专利名称：高灵敏度实时荧光检测方法
技术领域：
本发明属于核酸检测领域，具体而言，本发明涉及高灵敏度的实时荧光检测方法及其中所用的检测试剂盒和试剂等。
背景技术：
上世纪九十年代发明的Taqman探针(Taqman Probe)和分子信标技术(Molecular Beacon)极大的促进了荧光实时(Real-Time)聚合酶链式反应(PCR)技术在核酸检测方面的应用和发展。在实时PCR检测中，通常使用标记有荧光基团和淬灭基团的特异性核酸作为探针，在PCR扩增的过程中来实施实时检测。例如，中国专利文献CN101131347A就公开了快速检测日本血吸虫的荧光定量PCR试剂盒，包括正向引物、反向引物和荧光探针，用于荧光定量PCR检测日本血吸虫的DNA ;又如，中国专利文献CN101591716A公开了香蕉苞片花叶病毒实时荧光RT-PCR检测试剂，包括弓I物和荧光标记的探针，用于RT-PCR检测香蕉苞片花叶病毒的RNA。
然而，本发明人发现，在实时PCR的实际应用中，Taqman探针会使整个检测的荧光本底值升高，导致荧光AR值的降低，从而降低检测的灵敏度；而使用分子信标探针，虽然可以有效降低荧光本底值，但是同时会降低检测值，从而也会缩小AR值，而且缩小的幅度甚至会超过使用Taqman探针，有可能进一步降低检测的灵敏度。
为此，本发明人经过长期实践摸索，令人意外地发明了一种新的高灵敏度的实时 PCR检测方法，其能够提高灵敏度，克服Taqman探针和分子信标技术等现有技术的不足。另外，该方法特异性强，能够有效减少荧光本底过高而容易产生的非特异性荧光信号起跳的现象，并且该方法的检测结果可靠而稳定，适于产业化推广应用。另外，本发明人还发明了能用于该实时PCR检测方法中的试剂盒，以及其中的引物、探针等试剂。发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了新的实时PCR检测靶核酸的方法和应用。本发明还提供了用于实时PCR检测靶核酸的试剂盒和其中的试剂，包括引物和/或探针。
具体而言，在第一方面，本发明提供了检测样品中靶核酸的方法，其包括
(I)将样品与PCR扩增试剂和荧光标记的探针混合，其中探针的核酸部分包括第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列，而且第一互补序列和第二互补序列能够互补配对；和
(2)进行PCR，并实时检测荧光。
荧光标记是实时PCR中常用的技术，通常在探针的核酸部分的一端(优选是5’ 端)连接荧光基团(如，已经商品化的FAM)，并在另一端(优选是3’端)连接淬灭基团(如，已经商品化的ECLIPSE)。因此，在本文中，探针包括核酸部分以及分别连接在核酸部分两端的荧光基团和淬灭基团，优选由核酸部分以及分别连接在核酸部分两端的荧光基团和淬灭基团组成。优选在本发明的检测方法中，探针的核酸部分从5’端到3’端依次由第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列组成。在本发明的一个具体实施方式
中，探针为FAM-AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT-ECLIPSE，其中核酸部分为 AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT。在本发明的另一个具体实施方式
中，探针为FAM-CATGTGGTGG CTTCAACATGAT-ECLIPSE，其中核酸部分为 CATGTGGTGGCTTCAACATGAT。
在本文中，样品是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。本发明的检测方法所针对的目标一靶核酸，可以是任何适合实时PCR检测的核酸，如基因或基因片段，包括DNA和RNA，可以是单链核酸，也可以是双链核酸。本领域技术人员能够根据技术实质来判断所用的核酸种类。经过本发明人研究发现， 采用本发明的检测方法，不但可以检测RNA，也可以检测DNA。例如，在本发明的具体实施方式
中，可以检测HCV (丙型肝炎病毒，其为RNA病毒)的NS2基因(RNA)和HBV (乙型肝炎病毒，其为DNA病毒)的S基因(DNA)。这些核酸能够在一定程度上表征HCV和HBV的存在性。因此，本发明的检测方法中靶核酸是RNA或DNA，优选是HCV RNA或HBVDNA。例如HBV S基因或HCV NS2基因。
