专利名称：一种小麦抗白粉病基因分子标记引物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦抗白粉病基因分子的标记引物，属于植物生物技术领域，具体涉及一种可用于追踪小麦品系07鉴126中抗白粉病基因的分子标记引物及其用途。
背景技术：
小麦是世界上重要的粮食作物，在全世界各大农作物产区均有大面积种植。在我国，特别是北方地区冬小麦产量约占全国小麦总产量的56%左右。小麦的高产、稳产， 对解决世界性粮食危机具有重要意义。小麦白粉病是由专性寄生菌(Blumeria graminis DC.)所引起的世界性主要病害，在严重年份能导致小麦减产50%以上。将抗性基因导入到小麦中是最经济、有效、安全的防治方法。已被正式命名的抗白粉病主效基因有57个 (见参考文献薛飞等O009)小麦地方品种小白冬麦抗白粉病基因分子标记.作物学报.35(10) :1806-1811)。但是在育种中得到应用的抗性基因十分有限。由于病菌变异快，产生的新毒性小种克服了原有抗病基因的抗性；另外，携带某些抗性基因的小麦品种其农艺性差而不宜作为育种亲本直接用于生产实践(见参考文献詹海仙等O010)小麦抗白粉病基因来源及抗性评价的研究进展.中国农学通报，26 (10) :42-46)。目前，在我国对白粉病抗性最好的基因是Rii21。Rii21发现至今已经17年(见参考文献Chen et al. Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew. TAG,1995, (91) :1125-1128.),并且在生产中已经发现了对其具有毒性的菌株(见参考文献段霞瑜等(1998)小麦白粉病菌生理小种的鉴定与病菌毒性的检测.植物病理学报.25(1) 31-36.)。因此挖掘和利用新的抗性基因，对小麦的稳产具有重要实践意义。DNA分子标记技术因其具有多态性高、检测方便、快速、准确等特点，在农作物抗病遗传育种中发挥了极其重要的作用。一方面通过寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记，能够直接或间接地定位抗病基因和识别抗病基因的异同；另一方面，应用与抗病基因紧密连锁的分子标记，能够把多个基因聚合在同一个品种中，从而实现基因累加，提高抗病育种的使用年限；更为重要的是，应用分子标记能够在基因型水平上对抗病基因进行深入评价和鉴定，为分子标记辅助育种奠定基础(见参考文献邱永春和张书绅O004)小麦抗白粉病基因及其分子标记研究进展.麦类作物学报.24( :127 13 。本发明人团队选育获得一个抗白粉病的小麦品系“07鉴126”。该品系对我国目前白粉菌强优势生理小种E09、 Ell和其它多种小种表现免疫或高度抵抗。“07鉴126感”是“07鉴126”的感病近等基因系。利用“07鉴126”和“07鉴126感”进行杂交，构建了 Fl和F2分离群体。通过对其进行抗条锈病性鉴定及分子标记筛选，结果表明，“07鉴126”的白粉病抗性为显性单基因控制的全生育期抗性。(见参考文献杨宏O009)小麦抗白粉病新基因PmCDl和抗条锈病基因的鉴定及分子标记筛选博士论文.中国科学院研究生院.)
