接种入MSB4生根培养基，获得Km抗性再生植株。根长3-5cm的再生幼苗，移栽入温室生长成苗。实施例8 转基因番茄的分子生物学鉴定 8. 1⑶S组织化学染色
参照Jefferson等(1987)的方法，取再生植株幼嫩的根或叶片少许置GUS染色液 (500mg/L X-Gluc,0. lmol/L K3Fe (CN) 6,0. lmol/L K4Fe(CN)6,1% Triton X-100 (v/v),0. lmol/L 磷酸缓冲液(pH7. 0))中，37° C 保温 2 h。染色后，75% 乙醇脱色，每2 h更换一次脱色液，直至未着色部分的颜色完全褪去。根或叶片都没有蓝色出现的再生材料为非转基因植株，染出蓝色的为转基因植株(图4)。8. 2 Real-time PCR 检测
以转基因番茄幼嫩叶片为材料提取RNA，然后利用cDNA —链合成试剂盒合成一链 cDNA，再以cDNA为模板扩增助基因片段，以检测助的转录表达水平。Real-time PCR分析参照《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1995 ；Sambrook an Russel，2001)和试剂盒说明书(Bio-Rad公司产品)进行。反应体系20 mL。包括IOmL Mixture buffer (包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、 dNIPs和MgCl2, Quantitative real-time PCR试剂盒提供，Bio-Rad公司产品)，上下游引物序列5和序列6各5mmol/L和1 mL cDNA 一链产物。用番茄Tubulin基因LeTUB作内标， 扩增内标基因的引物为序列7和序列8。Real-time PCR 扩增程序为95°C，3min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，60s。40 个循环。Real-time PCR扩增结果(表1)显示，所有GUS染色阳性植株内都能检测到 Bbchitl基因的转录表达。说明助私SwBbchitl基因已经整合入番茄基因组。实施例9 SwBbchitlMBbchitl转基因番茄对早疫病的抗性 9. 1抗病鉴定方法
采用离体叶片接种法进行转基因番茄的抗病鉴定。株系植株扩大繁殖后，每个植株取 5片生长基本一致且完全生长的叶片，每个株系共取20片叶用于离体接种。叶片向光面朝上平放，均勻喷施IO8个孢子/mL的早疫病菌孢子悬浮液，以菌液均勻湿润叶片表面为宜， 叶柄包裹添加无菌水的脱脂棉用于保湿。接种后置22-26°C，每天16hr光照的培养箱内培养。接种5d，按0-4级的5级标准统计叶片的发病病级并计算病情指数。抗病鉴定以野生型植株为对照。0-4级的5级病级标准为
O级无病症；
1级病斑面积占叶片面积的25%以下； 2级病斑面积占叶片面积的25-50% ； 3级病斑面积占叶片面积的50-75% ； 4级病斑面积占叶片面积的75%以上； 病情指数计算公式
病情指数=Σ(病缀栽*袜数)/(4*总袜數)*100
9. 2 SwBbchitl MBbchitl转基因番茄对早疫病的抗病性比较按9. 1的抗病签定接种方法接种病原菌5d，野生型对照植株叶片全部发病，病情指数达到100。SwBbchitl转基因13个株系中，Sw-14, Sw-15和Sw-17等3个株系的病情指数都低于20，Sw-U Sw-3、Sw-13和Sw_21等4个株系的病情指数在30-40 (图5)，其余株系的病情指数都为50左右。Bbchitl转基因株系共11个，没有病情指数低于20的转基因株系，仅有一个株系的病情指数在20-30，1个株系的病情指数在30-40，其余多数株系的病情指数都超过了 50 (图6)。
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将不同病情指数的转基因番茄株系所占百分比制作分布图，结果显示，助转基因株系中64%的病情指数超过了 50，没有病情指数低于20的株系，病情指数20-50的株系占36% (图7)。相比较，SwBbchitl转基因番茄中，病情指数低于20的株系占23%，病情指数20-50的株系占，超过50的仅占23% (图8)。上述不同病情指数株系所占百分比表明，SwBbchitl基因的抗病性远远优于 Bbchitl纖。因此，助几丁酶基因添加家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域后可有效提高其抗病性。同时实现基因在番茄内的组成型表达可更有效提高番茄的抗病性，培育抗病转基因新材料。9.3 SwBbchitl和助转基因番茄的抗病性与助基因表达量的关系以转基因番茄幼嫩叶片为材料提取RNA，然后利用cDNA —链合成试剂盒合成一链