需要指出的是，本发明的检测方法用于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否，而并非诊断结果。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中HCV或HBV的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的HCV或HBV还是取样时不慎污染的HCV或 HBV，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸表征了 HCV和HBV的存在与否，由于在肝功能正常的HCV或HBV携带者中，有些携带者的病毒检测结果可自然转阴，有些可以终身不发病，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响，因此无法根据该靶核酸的存在而直接判断其携带者是否患有丙型或乙型肝炎或有患病风险度，所以直接目的不是诊断。所以， 本发明的检测方法不是诊断方法。
在本发明的检测方法中，PCR扩增试剂是本领域技术人员所熟悉的。通常，PCR扩增试剂包括能扩增靶核酸序列的引物对、DNA聚合酶和dNTP，另外还可以包括缓冲液。其中，大量试剂已经商品化，例如DNA聚合酶(如，Taq聚合酶)、dNTP(dATP, dTTP，dCTP和 dGTP)和缓冲液，通常包括在厂商的PCR扩增试剂盒中。
另外在本发明的检测方法中，PCR是RT-PCR。这样，本发明的检测方法可以直接检测RNA。RT-PCR及其扩增试剂也是本领域技术人员所熟悉的。通常，RT-PCR扩增试剂在通常的PCR扩增试剂的基础上，还包括反转录酶，如已经商品化的M-MLV反转录酶等。另外为了防止样品中的RNA被快速降解，RT-PCR扩增试剂还可以包括RNase抑制剂，如已经商品化的RNasin等。目前有许多厂商可以直接提供RT-PCR扩增试剂盒，包括以上所有RT-PCR 所需的试剂。
在本发明的检测方法中，引物对用于扩增靶核酸，优选引物对是用于扩增HCVRNA 或HBVDNA的引物对，更优选是用于扩增HBV S基因或HCVNS2基因的引物对。在本发明的一个具体实施方式
中，引物对是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和CGGCGATTGAGACCTTCGT ； 在本发明的另一个具体实施方式
中，引物对是TCGCCATATTACAAGCGCTACA和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。经本发明人研究，这些具体的引物对特别适合本发明具体实施方式
中的PCR步骤。
在本文中，如果未加特别说明，核酸序列的表示都是依照5’端到3’端的次序进行的；核酸的“互补配对”表示一条或一部分单链核酸上的各个碱基从5’端到3’端依次与另一条或另一部分单链核酸上的各个碱基从3’端到5’端互补，包括A与T互补、C与G互补。 这些都是本领域技术人员所熟知的术语。例如，靶核酸特异性序列与靶核酸的一部分特异性片段能够互补配对；而AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT中的“AGAAC”和“GITCT”能够互补配对。
靶核酸特异性序列可以根据靶核酸来设计。优选在本发明的检测方法中，靶核酸特异性序列的长度为8 20个碱基，优选为9 15个碱基，更优选为10 12个碱基。在本发明的一个具体实施方式
中，靶核酸特异性序列为TCCCTCGCCTCG。在本发明的另一个具体实施方式
中，靶核酸特异性序列为GGTGGCTTCA。
第一互补序列和第二互补序列处于同一条单链核酸上，分别位于靶核酸特异性序列，这两条互补序列能够互补配对。其中，“第一”、“第二”只用于区分序列，不对序列结构构成限定。例如，第一互补序列和/或第二互补序列也可以分别与靶核酸的部分序列互补配对，通常第一互补序列和第二互补序列中有一条序列与靶核酸的部分序列互补配对。在本发明的具体实施方式
