用于检测大前庭水管相关耳聋基因常见突变的探针及试剂盒的制作方法

专利名称：用于检测大前庭水管相关耳聋基因常见突变的探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于诊断常染色体隐性遗传大前庭水管综合征的探针及其用途，更具体的是涉及用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的常见突变IVS7-2A > G的实时荧光定量MGB探针及包括所述探针的试剂盒。本发明还涉及所述探针及其相关产品在制备用于诊断常染色体隐性遗传大前庭水管耳聋疾病的试剂盒或类似产品中的应用。
背景技术：
大前庭水管(Enlarged Vestibular Aqueduct,EVA)是一种最常见的内耳畸形，其在感音神经性听力损失患者中约占1-12%。临床表现为学龄前发病的感音神经性或低频混合性听力损失，以高频损失为主，听力损失程度从轻度到极重度不等，听力常呈波动性或进行性下降，最终达重度或极重度，从而影响语言的学习或正常的交流。前庭水管扩大患者在听力下降前常有感冒、发烧、外伤或其它使颅内压增高的诱发因素，因此对于该病的早期发现、早期诊断、早期干预成为预防或推迟其发病的有效措施。目前研究表明，前庭水管扩大是一种常染色体隐性遗传性疾病，与位于7q31的 SLC26A4基因突变相关。SLU6A4基因由Everett等在一个常染色体隐性遗传性疾病—— Pendred综合征(大前庭水管或伴内耳畸形，神经性聋和甲状腺肿)的家系中首先发现，后来^ami等对单纯大前庭水管家系进行SLC26A4基因筛查，同样发现该基因存在突变。SLC26A4基因又称PDS基因(Pendred syndrome，PDS)，属于离子转运子家族，位于人类染色体7q31，含有21个外显子，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin是一种跨膜蛋白，主要表达于甲状腺，在内耳、胎肾和胎脑中也有分布。在甲状腺，Pendrin表达于滤泡上皮细胞顶端亚膜单位。Royaux认为Pendrin作为甲状腺上皮细胞内碘的顶端转运子，将细胞内碘转运到滤泡腔，与甲状腺过氧化物酶作用导致碘的有机化，并与甲状腺球蛋白结合，维持甲状腺的正常功能。在内耳，Pendrin表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊、球囊以及Corti’s器外沟细胞、根细胞、螺旋突上皮细胞和血管纹梭形细胞等处。内淋巴管和内淋巴囊与内淋巴液代谢有关，Pendrin可能作为氯离子转运体调节内淋巴液的离子平衡， 同时作为碳酸氢根离子转运体将血管纹内空间的碳酸氢根分泌入内淋巴液，碳酸氢根的堆积将限制保护性谷胱甘肽的产生从而增加自由基压力，碳酸氢根的移除有助于保护血管纹免受自由基损伤，维持其正常功能。SLC26A4基因全长 58368bp(SEQ ID NO 1)，其mRNA 长4930bp (SEQ ID NO 2) ,cDNA 长2343bp(SEQ ID NO :3)。SL(^6A4基因开放阅读框架起始于2号外显子，分布穿越剩余 20个外显子。除21号外显子Q380bp)外，其它外显子长度约为55-231bp。第21号外显子中只有部分碱基参与编码氨基酸，其余不参与蛋白的编码，功能上属于5’ UTR区，第1号外显子功能上属于3’ UTR区。近年来，多项研究表明SLU6A4基因突变与单纯大前庭水管和Pendred综合征有密切关系。大前庭水管患者中SLU6A4基因突变检出率分别为中国人97.9% ；日本人 78. 1% ；韩国人92. 31% ；高加索人40%。由SL(^6A4基因突变导致或与其相关的非综合征耳聋患者的比例分别是东亚至少5%的语前聋病人携带SL(^6A4基因突变；南亚约5% 的常染色体隐性遗传性耳聋病人携带SLC26A4基因突变；高加索人约4% ；英国3. 5% ；中国1434%。由上可见，中国大前庭水管耳聋人群中SL(^6A4基因突变检出率最高，中国耳聋人群中由SLC26A4基因突变致聋的比例也高于其他国家。因此，在中国耳聋人群中进行 SLC26A4基因检测对明确耳聋病因具有重要意义。聋病分子流行病学调查显示，中国大前庭水管人群中SLU6A4基因突变谱广，突变类型多达100种。IVS7-2A > G为中国耳聋人群中SLC26A4基因的最热点突变，包括该热点突变在内的 10 种突变(IVS7-2A > G、A2168G、G1226A、G1975C、A1174T、C12^T、IVS15+5G > A、T2027A、G589A、C281T)的等位基因频率之和为69. 75%，突变体频率之和为81. 84%。 上述10种突变为SLC26A4基因的常见突变。86%的大前庭水管患者携带至少上述一种常见突变，55. 69%的大前庭水管患者同时携带上述两种突变。而最热点突变IVS7-2A > 6等位基因频率为44. 11%，突变体频率为60. 73%。因SLC26A4是个较大的基因，突变种类多， 基因诊断工作量大，耗时长。因此，建立SL(^6A4基因常见突变的快速检测方法，对于快速明确大前庭水管相关耳聋的分子病因、减轻工作量，缩短诊断时间具有重要意义。目前，对SLC26A4基因突变检测的主要方法是直接测序，此外还有针对突变位点的限制性内切酶分析法。前者是突变检测的金标准，但耗时相对长、成本较高，不适合大规模筛查。后者具有成本低的优势，但仍需聚合酶链反应后的繁琐处理，耗时较长，为克服这一缺点我们设计了一种更为简单、快速、准确、减少污染而且成本低廉的检测方法，以满足对SLU6A4基因常见突变进行快速筛查的需要。定义等位基因频率一等位基因在这个种群中所有该等位基因所在的特定基因座中所占的百分比，此处指突变的等位基因在检测的所有等位基因中所占的百分比。突变体频率指某一突变的等位基因在检测到的所有突变的等位基因中所占的百分比。IVS7-2A > G是指第7内含子末端距离第8外显子2个碱基处的A被G取代。IVS Jntravening sequence 剪切序列

