一种应用纳米磁珠提取食用油脂中核酸的试剂盒的制作方法

专利名称：一种应用纳米磁珠提取食用油脂中核酸的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种应用纳米磁珠提取食用油脂类核酸的试剂盒。
技术背景
核酸的提取与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。随着分子生物学技术广泛应用于生物学，医学，食品检测及其相关领域，核酸的提取与纯化技术也得到了进一步的发展。
日前常采用的核酸提取技术大体上可以分为液-液提取和固相提取两种方法。其中液-液提取法发展的较早，使用比较广泛，主要原理是基于DNA在不同溶剂中溶解行为不同来达到分离纯化DNA目的，其优点在于提取DNA产率较高，成本低廉，主要缺点是费时费力，提取DNA纯度不高，大量使用有毒溶剂，难以实现自动操作。固相萃取法发展较晚，其主要原理是将DNA在一定条件下吸附到固体表面(通常为硅胶、离子交换、膜介质)，除去其它不吸附的杂质后，再将DNA从固相表面洗脱下来。目前大多数核酸提取试剂盒都是基于固相萃取技术。固相提取法克服了以往液-液提取法的缺点，大大提高了提取效率，虽然提取产率稍逊于液-液提取法，但是纯度较高，而且不含有液-液提取中常出现的酚和表面活性剂等杂质，因而更适合后续分子生物学检测，但是固相分离时往往需要通过离心或抽滤等手段来进行试剂体系的交换与核酸的同收，不太适用于自动化平台。另外，固相介质价格昂贵，会使检测成本有所提高。
纳米磁珠法提取核酸是近儿年才发展起来的核酸提取方法。其主要原理是在磁珠(主要为铁氧体)表面通过共聚合和表面修饰等引入活性基团，这些活性基团有-C00H，-NH2, -OH, -C0H, -SH, -S03等，利用磁珠表面的这些活性基团，以共价键的形式偶联在磁珠的表面，制备成具有磁性的亲和吸附剂，然斤与生物样品共同孵育后，目标分子能够迅速被磁珠捕获，可以在磁场作用下从液相中沉降下来，经过简单的洗涤，分离得到表面结合有目标分子的磁珠复合物，通过改变洗涤条件可以将目标分子从磁珠上洗脱下来。其提取过程中不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的基因组DNA纯度高、产量高，提取步骤简单，不需要离心，不仅可以满足从小亮到大量不同提取规模的要求，还能选择手动和自动化操作，使分离技术取得了巨大的进步。
到目前为止，保存较好的生物材料、加工或部分深加工生物材料基本均可利用一种或多种核酸提取技术提取到适量的核酸进行后续的分子生物学操作，但对于某些特殊的实验材料(如食用油脂等)，目前常用的核酸提取方法却难以提取到供后续检测的核酸。多年来，国内外诸多实验室均尝试建立稳定可靠的食用油脂中核酸的提取方法，专利号 200810029117. 7的专利公开了“一种提取食用油脂中核酸的方法”，利用传统的CTAB法，配合自制的长片段核酸富集纯化装置，从食用油脂中提取到了适量的核酸供后续PCR检测， 但该方法仍然使用了苯酚、氯仿等有机溶剂，对人身体有害，操作过程复杂，并且需要使用特殊的富集装置，方法的可操作性不强，不利于推广使用。
因此，市场上需要开发一些操作简单、稳定可靠、成本低、产量高的油脂类DNA提取试剂盒。 发明内容
本发明的目的在于提供一种食用油脂类DNA提取试剂盒，该试剂盒制备过程简单可靠、成本低、产品质量稳定，适用于各类食用油脂样品的DNA提取。包括裂解液、沉淀液、 共沉剂、结合液、磁珠缓冲液、洗涤缓冲液I、洗涤缓冲液II、洗脱缓冲液。
所述的裂解液含有10mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 2 % 十二烷基磺酸钠(SDS)，该裂解液的pH值为8. 0。
所述的沉淀液含有5g/L CTAB,40mmol/L NaCl。
所述的共沉剂为lg/ml的糖元。
所述的磁珠缓冲液中的磁珠由内核层由磁性!^e3O4颗粒构成，内核层外包被了四乙氧基硅烷(TEOS)。
所述的洗涤缓冲液I 含有 10mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl，20mol/L EDTA，该洗涤缓冲液PH值为6.0。
所述的洗涤缓冲液II含有70%的无水乙醇。
所述的洗脱缓冲液含有lOmmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA,该缓冲液的PH值为 8. 0。
本发明提供一种磁珠制备方法。包括纳米!^e3O4磁珠的制备；磁珠表面四乙氧基硅烷修饰。
本发明还提供了一种根据权利要求1所述的试剂盒提取油脂中核酸的方法，步骤如下油脂中极性成分的萃取；使用裂解液释放核酸；磁珠特异性吸附核酸；洗涤去除杂质；洗脱得到核酸溶液。
本发明修饰的!^e3O4磁珠可以把基因组DNA吸附在表面，蛋白质、脂类等其它杂质不被吸附。用洗涤液将其它杂质冲洗掉，吸附在磁珠表面的基因组DNA可以直接作为PCR 的模板，也可以加入洗脱液，将吸附于磁珠表面的DNA洗脱并用于后续实验。