中，第一互补序列与靶核酸的部分序列互补配对，第一互补序列和靶核酸特异性序列的整体都是对靶核酸具有特异性，而第二互补序列与第一互补序列互补配对。优选在本发明的检测方法中，第一互补序列和第二互补序列的长度相等。例如，第一互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度；而第二互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5 个碱基的长度。在本发明的一个具体实施方式
中，第一互补序列为AGAAC，而第二互补序列为GTTCT。在本发明的另一个具体实施方式
中，第一互补序列为CATGT，而第二互补序列为 ACATG。
延伸序列可以在连接在第一互补序列的5’端，也可以连接第二互补序列的3’端， 优选是后者。优选在本发明的检测方法中，延伸序列的长度为2 5个碱基，优选为2 3 个碱基，更优选为2个碱基。延伸序列是高AT含量的序列，例如AT含量大于60%，优选大于80%,最优选所有核苷酸均选自A和T。在本发明的具体实施方式
中，延伸序列为AT。
PCR通常包括变性、退火和延伸这三个步骤，RT-PCR还进一步包括反转录步骤。例如，在42°C左右进行反转录，在大于90°C进行变性，在50 65°C进行退火，在约72°C进行延伸。优选在本发明的检测方法中，PCR的退火温度为55 65°C，更优选为58 63°C，最优选为60°C。也优选在本发明的检测方法中，PCR的退火时间为20 60秒，更优选为25 40秒，最优选为30秒。本发明人研究发现，本发明的检测方法可以不包括延伸步骤，仍旧能够完成检测，这样可以缩短检测时间。因此优选在本发明的检测方法中，PCR没有延伸步骤。
在第二方面，本发明提供了样品中靶核酸的检测试剂盒，其包括PCR扩增试剂和荧光标记的探针，其中探针的核酸部分包括第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列。
优选在本发明的检测试剂盒中，探针的核酸部分从5’端到3’端依次由第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列组成。在本发明的一个具体实施方式
中，探针为FAM-AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT-ECLIPSE，其中核酸部分为AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT。在本发明的另一个具体实施方式
中，探针为FAM-CATGTGGTGG CTTCAACATGAT-ECLIPSE，其中核酸部分为 CATGTGGTGGCTTCAACATGAT。
在本发明的检测试剂盒中，PCR扩增试剂包括能扩增靶核酸序列的引物对、DNA聚合酶和dNTP，另外还可以包括缓冲液。这样可以进行常规的PCR。进一步优选为了进行 RT-PCR，PCR扩增试剂是RT-PCR扩增试剂。RT-PCR扩增试剂包括能扩增靶核酸序列的引物对、DNA聚合酶、dNTP和反转录酶，优选还包括RNase抑制剂。
优选在本发明的检测试剂盒中，引物对是用于扩增HCVRNA或HBVDNA的引物对，更优选是用于扩增HBV S基因或HCV NS2基因的引物对。在本发明的一个具体实施方式
中， 引物对是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和CGGCGATTGAGACCTTCGT ;在本发明的另一个具体实施方式
中，引物对是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。经本发明人研究， 这些具体的引物对特别适合本发明具体实施方式
中的PCR步骤。
优选在本发明的检测试剂盒中，靶核酸特异性序列的长度为8 20个碱基，优选为9 15个碱基,更优选为10 12个碱基。在本发明的一个具体实施方式
中，祀核酸特异性序列为TCCCTCGCCTCG。在本发明的另一个具体实施方式
中，靶核酸特异性序列为 GGTGGCTTCA。
优选在本发明的检测试剂盒中，第一互补序列和第二互补序列的长度相等。例如， 第一互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度；而第二互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度。在本发明的一个具体实施方式
中，第一互补序列为AGAAC，而第二互补序列为GTTCT。在本发明的另一个具体实施方式
中，第一互补序列为CATGT，而第二互补序列为ACATG。