发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因 SLC26A4的最常见突变IVS7-2A > G的实时荧光定量MGB探针及包括所述探针的试剂盒。本发明目的通过下述原理实现为了检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4的一种最常见突变IVS7-2A > G，设计覆盖所述突变位点在内的TaqMan MGB探针，并且在该MGB探针片段的 5’末端标记了荧光报告基团，在3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB。其中如果MGB探针在IVS7-2位点相应的碱基A被替换为G，则称为突变型实时定量MGB探针(或突变型MGB 探针、突变型iTaqman MGB探针)；如果MGB探针在IVS7-2位点仍然为A，则称为野生型实时定量MGB探针(或野生型MGB探针、野生型Taqman MGB探针)。
由于突变型和野生型两种MGB探针的5 ’端荧光报告基团不同，二者发射波长不同的荧光。不同波长的荧光在实时定量荧光PCR仪器上能被分别记录下来，在分析软件中以不同的颜色或不同的标记反映出来，并且不同MGB探针结合模板可发射不同波长的荧光。 因此，针对上述突变的突变型MGB探针能与发生相应纯合突变的模板完全匹配，而不能与野生型模板完全匹配；而野生型MGB探针不能与发生相应纯合突变的模板完全匹配，而只能与野生型模板完全匹配；野生型与突变型探针都能与发生相应杂合突变的模板结合，但是在这种情况下，检测到的野生型荧光信号的强度弱于单纯与野生型模板结合时检测到的信号，检测到的突变型荧光信号的强度弱于单纯与纯合突变的模板结合时检测到的信号。在实时定量PCR扩增体系中，加入用于扩增常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SL(^6A4的一种常见突变IVS7-2A > G的正向引物和反向引物(可以根据任何生物引物软件进行设计)。由于MGB探针很短(12_25bp左右)，5'端荧光报告基团吸收能量后可将能量转移给邻近的3'端非荧光淬灭基团，而3'端非荧光淬灭基团则可抑制5’端荧光报告基团的荧光发射。因此，MGB探针完整时，即5’端荧光报告基团未脱离3’非荧光淬灭基团的屏蔽时，检测不到MGB探针5'端荧光基团发出的荧光。本发明提供了一种用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因 SLC26A4的最常见突变IVS7-2A > G的实时荧光定量MGB探针，野生型探针位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4序列SEQ ID NO :1所示的相关区域中 IVS7-2A > G位于SLC26A4基因第7内含子末端距离第8外显子2个碱基处，野生型探针位于第234(X3bp-2342^p ；突变型探针位于如常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SL(^6A4序列SEQ ID NO 1所示的相关区域中IVS7_2A > G突变型探针位于第 23404bp-23425bp。在所述野生型探针片段的5’末端标记了荧光报告基团VIC、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB ；在所述突变型探针片段的5’末端标记了荧光报告基团FAM、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB。所述野生型探针序列为5' VIC-TCTTTTGTTTTATTTC A GACGAT-MGB3'；所述突变型探针序列为5' FAM-CTTTTGTTTTATTTC G GACGAT-MGB3‘。所述突变型及野生型探针的区别在于IVS7_2A > G突变野生型探针第23419bp 碱基A被替换为G。本发明还提供了一种用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因 SLC26A4的最常见突变IVS7-2A > G的试剂盒，该试剂盒包括(1)提取血样DNA的试剂；(2) PCR扩增反应试剂混合液；(3)用于扩增所述SLC26A4基因常见突变的野生型MGB探针、突变型MGB探针及对应的正向引物、反向引物的混合液；(4)使用说明书。所述正、反向引物位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4序列SEQ ID NO :1所示的相关区域中针对IVS7-2A > G突变的正向引物位于第 23360bp-23391bp，反向引物位于第 23438bp_23461bp。