cDNA，再以cDNA为模板扩增助Mi 7片段，以检测助Mi 7的转录表达水平，部分株系的检测结果见表1。\XMBbchitl基因的相对表达水平和离体叶片接种病原菌5d后的病情指数，结果表明
a ) Bbchitl表达量接近的株系相比较(如Bb-2、Bb-6、Sw-U Sw-3和Sw_13等五个株 Bbchitl基因的相对表达量都在1-1. 1 SwBbchitl基因转基因番茄的病情指数远远低于助基因的转基因番茄，即基因表达量基本一致时，5k助转基因植株表现出更好的抗病性；
(2)病情指数基本一致的株系相比较(如m3-13、SW-5、SW-10和Sw-11，其病情指数都在 50左右)，SwBbchitl转基因株系内助基因的相对表达量远远低于助转基因株系，即要达到相同的抗病效果，SwBbchitl转基因植株需要的基因表达量更低；
(3)抗病性较好的株系相比较，如转基因株系病情指数低于20的株系 (Sw-14、Sw-15)与Bbchitl病情指数30左右的株系(Bb_3、Bb_7)相比，SwBbchitl转基因株系内助Mi 7基因的表达量约为m^chitl转基因株系的三分之一，即转基因番茄要达到一个较好的抗病水平，相对而言SwBbchitl需要基因的表达量更低。综合上述结果表明，在助基因内融合家蚕几丁酶的几丁质结合结构域能有效提高助基因的抗病性。利用5k助新基因能更有效地提高转基因番茄对早疫病的抗病效果，培育抗病植物资源。实施例10 棉花遗传转化
以无菌下胚轴为受体，利用根癌农杆菌介导法进行棉花的遗传转化，将 p5-35S-SwBbchitl植物表达载体整合入棉花基因组。10. 1根癌农杆菌介导的棉花遗传转化常用培养基
基本培养基MSB (MS 无机盐+B5 有机)(Τ· Murashige, 1962 ；0. L. Gamborg, 1968)； 种子萌发培养基1/2 MSB+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，自来水配制，自然pH; 共培养培养基MSB+0. 5mg/L IAA (吲哚乙酸)+0. lmg/L KT (6-糠氨基嘌呤)+30g/L 葡萄糖+100ymol/L 乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite (Sigma)，ρΗ5· 4 ；
筛选脱菌培养基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/L cef (头孢霉素)+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ；
愈伤诱导培养基MSB+0. 5mg/L IAA+0. lmg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite, pH5. 8 ；胚性愈伤诱导培养基MSB+0. lmg/L KT+30g/L 葡萄糖 +2. Og/L Gelrite，ρΗ5· 8 ； 液体悬浮培养基:MSB+1. 91g/L硝酸钾+0. lmg/L KT+30g/L葡萄糖，ρΗ5· 8 ； 体胚成熟培养基MSB +15g/L 蔗糖+15g/L 葡萄糖 +0. lmg/L KT+2. 5g/L Gelrite, pH6. 0 ；
成苗培养基:SH +0. 4g/L活性碳+20g/L 蔗糖，pH6. 0。(Schenk & Hildebrandt, 1972) 10.2棉花遗传转化具体操作方法 (1)转化用农杆菌的培养
挑取含p5-35S-SwBbchitl表达载体的农杆菌LBA4404单菌落，接种入5ml附加50mg/ L卡那霉素(Km)和125mg/L链霉素(Sm)的YEB液体培养基，28°C，180rpm振荡培养至0D_ 约为1. 0，取100 μ L菌液接种入IOOmL不附加抗生素的YEB液体培养基，28°C、180rpm振荡培养过夜，至培养液0D_约为1. 0，菌液室温SOOOrpm离心5min，无菌条件下弃上清液，以原菌液体积并附加ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮(AS)的无菌MSB液体培养基(共培养培养基不附加Gelrite固化剂)重悬菌体，备用。(2)转化外植体的获得