优选在本发明的检测试剂盒中，延伸序列的长度为2 5个碱基，优选为2 3个碱基，更优选为2个碱基。延伸序列是高AT含量的序列，例如AT含量大于60%，优选大于 80%,最优选所有核苷酸均选自A和T。在本发明的具体实施方式
中，延伸序列为AT。
在第三方面，本发明提供了本发明第二方面的试剂盒在制备用于检测样品中靶核酸的方法的检测产品中的应用。检测产品包括本发明第二方面的试剂盒。优选检测产品还可以进一步包括其他与检测样品中靶核酸相关的制品。例如，检测样品中靶核酸的方法可以是本发明第一方面的方法，因此优选，检测产品还包括记载本发明第一方面的方法的说明书。又如，本发明第二方面的试剂盒可以和荧光PCR仪搭配出售，因此优选检测产品还包括荧光PCR仪。
在第四方面，本发明提供了探针，其核酸部分包括第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列。该探针优选是荧光标记的探针，可以用于本发明第一、第二和第三方面中。
优选在本发明的探针中，靶核酸特异性序列的长度为8 20个碱基，优选为9 15个碱基，更优选为10 12个碱基。在本发明的一个具体实施方式
中，靶核酸特异性序列为TCCCTCGCCTCG。在本发明的另一个具体实施方式
中，靶核酸特异性序列为GGTGGCTTCA。
优选在本发明的探针中，第一互补序列和第二互补序列的长度相等。例如，第一互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度；而第二互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度。在本发明的一个具体实施方式
中，第一互补序列为AGAAC，而第二互补序列为GTTCT。在本发明的另一个具体实施方式
中，第一互补序列为CATGT，而第二互补序列为 ACATG。
优选在本发明的探针中，延伸序列的长度为2 5个碱基，优选为2 3个碱基， 更优选为2个碱基。延伸序列是高AT含量的序列，例如AT含量大于60%，优选大于80%， 最优选所有核苷酸均选自A和T。在本发明的具体实施方式
中，延伸序列为AT。
优选在本发明的探针的核酸部分从5’端到3’端依次由第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列组成。在本发明的一个具体实施方式
中，探针为FAM-AG AACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT-ECLIPSE，其中核酸部分为 AGAACTCCCTCGCCTCGGTTCTAT。在本发明的另一个具体实施方式
中，探针为FAM-CATGTGGTGGCTTCAACATGAT-ECLIPSE，其中核酸部分为 CATGTGGTGGCTTCAACATGAT。
在第五方面，本发明提供了引物对，其选自扩增HBV S基因的引物对和扩增HCV NS2基因的引物对，其中扩增HBV S基因的引物是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和 CGGCGATTGAGACCTTCGT,扩增 HCV NS2 基因的引物对是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。
本发明的有益效果在于，降低荧光本底并提高荧光检测信号，具有很高的信噪比， 提高了检测的灵敏度和特异性；检测应用的范围广，可以针对DNA和RNA的检测；缩短检测时间，提高检测效率；可以使用常规的荧光PCR仪进行，节约了检测成本；检测结果可靠而稳定，适于产业化推广应用。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
图I为检测核酸(DNA)的结果比较图，其中各曲线编号所使用的探针和模板为1， 本发明优化的探针，阳性模板；2，对照探针1，阳性模板；3，对照探针1，阴性模板；4，对照探针2，阳性模板；5，本发明优化的探针阴性模板；6，对照探针2，阴性模板。
图2为检测核酸(RNA)结果图，的结果比较图，其中各曲线编号所使用的探针和模板为山本发明优化的探针，阳性模板；2，对照探针1，阳性模板；3，对照探针1，阴性模板; 4，对照探针2，阳性模板；5，本发明优化的探针阴性模板；6，对照探针2，阴性模板。
具体实施方式