所述正、反向引物的序列如下正向引物F:5' GTTGACAAACAAGGAATTATTAAAACCAATGG3'；反向引物R 5' TCCAGGTTGGCTCCATATGAAATG3‘。所述PCR扩增反应试剂混合液是2XMastermix混和液(ABI公司产品)；所述野生型探针、突变型探针及对应的正向引物、反向引物混和液是Assaymix混和液[正、反向引物(2ρπι01/μ 1)各1 μ 1，野生型探针、突变型探针(2ρπι01/μ 1)各1 μ 1]；所述提取血样DNA 的试剂为提取足根血DNA的溶液I，其主要成分为Chelex(ABI公司产品)。所述PCR扩增反应试剂混合液还可以是2XMastermix混和液(ABI公司产品)； 所述野生型探针、突变型探针及对应的正向引物、反向引物混和液是Assaymix混和液[正、 反向引物(2ρπ 01/μ1)各Ιμ ，野生型探针、突变型探针(2ρπ 01/μ1)各1 μ 1]；所述提取血样DNA的试剂为外周血DNA提取试剂。本发明的MGB探针可用于体外检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关SLC26A4基因最常见突变IVS7-2A > G0本发明的试剂盒可用于体外检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关SLC26A4基因最常见突变IVS7-2A > G0在一个实施方案中，将引物和突变型MGB探针及野生型MGB探针同时加入实时定量PCR反应体系中。当体系中的模板变性后低温退火时，引物与MGB探针均与模板结合。 在引物的介导下，沿模板向前延伸至MGB探针结合处，Taq酶的5' -3'外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链MGB探针不受影响)将MGB探针5'端连接的荧光报告基团从MGB探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3'端非荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，也就是荧光信号的强度与相应PCR产物量成线性函数关系。 当模板为纯合突变型时，则突变型MGB探针会与之全匹配结合，PCR反应中5’端荧光报告基团不断被Taq酶切下，脱离3 ‘端非荧光淬灭基团的屏蔽，其荧光强度随PCR产物量的增多而不断增加。而野生型MGB探针因与之存在一个碱基的差别不能结合，故只检测到突变型MGB探针发射所对应的荧光信号；当模板为野生型时，野生型MGB探针会与模板全匹配结合，突变型MGB探针因与之存在一个碱基的差别不能结合，故只检测到野生型MGB探针发射所对应的荧光信号。当模板为杂合突变型时，突变型MGB探针与野生型MGB探针能分别与模板的突变等位基因和野生的等位基因相结合，故能同时检测到突变型MGB探针发射所对应的荧光信号和野生型MGB探针发射所对应的荧光信号。由于突变型和野生型MGB探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，因此根据所发射的不同颜色的荧光，即可分辨出荧光所对应的模板，也就检测出样品中是否含有常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因 SLC26A4的突变。当同时检测某一份标本是否含有上述最常见突变IVS7-2A > G时，将特定引物与探针的混合液Assay加入不同印pendorf管中，记录每一管在荧光定量PCR仪的通道位置，根据该通道检测到的荧光信号类别(FAM/VIC/FAM+VIC)来判断该模板是否含有某种或某几种突变。大前庭水管为常染色体隐性遗传性疾病，理论上，按双等位基因突变致聋的机理，当某一份模板含有某种纯合突变或复合杂合突变时，可以明确该模板对应的患者的分子病因为SLa6A4基因突变。因此，基于以上发明原理，本发明第一个发明目的是提供一种用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的一种最常见突变IVS7-2A > G的实时定量 MGB探针，其中MGB探针的5’端-3’端位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因 SLC26A4序歹Ij SEQ ID NO :1所示的相关区域中JVS7-2A > 6位点位于SLC26A4基因第7内含子末端距离第8外显子2个碱基处，野生型探针位于第2340;3bp-2342^p。在野生型探针片段的5’末端标记了荧光报告基团VIC，在3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB。突变型探针位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4序列SEQ ID NO :1所示的相关区域中IVS7-2A > G突变型探针位于第23404bp-2342^p。突变型探针片段的5，末端标记了荧光报告基团FAM，3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB。所述探针序列如下野生型探针(nt23403-nt23425:nt23419)5' VIC-TCTTTTGTTTTATTTC A GACGAT-MGB3'突变型探针(nt23404-nt23425:nt23419)5' FAM-CTTTTGTTTTATTTC G GACGAT-MGB3‘另外，在本领域中，TaqMan探针根据其3'端标记的淬灭基团的不同分为两种普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。普通的TaqMan探针的淬灭基团为荧光淬灭基团，而 MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高 10°C左右。为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。鉴于SLC26A4基因在中国人群中常见的IVS7-2A > 6突变位点及其周围碱基组合的特点，经过大量的摸索试验，本发明选用的TaqMan MGB探针。应当指出，5’端荧光报告基团及其相应的3’端非荧光淬灭基团可以是本领域中任何可用的荧光报告基团或非荧光淬灭基团，并且对于本领域技术人员而言，选择这些荧光报告基团及其相应的非荧光淬灭基团也是众所周知的常规技术。例如，荧光染料FAM和 VIC可以由其他荧光基团或染料代替，如HEX、JOE等。本发明第二个目的是提供与实时定量MGB探针共同使用的PCR正向引物和反向引物。所述正、反向引物位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4序列SEQ ID NO 1所示的相关区域中针对IVS7-2A > G突变的正向引物位于第23360bp_23391bp， 反向引物位于第2343m3p-23461bp。引物序列如下正向引物F(nt23360-nt23391)5' GTTGACAAACAAGGAATTATTAAAACCAATGG3'；反向引物R(nt23438_nt2346l)5 ‘ TCCAGGTTGGCTCCATATGAAATG3‘在一个具体实施方案中，可以使用各种生物软件程序设计上述引物。优选使用 Genetool Lite程序(美国Biotools公司提供的软件)来设计引物。本发明第三个发明目的提供上述MGB探针在制备用于诊断SLC26A4基因耳聋遗传疾病的试剂盒中的应用。在一个具体实施方案中，本发明人利用发明原理和设计的引物以及Taqman MGB探针提供用于体外检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的一种最常见突变IVS7-2A >的试剂盒，用于诊断SLC26A4基因相关的耳聋疾病，该试剂盒含有1.提取血样DNA的试剂；2. PCR扩增反应试剂混合液；3.用于扩增上述SL(^6A4基因最常见突变的野生型探针、突变型探针及对应的正向引物、反向引物的混合液；4.使用说明书。所述PCR扩增反应试剂混合液是2XMastermix混和液(ABI公司产品)；所述野生型探针、突变型探针及对应的正向引物、反向引物混和液是Assaymix混和液[正、反向引物 (2ρπι01/μ 1)各1μ 1，野生型探针、突变型探针(2ρπι01/μ 1)各1μ 1]；所述提取血样DNA的试剂为提取足根血DNA的溶液I，其主要成分为Chelex(ABI公司产品)。提取血样DNA的试剂还可以是外周血DNA提取试剂，选用市售产品(ABI公司产品)配套使用。应当指出， 术语“试剂盒”是还应当包括具有不同于试剂盒的名称，但与试剂盒具有类似结构或组分以及生物学功能的生物学产品。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述MGB探针或试剂盒在体外检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4的最常见突变IVS7-2A > G的用途。在另一个具体实施方案中，本发明还提供上述MGB探针或试剂盒在制备用于诊断常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的最常见突变IVS7-2A > G的产品 (包括药物、试剂、试剂盒等产品)中的用途。发明优点检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的最常见突变IVS7-2A > G的实时荧光定量MGB探针技术与现有技术相比有以下优点1.本发明检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的最常见突变(IVS7-2A>G)的实时荧光定量MGB探针技术，操作步骤和反应时间均较直接测序法有明显优势本发明仅需一次PCR过程即可检测出是否存在上述最常见突变IVS7-2A > G，与测序方法相比简省了 PCR后的琼脂糖凝胶电泳检测、PCR产物纯化、测序反应、测序反应产物纯化四个步骤，不仅减少了 PCR反应后处理带来的污染风险，还将检测一种突变的操作及反应时间由原来的最短12个小时缩短到1. 5小时。2.本发明两条MGB探针设计分别针对SLC26A4基因最常见突变IVS7-2A > G和野生型IVS7-2A，当上述突变的突变型探针与野生型探针共同存在于同一体系时，MGB探针只与序列与其完全匹配的模板结合，故特异性极强。对一份模板而言，如果检测到突变型MGB 探针的5’端荧光(如FAM荧光)，未检测到野生型MGB探针的5’端荧光(如VIC荧光)可以肯定为突变型；如果反之则可肯定为野生型，如果同时检测到野生型MGB探针的5’端荧光信号和突变型MGB探针的5’端荧光信号，则可判断为杂合型。此外，MGB探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性，赋予了本发明重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。3.本发明的结果判读在实时定量PCR仪器的分析软件支持下进行，具有自动化的优点，减少了人为的误差。