本发明的优点为实验者提供了一种食用油脂中核酸的提取试剂盒。本试剂盒不需要使用苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，安全性好，操作简单，可以从多种食用油脂中提取得到适量DNA片段，满足后续分子生物学检测需求。本试剂盒可以储存在4°C，也可以在室温下放置，便于运输。


图1为初榨大豆油、精炼大豆油内源基因荧光定量PCR检测图谱； 扩增曲线自左向右依次为阳性参比、初榨大豆油、精炼大豆油。
图2为初榨玉米油、精炼玉米油内源基因荧光定量PCR检测图谱； 扩增曲线自左向右依次为阳性参比、初榨玉米油、精炼玉米油。
图3为初榨花生油、精炼花生油内源基因荧光定量PCR检测图谱； 扩增曲线自左向右依次为阳性参比、初榨花生油、精炼花生油。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 试剂盒组成与配制
1、裂解液
IOmmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 20mmol/L EDTA，2 % 十二烷基磺酸钠 (SDS)，该裂解液的pH值为8.0。
2、沉淀液
5g/L CTAB,40mmol/L NaCl
3、共沉剂
lg/ml 的糖元
4、磁珠缓冲液
采用热还原法制备内核为磁性狗304颗粒，外包被了四乙氧基硅烷(TEOS) —单分散相超顺磁性颗粒的水溶液。
1)纳米!^e3O4颗粒的制备
量取20mL乙二醇，加入0. 5g PEG6000，加热完全溶解；加入1. 8g乙酸钠和1. 35g FeCl3 · 6H20，剧烈搅拌30min，充分混合均勻；将液体转入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，200°C加热他；冷却至室温后，将产物依次用无水乙醇和去离子水洗涤数次；60°C真空干燥，得到黑色磁性!^e3O4微球。
2)磁性!^e3O4微球表面包覆
称取Ig磁性微球，用0. lmol/L HCl超声处理Ih ；蒸馏水洗涤，加入无水乙醇 40mL,蒸馏水8mL，氨水0. 2mL,四乙氧基硅烷(TEOS) 0. 25mL,室温搅拌反应3h，产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤，60°C真空干燥，获得表面硅胶包覆的磁性!^e3O4微球。
3)配制成200g/L，PH值7. 0的水悬浊液。
6、洗涤缓冲液I
IOmmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl，20mol/L EDTA,该洗涤缓冲液 PH 值为 6. 0。
7、洗涤缓冲液II
70%的无水乙醇。
8、洗脱缓冲液
IOmmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA,该缓冲液的 PH 值为 8. 0。
实施例2 使用试剂盒提取儿种大豆油/玉米油中核酸并进行荧光定量PCR检测
利用实施例1所述试剂盒提取儿种食用油(大豆油、玉米油和花生油)中核酸，并对内源基因进行荧光定量PCR检测。
本实例包括以下步骤
1、儿种食用油脂中核酸片段的提取
(1)将裂解液置于室温下平衡30min或在55°C水浴中预热5min ；
(2)量取待测油IOOml于250ml烧杯中，加入IOOml无菌水，放入超声波清洗仪中， 超声消解20min ；
(3)取出倒入4支50ml离心管中，12000rpm离心IOmin ；
(4)取下层水相40ml分于4支新的50ml离心管中，加入预热的细胞裂解液10mL， 65°C温育 30min ；
(5)加入IOyL DNA共沉剂，两倍体积沉淀液，充分混勻，_20°C静置Ih ；
(6) 12000rpm离心lOmin，弃上清，用500 μ L无菌水溶解沉淀；
(7)加入50 μ L磁性微球，加入0. 8倍体积异丙醇，室温翻转混勻5min，磁分离弃去清液；
(8)加入Iml洗涤缓冲液I，震荡混勻2min，磁分离，去上清；
(9)加入Iml洗涤缓冲液II，震荡混勻2min，磁分离，去上清；
(10)室温下风干或放入真空干燥仪中干燥；
(11)加入50ml洗脱缓冲液，震荡混勻，磁分离，取上清备用。
2、儿种食用油内源基因荧光定量PCR检测
取上述提取到的油脂中DNA片段，用ABI公司的7900型荧光PCR仪对内源基因进行荧光PCR检测，结果见图1、2、3。
本实施例中采用的引物和探针
大豆油(Lectin)
5，-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3，(上游引物)
5，-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3，(下游引物)