以下结合具体的实施例进行说明，其中引物、探针的合成、试剂以及样品均可通过商业渠道获得，实验步骤如有未尽之处，均可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(科学出版社，2002)等教课书和实验手册，并可以按照商业化的酶、试剂和设备的厂商说明来进行。
实施例IDNA序列的检测
我们设计了针对HBV S基因序列的引物和探针，委托北京六合通经贸有限公司合成了如下PCR扩增引物和探针(包括对照探针)，以含有HBV(乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA) 定性及定量国家参考品，编号300009，可根据规定购自中国食品药品检定研究院，用纯化水分别稀释)I X 102IU/ml (阳性)、20IU/ml (灵敏度I)及10IU/ml (灵敏度2)的水溶液或纯水(阴性)分别作为模板，在ABI 7500突光PCR仪(可购自Applied Biosystems公司) 上进行PCR检测
正向引物CGAGGCAGGTCCCCTAGAA
反向引物CGGCGATTGAGACCTTCGT
传统的Taqman特异性方法使用的探针(对照探针I): FAM-AGAACTCCCTCGCCTCG-ECLIPSE，其核酸的5’端标记有荧光染料FAM，3’端标记有淬灭基团 ECLIPSE
传统的分子信标方法使用的探针(对照探针2) FAM- GCACG AGAACTCCCTCGCCTCG CGTGC -ECLIPSE,其核酸的5’端标记有荧光染料FAM，3’端标记有淬灭基团ECLIPSE，其中斜体字部分是互补配对序列
本发明优化的探针FAM-v4GA4CTCCCTCGCCTCG GTTCTAT -ECLIPSE,其核酸的 5’ 端标记有荧光染料FAM，3’端标记有淬灭基团ECLIPSE，其中斜体字部分是互补配对序列， 粗体字部分是延伸序列
PCR反应体系
模板40|ilI Ox缓冲液6|ildNTP (IOOmM)各 0.12|ilTaq 聚合酶(5U/|il)0.5|il正向引物(IOOmM)0.2|il反向引物(IOOmM)0.2|il探针(IOOmM)0.1 |ilH2O补足至60|il
以上的反应体系中，模板分别取阳性模板、阴性模板或灵敏度1、2模板，探针分别取上述对照探针1、2或本发明优化的探针，PCR反应的步骤为94°C 10分钟，45个循环 (940C 10秒，60°C 30秒)，并在60°C检测荧光信号。
检测结果如图I和表I所示，在相同检测条件下，使用本发明优化的新扩增体系 (含新型探针)检测HBV(DNA)样品，取得的阴性及阳性样品检测的荧光本底值均较低，而阳性样品检测时取得的荧光信号值大，其ARn(荧光信号值与荧光本底的差值)值高，实时荧光检测的Ct值(Ct值与待检模板数量成反比)最小，检测灵敏度高；使用对照探针2检测HBV(DNA)样品，虽然荧光本底值与本发明相似，但是荧光信号值较小，其ARn值很低，因此在检测低浓度样本时，因ARn值过低无法检出，降低了检测灵敏度；使用对照探针I检测 HBV (DNA)样品，荧光本底值较大，虽然其阳性样本的荧光信号值较高，但因荧光本底值过高而降低了 △ Rn值，使低浓度样本不易稳定的检出，且过高的荧光本底容易产生非特异的荧光信号起跳，从而降低了检测特异性。可见，本发明优化的扩增体系在实现高信噪比的同时达到了高特异性及高灵敏度的DNA检测效果，特别是在低浓度样本检测时能达到更好的可靠性和稳定性，经测试，相对于传统方法，本发明优化的方法检测DNA样品约能提高灵敏度 5-10 倍。
表I检测HBV核酸的结果比较表
权利要求
1.检测样品中靶核酸的方法，其包括(1)将样品与PCR扩增试剂和荧光标记的探针混合，其中探针的核酸部分包括第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列，而且第一互补序列和第二互补序列能够互补配对，优选探针的核酸部分从5’端到3’端依次由第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列组成；和(2)进行PCR，并实时检测荧光。
2.权利要求I所述的方法，其中靶核酸是RNA或DNA，优选是HCVRNA或HBVDNA，例如 HBV S基因或HCVNS2基因。
3.权利要求I所述的方法，其中PCR扩增试剂包括能扩增靶核酸序列的引物对、DNA聚合酶和dNTP。