棉花种子去壳，籽仁0. 1%升汞灭菌lOmin，无菌水漂洗5_6次后，接种于种子萌发培养基，暗培养5-7d。无菌下胚轴切成3-5mm长的切段，作为转化外植体。(3)下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导
农杆菌浸染液浸染3-5mm下胚轴切段20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26°C暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)和头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。(4)体胚的诱导和成苗培养
液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均勻分散地接种入体胚成熟培养基，约15d大量的体胚产生后，将体胚继代入SH培养基，促进体胚成苗。3-4 片真叶的再生体胚苗移栽入温室，然后于温室内生长繁殖。实施例11:助MiU转基因棉花的分子生物学鉴定 11.1转基因植株的⑶S组织化学检测
参照Jefferson (1987)的方法，切取少许再生转基因植株幼嫩的茎和叶片组织放入扩增管内，加入少许⑶S组织化学染色液，37°C暗处理lh，再用75%乙醇脱色，脱色后的茎和叶片组织体视镜下观察着色情况。以野生型植株为对照。组织染成蓝色为阳性转基因植株， 否则为阴性非转基因植株(图9)。11. 2转基因棉花植株内助基因转录表达的Real-time PCR检测以转基因棉花幼嫩叶片为材料提取RNA，然后利用cDNA —链合成试剂盒合成一链
cDNA，再以cDNA为模板扩增助基因片段，以检测助的转录表达水平。Real-time PCR分析参照《分子克隆实验指南》(Sambrook等，1995 ；Sambrook an Russel，2001)和试剂盒说明书(Bio-Rad公司产品)进行。反应体系20mL，包括 IOmL MIXTURE buffer(包括 PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNIPs 和MgCl2, Quantitative real-time PCR试剂盒提供，Bio-fcid公司产品)，上下游引物各5mmol/L (序列5和序列6)和1 mL cDNA—链产物。用棉花基因作内标，扩增内标基因的引物为序列9和序列10。Real-time PCR扩增程序为95°C，3min ；94°C，30s，55°C，30s， 72°C,60sο 40 个循环。Real-time PCR扩增结果(表2)显示，所有⑶S染色阳性植株内都能检测到 Bbchitl基因的转录表达。说明SwBbchitl MBbchitl基因已经成功整合入棉花基因组。实施例12 SwBbchitl ^Bbchitl转基因棉花的抗病性 12. 1转基因棉花抗病鉴定
利用离体叶片接种法对转基因棉花进行抗病鉴定。转基因棉花Ttl代植株离体叶片于 101°个孢子/mL的落叶型黄萎病菌液中浸染过夜，然后置22-26°C，每天16hr光照的培养箱内进行水培养。接种7d,按0-4级的5级病级标准统计转基因棉花叶片的病级，并计算病情指数。0-4级的5级病级标准为 0级叶片无病症；
1级病斑面积占叶片面积的25%以下； 2级病斑面积占叶片面积的25-50% ； 3级病斑面积占叶片面积的50-75% ； 4级病斑面积占叶片面积的75%以上； 病情指数计算公式
病情指数=Σ(病级数*抹数)/ *总抹数)*100