Probe 5' -FAM-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-TAMRA-3'
玉米油(zSSIIb)
5，-CTC CCAATC CTTTGACATCTG C-3，(上游引物)
5，-TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG-3，(下游引物)
Probe 5-FAM-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-TAMRA-3'
花生油(AF431131)
5，-TCA GAA TCC CAT CCG GTT TC-3，(上游引物)
5，-GTG TTAACG GGC ATG GAG AT-3，(下游引物)
5' -FAM-CCT ACA TCT TGA ACC GCC ATG ACA A-TAMRA-3'
PCR扩增体系(取2 μ IDNA溶液PCR扩增模板)
ddH2017. 5μ 1
Taq PCR Buffer 2 μ 1
dNTP Mixture2 μ 1
Taq0. 5 μ 1
PrimerF1 μ 1
PrimerR1 μ 1
Probe1 μ 1
Total25 μ 1
荧光PCR扩增条件
94°C 预变性 5min;
94°C 变性 5min，
60°C退火 30sec，
72°C延伸 40sec，40 个循环。
由图1、2、3可以看出，儿种食用油的内源基因都能被很好的扩增，初榨油的CT值小于精炼油的CT值，说明初榨油中由于加工程度不深，DNA片段含量较高。扩增曲线光滑， 重复性好，CT值均低于40，说明应用本方法能够提取出适量的DNA片段，满足后续分子生物学的检测。
权利要求
1.一种应用纳米磁珠提取食用油脂类DNA的试剂盒及其应用，其组分如下裂解液、沉淀液、共沉剂、结合液、磁珠缓冲液、洗涤缓冲液I、洗涤缓冲液II、洗脱缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的裂解液含有lOmmol/L Tris-HCl, 150mmol/LNaCl,20mmol/L EDTA，2%十二烷基磺酸钠(SDS)，该裂解液的 pH 值为 8. 0。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的沉淀液含有5g/LCTAB，40mmol/ LNaCl。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的共沉剂为糖元。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的结合液为3mol/L的NaAC。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的磁珠缓冲液中的磁珠由内核层由磁性!^e3O4颗粒构成，内核层外包被了四乙氧基硅烷(TEOS)。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的洗涤缓冲液I含有lOmmol/L Tris-HCl, 150mmol/LNaCl,20mol/L EDTA,该洗涤缓冲液 PH 值为 6. 0。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的洗涤缓冲液II含有70%的无水乙醇。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的洗脱缓冲液含有lOmmol/L Tris-HCl, lmmol/LEDTA,该缓冲液的 PH 值为 8. 0。
10.根据权利要求1所述的试剂盒提取油脂中核酸的方法，步骤如下使用双蒸水萃取油脂中极性成分；使用裂解液释放核酸；磁珠特异性吸附核酸；洗涤去除杂质；洗脱得到核酸溶液。
全文摘要
本发明提供一种应用纳米磁珠提取食用油脂类核酸的试剂盒。试剂盒包括裂解液、沉淀液、共沉剂、磁珠缓冲液、洗涤缓冲液I、洗涤缓冲液II、洗脱缓冲液组成。油脂中DNA提取主要步骤包括油脂中极性成分的萃取、细胞裂解、核酸吸附、杂质去除和核酸洗脱。应用本试剂盒提取食用油脂DNA不需要使用苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，安全性好、操作简单快速，提取的DNA丰度较高。本试剂盒适用于从初榨或精炼大豆油、玉米油、花生油等食用油脂中提取DNA，以满足后续PCR或其他分子生物学检测。
文档编号C12N15/10GK102533734SQ20121003769
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者刘鹏, 廖芳, 王金成, 罗家凤, 赵卫东, 郑文杰, 郭京泽 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心