4.权利要求I或3所述的方法，其中PCR是RT-PCR;优选其中PCR扩增试剂还包括反转录酶，优选还包括RNase抑制剂。
5.权利要求3所述的方法，其中引物对是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和 CGGCGATTGAGACCTTCGT,或者是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。
6.权利要求I所述的方法，其中，靶核酸特异性序列为8 20个碱基的长度，优选为9 15个碱基的长度，更优选为 10 12个碱基的长度，最优选为TCCCTCGCCTCG或GGTGGCTTCA ；第一互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度，最优选为AGAAC或CATGT ；第二互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度，最优选为GTTCT或ACATG ;和/或，延伸序列为2 5个碱基的长度，优选为2 3个碱基的长度，更优选为2个碱基的长度，最优选为AT。
7.权利要求I所述的方法，其中PCR没有延伸步骤，优选PCR的退火温度为55 65°C， 更优选为58 63°C，最优选为60°C ;和/或，优选PCR的退火时间为20 60秒，更优选为 25 40秒，最优选为30秒。
8.样品中靶核酸的检测试剂盒，其包括PCR扩增试剂和荧光标记的探针，其中探针的核酸部分包括第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列，而且第一互补序列和第二互补序列能够互补配对，优选探针的核酸部分从5’端到3’端依次由第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列组成。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中PCR扩增试剂包括能扩增靶核酸序列的引物对、DNA 聚合酶和dNTP。
10.权利要求8所述的试剂盒，其中PCR扩增试剂是RT-PCR扩增试剂，其包括能扩增靶核酸序列的引物对、DNA聚合酶、dNTP和反转录酶，优选还包括RNase抑制剂。
11.权利要求9或10所述的试剂盒，其中引物对是CGAGGCAGGTCCCCTAGAA和 CGGCGATTGAGACCTTCGT,或者是 TCGCCATATTACAAGCGCTACA 和 GCGCTTCTACTCTGGTCAGAAAA。
12.权利要求8所述的试剂盒，其中靶核酸特异性序列为8 20个碱基的长度，优选为9 15个碱基的长度，更优选为 10 12个碱基的长度，最优选为TCCCTCGCCTCG或GGTGGCTTCA ；第一互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度，最优选为AGAAC或CATGT ；第二互补序列分别为4 8个碱基的长度，优选为5 7个碱基的长度，更优选为5个碱基的长度，最优选为GTTCT或ACATG ;和/或，延伸序列为2 5个碱基的长度，优选为2 3个碱基的长度，更优选为2个碱基的长度，最优选为AT。
13.权利要求8 12所述的试剂盒在制备用于检测样品中靶核酸的方法的检测产品中的应用。
14.权利要求13所述的应用，其中检测样品中靶核酸的方法是权利要求I 7所述的方法。
15.权利要求13所述的应用，检测产品还包括记载权利要求I 7所述的方法的说明书和/或荧光PCR仪。
16.权利要求I 15中所用的探针或引物对。
全文摘要
高灵敏度实时荧光检测方法。本发明提供了检测样品中靶核酸的方法，其包括，将样品与PCR扩增试剂和荧光标记的探针混合，其中探针的核酸部分包括第一互补序列、靶核酸特异性序列、第二互补序列和延伸序列，而且第一互补序列和第二互补序列能够互补配对；和进行PCR，并实时检测荧光。本发明还提供了检测试剂盒、制备检测产品的应用以及其中使用的引物、探针等试剂。
文档编号C12Q1/68GK102534033SQ20121003830
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者刘明霞, 张文艳, 陈悦科 申请人:苏州华益美生物科技有限公司