12. 2 SwBbchitl MBbchitl转基因棉花对黄萎病的抗病性比较按12. 1抗病鉴定方法对5k助MBbchitl转基因棉花同时进行了抗病鉴定。接种落叶型黄萎病菌7d，转基因棉花株系的病情指数见图10和图11。结果显示，接种7d，野生型棉花的病情指数为100。获得的 个SwBbchitl转基因株系中有2个株系(SwBb-2和 SwBb-8)的病情指数低于20，2个株系的病情指数在20-50之间(SwBb_4和SwBb_15)。而 7々Bbchitl转基因株系中没有病情指数低于20的株系，病情指数20-50之间的株系2个 (Bb-12和Bb-23)，其余株系都高于50。将不同病情指数的转基因棉花株系所占百分比制作分布图，结果显示，SwBbchitl 转基因棉花中，病情指数低于20的株系占四％，20-50的占四％，超过50的占42% (图12)。 相比较，助did转基因株系中71%的病情指数超过了 50，没有病情指数低于20的株系，病情指数20-50的株系占四％ (图13)。上述不同病情指数株系所占百分比表明，SwBbchitl基因的抗病性远远优于 Bbchitl纖。因此，助几丁酶基因添加家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域后可有效提高其抗病性。同时实现5k助Mi 7基因在棉花内的组成型表达可更有效提高棉花对黄萎病的抗性，培育抗黄萎病的转基因棉花新材料。12.3 SwBbchitl和助转基因棉花的抗病性与助基因表达量的关系以转基因棉花幼嫩叶片为材料提取RNA，然后利用cDNA —链合成试剂盒合成一链
cDNA，再以cDNA为模板扩增助did基因片段，以检测助did的转录表达水平，检测结果见表2。比较助基因的相对表达水平和离体叶片接种黄萎病菌7d后的病情指数，结果表明..SwBbchitl转基因棉花要达到一个较好的抗病水平需要的助基因的表达水平远远低于助转基因棉花，如，SwBb-2和SwBb-8，这两个转基因株系内助基因的相对表达水平分别为101. 07和118. 47，病情指数都为12. 5 -,MBbchitl转基因棉花恥_12 ■钱Bbchitl基因的相对表达水平达到了 348. 66，而该株系有病情指数却为29. 35。又如，SwBb-15株系的病情指数为41. ？Bbchitl基因的相对表达水平为66. 81，而恥_15 和恥-20两个株系的表达水平超过了 80，而其病情指数却高于70。结果表明，在助基因内融合家蚕几丁酶的几丁质结合结构域能有效提高 Bbchitl基因的抗病性。利用SwBbchitl新基因能更有效地提高转基因棉花对黄萎病的抗病效果，培育抗病棉花资源。实施例13 SwBbchitl转基因番茄和转基因棉花的抗病表现
利用根癌农杆菌介导法将p5-35S-SWm3chitl植物表达载体按实施例11和实施例12 的方法分别转入番茄和棉花，实现基因在棉花和番茄内的超量表达。转基因番茄和转基因棉花分别按实施例11和实施例12的方法进行抗病鉴定。转基因番茄接种早疫病菌5d，SwBbchitl转基因株系的病情指数见图5，在获得的转基因番茄株系中Sw-14、Sw-15和Sw-17三个株系的病情指数分别为12. 5、18. 75和 18. 75，极显著低野生型对照的100，有效地提高了转基因番茄对早疫病的抗性。接种5d，野生型对照植株叶片全部发病，而SwBbchitl转基因抗病植株叶片没有病症，或病症很轻(图 14)。转基因棉花接种强致病力落型型黄萎病菌高浓度孢子悬浮液7d，SwBbchitl转基因株系的病情指数见图10，其中SwBb-2和SwBb-8两个株系的病情指数均只有12. 5，与野生型对照100的病情指数相比，病情指数降低了 87. 5%，极显著低于野生型对照，达到了抗病水平。接种7d，野生型对照植株叶片全部发病，病级都达到最高级别4级，叶片布满了病斑，而抗病植株叶片没有病症，或有很少的病斑(图15)。结果表明，实现基因在转基因番茄和棉花内的组成型表达，能有效提高番茄和棉花的抗病性，培育抗病番茄和棉花新资源。上述实施实例表明，本发明提供的提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性的方法获得的新基因的抗病性显著优于助did基因。实现该基因在转基因植物内组成型表达，能更有效提高转基因植株对真菌病害的抗性。本发明方法简便易行，效果显著，具有很好的市场前景。
表1转基因番茄株系的病情指数以及助did基因的相对表达量转基因株系|Bbchitl基因相对表达水平 I病情指数
WT_0. 00_100. 00
Bb-2 ~ 1.0061.11
Bb-3 ~3.4728.33
Bb-6 — 1.0779. 17
Bb-7 ~3. 1731.25
Bb-8 ~2. 1244.44
Bb-IO ~0.03100.00
Bb-13 ~2. 1050.00
Sw-I — 1.0735.42
Sw-3 — 1.0435.42
Sw-5|θ. 21丨47.92
1权利要求