发明内容
本发明在现有研究基础上，进一步筛选和开发了与该白粉病基因紧密连锁的分子标记，并在不同遗传背景的分离群体中验证了标记的有效性。这为利用分子标记辅助选择转育抗白粉病基因，选育抗白粉病小麦新品种奠定基础。所解决的技术问题本发明目的在于提供基于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)的可用于追踪小麦品系07鉴126中抗白粉病基因的分子标记引物序列及其用途。本发明所提供的用于追踪小麦品系07鉴126中抗白粉病基因紧密连锁的分子标记引物为分子标记引物对)(cib9和分子标记引物对)(Cib5中的至少一对，其中所述的分子标记引物对)(cib9的脱氧核糖核苷酸序列为上游引物(F)5' -GTCTGCTCCAACTTCCTCT-3‘；下游引物(R)5' -CAGTTCAGCATCATCAATCG-3‘；使用该引物进行PCR扩增，仅能在抗病小麦品系07鉴定126的基因组DNA中扩增出一条I^bp的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列为GTCTGCTCCAACTTCCTCTGTCAGTACACCCATTTTCCTATCCTTTC
CTTCCTTGTTTCTTTCGTTCATCCATGAATCAATCGCTGAAGATCGATCGGAGATGGGGAGGCGGATTGAAATGAAACCGATTGATGATGCTGAACTG所述的分子标记引物对)(Cib5的脱氧核糖核苷酸引物序列为上游引物(F)5' -AGTCACTACAACGAGAGTTGG-3‘；下游引物(R)5' -TACAAGAGCTTCGTGCAGCAG-3‘。使用该引物进行PCR扩增，仅能在小麦品系07鉴定1 的基因组DNA中扩增出一条的DNA特异片段，该片段的脱氧核糖核酸序列为AGTCACTACAACGAGAGTTGGTGAGGTACACATCAATAACATGTATATCATATATACCTTGTTTTTCCTTGTTCGCCCCCTTCTTGTCTGCCAGATACTTGGGGCAGTTCCGCTTCCAGTGACCGTTCCCCTTGCAGTAG
AAACACTCAGTCTCTGGCTTGGGCCCAGCCTTGGGTTTCTTCACAGGATTAGCAACTGACTTGCCACCCTTCTTGGAGTTACCCTTCTTGCCCTTGCCATTTTTCTTGAAACTGGTGGTCTTATTGACCATCAACACTTGATGTTCTTTCTGTATGTCCGCCTCAGCAACTTTCAGCACCGCAAACACGTCGGCAATGGACTTATCCATCCCTTGCATGTTGTAATGCTGCACGAAGCTCTTGTA本发明还提供了上述分子标记引物在转育小麦品系07鉴126中抗白粉病基因以及在小麦白粉病分子标记辅助育种中的用途。本发明的有益效果为利用本发明公开的2个分子标记引物(即分子标记引物对 Xcib9和分子标记引物对kil^)或其中任何一个，可方便地采用PCR扩增检测，追踪小麦品系07鉴126中抗白粉病基因。在小麦育种过程中，利用本发明公开的分子标记，可在苗期白粉病未发病前对小麦育种材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择，提高育种效率，加速育种进程。
图1是引物对)(Cib5(图la)和引物对)(Cib9(图lb)在亲本材料及其F2代单株中的扩增结果。图 Ia 中 M :tans II K plus ；图 Ib 中 M :pBR322 DNA/MspI。泳道信息1 :07鉴126，2 川麦39 (四川高感白粉病品种)，3 12 :07鉴126与川麦39杂交F2单株。箭头示特异扩增片段。R 抗病；S:感病。在该群体的168个F2单株中，该特异片段与抗病单株共分离。图2是引物对)(Cib5(图2a)和引物对)(Cib9(图2b)在亲本材料及其F2代单株中的扩增结果。图 2a 中 M :tans II K plus ；图 2b 中 M :pBR322DNA/MspI。泳道信息1 :07鉴126，2 川农19 (四川高感白粉病品种)，3 12 :07鉴126与川农19杂交F2单株。箭头示特异扩展片段。R 抗病；S:感病。在该群体的234个F2单株中，特异片段与抗病单株共分离。图3是引物对)(Cib5(图3a)和引物对)(Cib9(图3b)在亲本材料及其F2代单株中的扩增结果。图 3a 中 M :tans II K plus ；图 3b 中 M :pBR322 DNA/MspI。泳道信息1 :07鉴126，2 :07鉴1 感(四川感白粉病品系，为07鉴1 感病近等基因系)，3 12 :07鉴1 与07鉴1 感杂交F2单株。箭头示特异扩增片段。R 抗病； S 感病。在该群体的281个F2单株中，特异片段与抗病单株共分离。
具体实施例方式以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。下述实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及实验材料均为常规生化试齐LU实施例1 引物)(Cib9的实施例(1)采用CTAB法提取小麦基因组DNA，提取步骤1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65°C的2 X CTAB提取液 CTAB ； 1. 4M NaCl, 0. IM Tris-HCl, pH 8. 0,0. IM EDTA，pH 8.0) 15ml，混勻。》65°C水浴30-45min，其间轻摇混勻。冷却至室温后加等体积的氯仿异戊醇 (24 1)，轻轻混勻至上清液呈牛奶状，4000rpm离心IOmin03)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。4)勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH 8. 0的 1 X TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100 μ g/ μ 1。5) IOOV恒定电压下，1 %琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。(2) PCR 扩增反应体系如下DNA dNTPs