4.应用本发明提供的试剂盒或相关产品进行常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的最常见突变IVS7-2A > G，成本较其他常规检测方法更低。由此可见，本发明检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4常见突变的MGB探针及其试剂盒填补了国内相关检测领域的空白。其操作简便、判读直观、特异性强、敏感性高、价格低廉等优点为在全国范围内实行常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的最常见突变IVS7-2A > G的筛查提供了更为便利的条件，有助于从分子水平诊断大前庭水管，对产前诊断具有一定意义，在新生儿中开展相关检测有助于早期发现大前庭水管患儿，预防或延缓听力损失的发生。


图1是表示SLC26A4基因IVS7-2A > G杂合突变的曲线图，显示出FAM和VIC两条曲线。图2是表示SLC26A4基因IVS7-2A > G纯合突变的曲线图，仅显示出FAM—条曲线。图3是表示软件分析得到的直观结果的示意图。把一个位点的两个等位基因分别用不同颜色的荧光探针标记，FAM-AA纯合子、 VIC-GG纯合子、FAM-A/G与VIC-A/G杂合子和空白对照NTC。直接的结果——溶解曲线就是不同的纯合子会有不同颜色的曲线，杂合子两个颜色的曲线都有。
具体实施例方式下面将结合具体实施方式
对本发明做更详细地说明。1.检测样本从中国人民解放军总医院聋病分子诊断中心聋病资源库选取感音神经性耳聋患者100人，从被检个体提取外周全血DNA，作为检测样本。2.探针和引物设计根据已公开的SLC26A4 基因序列(SEQ ID NO :1，Ensembl Gene IDENSG0000009113)，使用Genetool Lite程序协助设计引物和Taqman探针序列，其中所述正、反向引物位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4 序列SEQ ID NO :1所示的相关区域中针对IVS7-2A > G突变的正向引物位于第 23360bp-23391bp，反向引物位于第23438bp_23461bp。引物序列如下正向引物F(nt23360-nt2339l)5' GTTGACAAACAAGGAATTATTAAAACCAATGG3'；反向引物R(nt23438_nt2346l)5 ‘ TCCAGGTTGGCTCCATATGAAATG3‘野生型探针位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4序列SEQ ID NO :1所示的相关区域中IVS7-2A>G位于SL(^6A4基因第7内含子末端距离第8外显子 2个碱基处，野生型探针位于第2340;3bp-2342^p ；突变型探针位于如常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4序列SEQ ID NO=I所示的相关区域中IVS7_2A > G突变型探针位于第23404bp-23425bp。
在所述野生型探针片段的5’末端标记了荧光报告基团VIC、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB ；在所述突变型探针片段的5’末端标记了荧光报告基团FAM、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB。所述野生型探针序列为野生型探针(nt23403-nt23425:nt23419)5' VIC-TCTTTTGTTTTATTTC A GACGAT-MGB3'突变型探针(nt23404-nt23425:nt23419)5' FAM-CTTTTGTTTTATTTC ■ GACGAT-MGB3‘3. PCR扩增反应
反应体系模板DNA (20ng/ul) 0. 5 μ 12 XMastermix (按比例混合的 dNTP、Taq 酶、Buffer)10 μ 1正、反向引物Qpmol/μ 1)各 Ιμ 野生型探针，突变型探针(2pmol/ μ 1)各1 μ 1加三蒸水至20 μ 1体积反应条件95°C变性10分钟，92°C变性15秒，60°C退火30秒，共进行40个循环，在每个循环退火时采集荧光。4.结果100名受检对象中以实时荧光定量iTaqman MGB探针法共检测到2人携带SLC26A4 基因IVS7-2A > G纯合突变，10人携带SLC26A4基因IVS7-2A > G杂合突变。5.实时定量Taqman探针法可靠性的检验所有被检测个体均经过直接测序方法进行验证，两种方法的吻合率为100%，说明使用本发明方法检测SLU6A4基因IVS7-2A > G突变的可靠性和稳定性。工业实用性本发明涉及一种用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4 的最常见突变IVS7-2A > G的实时荧光定量探针及其相关产品，可以更简单、快速、准确、减少污染且成本低廉的满足对SLa6A4基因常见突变进行广泛筛查的需要。