1.一种提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，在球孢白僵菌几丁酶基因中添加家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域，提高球孢白僵菌几丁酶基因的抗病性。
2.根据权利要求1所述提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)获得球孢白僵菌几丁酶基因助以球孢白僵菌基因组DNA为模板，以序列 1和序列2为引物进行扩增，扩增产物与PMD18载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆获得助Mi 7基因序列；(2)获得家蚕几丁质酶基因的几丁质结合结构域SwChBD利用家蚕4至5龄蜕皮期的mRNA进行反转录合成cDNA ；以cDNA为模板，以序列3和序列4为引物进行扩增，扩增产物克隆入PBS载体，转化大肠杆菌XL-blue感受态细胞，筛选阳性克隆获得SwChBD序列；(3)构建家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域SwChBD与球孢白僵菌几丁酶基因 Bbchitl的融合基因用KpnI与Xba I双酶切pMD18_Bbchitl质粒，回收助基因片段，然后克隆入用SpeI与EcoRI消化的pBS_SwChBD质粒，得到pBS-SwBbchitl载体； 转化大肠杆菌后筛选阳性克隆即获得抗病性提高的新基因SwBbchitl序列。
3.根据权利要求2所述的提高球孢白僵菌几丁酶基因抗病性的方法，其特征在于，将权利要求2的步骤(1)获得的球孢白僵菌几丁酶基因助4#7与步骤(2)获得的家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域SwChBD融合，构建融合基因5k^cAii7，获得较球孢白僵菌几丁酶基因抗病性更好的新基因。
4.一种利用球孢白僵菌几丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于，构建球孢白僵菌几丁酶基因助4#7的植物表达载体后，利用基因工程技术转入植物，获得抗病性更好的转基因植物。
5.根据权利要求4所述利用球孢白僵菌几丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于包括以下步骤1)将权利要求2步骤(3)获得的新基因序列SwBbchitl可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体，获得组成型表达基因的植物表达载体；2)将上述步骤(1)获得的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得转化子；3)将上述步骤(2)获得的农杆菌转化子转化棉花或番茄，经组织培养和抗性筛选获得转基因棉花或番茄。
6.一种利用球孢白僵菌几丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于，将权利要求5所述基因的植物表达载体转入棉花或番茄基因组，实现该基因的组成型表达，进一步提高棉花或番茄的抗病能力。
7.一种利用球孢白僵菌几丁酶基因抗病性培育抗病植物的方法，其特征在于，将权利要求5驗SwBbchitl基因的植物表达载体在制备转基因抗病植物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种提高球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1的抗病性以及利用其培育抗病植物的方法。该方法是将家蚕几丁酶基因的几丁质结合结构域与球孢白僵菌几丁酶基因融合，提高球孢白僵菌几丁酶基因的抗病性。利用35S启动子控制该融合基因SwBbchit1并构建植物表达载体，分别转入棉花和番茄，可进一步提高转基因棉花和番茄的抗病性。利用本发明方法获得的SwBbchit1转基因蕃茄和棉花比Bbchit1转基因番茄和棉花抗病性明显提高。
文档编号C12N15/70GK102533819SQ201210038380
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者侯磊, 宋水清, 张瑞芝, 李先碧, 李德谋, 梁爱敏, 罗小英, 罗志兵, 罗明, 肖月华, 范艳华, 裴炎, 金丹 申请人:西南大学