Xcib9上游引物F Xcib9下游引物R Taq plus聚合酶 IOxPCR缓冲液
Mg
2+
ddH.O
100-150 ng 100 μΜ 5 pmol 5 pmol IU 2.5 μ 1.5 mM 加至终体积25 μ
① 94。C4分钟② 94。C30秒钟③58 0C30秒钟④ 72。C30秒钟重复②-■> 30个循环⑤ 72°C10分钟PCR 反应在 PTC-200 型 PCR 仪(MJ Research, U. S. A.)中进行。引物 Xcib9 扩增结果在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr Bis = 29 1)中电泳，然后银染显色。实施例2 引物)(Cib5的实施例(1)采用CTAB法提取小麦基因组DNA，提取步骤1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65°C的2 X CTAB提取液 CTAB ； 1. 4M NaCl, 0. IM Tris-HCl, pH 8. 0,0. IM EDTA，pH 8.0) 15ml，混勻。》65°C水浴30-45min，其间轻摇混勻。冷却至室温后加等体积的氯仿异戊醇 (24 1)，轻轻混勻至上清液呈牛奶状，4000rpm离心IOmin03)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。4)勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH 8. 0的 1 X TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100 μ g/ μ 1。5) IOOV恒定电压下，1 %琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。(2) PCR 扩增
反应体系如下DNA100-150 ng
dNTPs
Xcib5上游引物F Xcib5下游引物R Taq plus聚合酶 IOxPCR缓冲液 Mg2+ ddH20
100 μΜ 5 pmol 5 pmol IU 2.5 μ 1.5 mM 加至终体积25 μ
① 94。C4分钟② 94。C30秒钟③58 0C30秒钟④ 72。C30秒钟复②—④30个循环⑤ 72°C10分钟 PCR 反应在 PTC-200 型 PCR 仪(MJ Research, U. S. A.) 增产物在琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳40分钟后，
中进行。引物对)((3让5扩 EB染色检测。
权利要求
1.与小麦品系07鉴1 中抗白粉基因紧密连锁的分子标记引物，其特征在于所述标记引物是分子标记引物对)(cib9和分子标记引物对)(Cib5中的至少一对，其中所述的分子标记引物对)(cib9的脱氧核糖核苷酸引物序列为 上游引物(F) 5' -GTCTGCTCCAACTTCCTCT-3‘； 下游引物(R) 5' -CAGTTCAGCATCATCAATCG-3‘； 所述的分子标记引物对)(cib5的脱氧核糖核苷酸引物序列为 上游引物(F) 5' -AGTCACTACAACGAGAGTTGG-3‘； 下游引物(R) 5' -TACAAGAGCTTCGTGCAGCAG-3‘。
2.根据权利要求1所述的与小麦品系07鉴126中抗白粉基因紧密连锁的分子标记引物，其特征在于使用所述的分子标记引物对)Ccib9进行PCR扩增，在抗病小麦品系07鉴定 126中扩增出一条I^bp的特异片段；使用分子标记引物对)((3让5进行PCR扩增，在小麦品系07鉴定126中扩增出一条3^bp的特异片段。
3.权利要求1或2所述的分子标记引物在转育小麦品系07鉴126中抗白粉病基因以及在小麦白粉病分子标记辅助育种中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种小麦抗白粉病基因分子标记引物及其用途。本发明所提供的用于追踪小麦品系07鉴126中抗白粉病基因的分子标记引物为分子标记引物对Xcib9和分子标记引物对Xcib5中的至少一对，其中使用所述的分子标记引物对Xcib9进行PCR扩增，在抗病小麦品系07鉴定126中扩增出一条145bp的特异片段；使用分子标记引物对Xcib5进行PCR扩增，在小麦品系07鉴定126中扩增出一条385bp的特异片段。利用本发明公开的2个分子标记引物或其中任何一个，可方便地采用PCR扩增检测，追踪小麦品系07鉴126中抗白粉病基因。在小麦育种过程中，利用本发明公开的分子标记，可在苗期白粉病未发病前对小麦育种材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择，提高育种效率，加速育种进程。
文档编号C12N15/11GK102533750SQ201210037308
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者余懋群, 余水洋, 潘志芬, 邓光兵, 龙海 申请人:中国科学院成都生物研究所