权利要求
1.用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLU6A4的常见突变IVS7-2A> G的实时荧光定量MGB探针，其特征在于野生型探针位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4序列SEQ ID NO 1所示的相关区域中IVS7_2A > G位于SLC26A4基因第7内含子末端距离第8外显子2个碱基处，野生型探针位于第2340;3bp-2342^p ；突变型探针位于如常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4序列SEQ ID N0:1所示的相关区域中IVS7-2A > G突变型探针位于第23404bp-23425bp。
2.根据权利要求1所述实时定量MGB探针，其特征在于在所述野生型探针片段的5’末端标记了荧光报告基团VIC、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB ；在所述突变型探针片段的5’末端标记了荧光报告基团FAM、3’末端标记了非荧光淬灭基团MGB。
3.根据权利要求1所述实时定量MGB探针，其特征在于所述野生型探针序列为5' VIC-TCTTTTGTTTTATTT( \ GACGAT-MGB3‘；所述突变型探针序列为5 ‘ FAM-CTTTTGTTTTATTTC (ι GACGAT-MGB3‘。其中，突变型及野生型探针的区别在于IVS7-2A > G突变野生型探针第23419bp碱基A被替换为G。
4.一种用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的常见突变IVS7-2A > G的试剂盒，该试剂盒包括(1)提取血样DNA的试剂；O) PCR扩增反应试剂混合液；(3)用于扩增所述SLC26A4基因常见突变的野生型MGB探针、突变型MGB探针及对应的正向引物、反向引物的混合液；(4)使用说明书。
5.权利要求4所述试剂盒，其特征在于所述正、反向引物位于常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4序列SEQ ID NO=I所示的相关区域中针对IVS7-2A > G突变的正向引物位于第23360bp-23391bp，反向引物位于第23438bp_23461bp。
6.权利要求4所述试剂盒，其特征在于所述正、反向引物的序列如下正向引物F :5' GTTGACAAACAAGGAATTATTAAAACCAATGG3'；反向引物R 5 ‘ TCCAGGTTGGCTCCATATGAAATG3‘。
7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于所述PCR扩增反应试剂混合液是2XMastermix混和液；所述野生型探针、突变型探针及对应的正向引物、反向引物混和液是Assaymix混和液；所述提取血样DNA的试剂为提取足根血DNA的溶液I，其主要成分为Chelex0
8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于所述PCR扩增反应试剂混合液是2XMastermix混和液；所述野生型探针、突变型探针及对应的正向引物、反向引物混和液是Assaymix混和液；所述提取血样DNA的试剂为外周血DNA提取试剂。
9.权利要求1至3中任一项所述MGB探针在体外检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关SL(^6A4基因常见突变IVS7-2A > G中的用途。
10.权利要求4至8中任一项所述试剂盒在体外检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关SL(^6A4基因常见突变IVS7-2A > G中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于检测常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的10种常见突变之一IVS7-2A＞G的实时荧光定量探针及包括所述探针的试剂盒。所述野生型探针位于第23403bp-23425bp；所述突变型探针位于第23404bp-23425bp。该发明设计针对所述突变位点的两条Taqman突变型和野生型探针和一对引物，本发明的探针特异性强、敏感性高，检测结果直观、准确可靠，适用于对常染色体隐性遗传大前庭水管相关耳聋基因SLC26A4的常见突变IVS7-2A＞G的大规模筛查和SLC26A4基因相关大前庭水管耳聋疾病的快速诊断。
文档编号C12Q1/68GK102559913SQ201210037749
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者康东洋, 戴朴, 程静, 袁永一 申请人:中国人民解放军总医院