专利名称：与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记及其用法的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种与小麦抗白粉病基因PmLK906 连锁的PCR标记及其用法。
背景技术：
小麦是世界上第二大粮食作物，是我国最重要的农作物，仅河南省每年播种面积 就达7000万亩以上。病害是造成小麦减产的主要原因之一，小麦锈病、纹枯病、赤霉病、黑 穗病、黄矮病等在黄淮麦区均有发生，而白粉病则是发病最早、持续时间最长、危害最严重 的病害，其发病范围广、危害严重，呈上升趋势。1990年白粉病发病面积达1800万ha2，约 占我国小麦面积的1/2，为1981年的3. 6倍。白粉病一般可造成13% 34%的产量损失， 严重年份减产高达30% 50%，并严重影响小麦的品质。从2009年4月初开始，白粉病在 河南省大面积流行，严重程度为近年罕见。而大面积推广品种均感白粉病，无法控制白粉病 流行。虽然药物对小麦白粉病有一定的防治作用，但存在以下不足，首先是药物防治不 能杜绝病害流行；第二是白粉病发病周期短，仅5 7天，在小麦白粉病流行期间要控制发 病程度需要喷洒药物3 4次；第三是药物防治增加成本，按3次施药，每亩要增加人力、药 物投入约50元；第四是药物防治影响小麦品质；第五是药物残留不利于环境保护和小麦的 绿色生产。2009年在豫北麦区调查结果表明，药物防治白粉病效果下降。目前，国际上已经正式命名了 39个小麦抗白粉病基因，但大多已丧失抗性，因 此，寻找有效抗病基因，培育抗病小麦新品种是小麦育种家的重要任务之一。小麦“兰 考90(6)，，是沈天民研究员选育的抗白粉病品系(王祖华，牛吉山，郭天财，张丽娜，沈天 民.2004.小麦主栽品种中的IRS分布和兰考90(6)系列白粉病新抗源.西北植物学 报，24:1216-1220)。我们的研究表明，“兰考90 (6) ”携带1对隐性抗白粉病基因，命名 为PmLK906，是目前我国少数有效的抗白粉病基因之一(牛吉山，王映红，周益林，段霞 瑜，沈天民.2006.普通小麦“兰考90(6)”品系白粉病抗性遗传.植物病理学报，36 (6) 528-533)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记及其用法。本发明的与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记，命名为Xgdm93_122，是由 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的一对引物扩增。与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记引物的用法以待测小麦基因DNA 作为模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作为引物1，以SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列 作为引物2进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有122bp片段特异带，能扩增出122bp片段 特异带的单株携带抗病基因PmLK906，不能扩增出122bp片段特异带的单株不携带抗病基因 PmLK906。所述PCR扩增反应体系PCR试剂组成为H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ LdNTP(25mmol/L) 1.6μ L引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ LTaq 酶(20u/yL) 0. 16 μ L模板DNA (50ng/ μ L) l.OyL总体积20.0yL，PCR扩增程序为先在94°C预变性4分钟；接35个循环的94°C变性30秒，50°C复 性45秒，72°C延伸30秒；最后在72°C延伸10分钟，4°C保存待检测。所述检测扩增产物方法为扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分 离，然后用银染法进行显色。本发明通过抗病品系“兰考90(6) ”与感病品种“中国春”杂交建立了 F3代分离群 体，用分池法建立抗、感DNA池，筛选出与抗病基因PmLK906连锁的分子标记Xgdm93_l22，发 展出能在不同小麦遗传背景下跟踪检测PmLK906的PCR分子标记辅助选择技术。本发明与现有技术相比较的优点及有益效果如下本发明提供了小麦抗白粉病基因PmLK906的PCR分子标记Xgdm93_122，该标记与 PmLK906基因紧密连锁，PmLK906基因是目前我国少数有效的抗白粉病基因之一，可以对抗 病基因PmLK906进行分子标记辅助选择，从而实现与其它有效抗病基因的累加，延长品种 的抗病性。利用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，有目标地将抗 病基因快速转入感病品种，而且可有目的地聚合多个有效抗白粉病基因，培育出具有稳定、 持久抗性的小麦新品种。
图1是引物gwm265扩增结果；其中，Pk是“兰考90(6)21_12”;PS是“中国春”;BK是纯合抗病DNA池；BS是纯合感 病DNA池；S是纯合感病植株；R是纯合抗病植株；H是杂合植株。图2引物gdm93扩增结果；其中，Pk是“兰考90 (6) 21-12” ;BE是纯合抗病DNA池；BS是纯合感病DNA池；S是 纯合感病植株；R是纯合抗病植株；H是杂合植株。图3分子标记Xgdm93-122与抗白粉病基因PmLK906的连锁关系。图4用标记Xgdm93_122检测回交转育抗病品系后代；其中，1 “兰考90(6)21-12” ；2 “周麦18” ；R 抗病植株；S 感病植株。
具体实施例方式实施例中未注明材料来源者均购自于国家种子资源库。1.本发明的与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记引物(Xgdm93_122)的筛选过程标记筛选基本过程是提取抗病池DNA和感病池DNA ；选取均勻分布在每条小麦染 色体上的120个SSR引物对，用这些引物在抗、感DNA池中扩增，初步获得具有多态性产物 的引物对；根据初筛结果提示，确定抗病基因所在的染色体及染色体臂。在此基础上再选用 更多的抗病基因所在染色体臂上的SSR引物进行筛选，获得抗病基因连锁标记。具体步骤 如下(1)植物材料感病亲本“中国春”，抗病亲本“兰考90(6)21-12”。配置杂交组合 “中国春” / “兰考90 (6) 21-12”，获得F1代、F2代分离群体和139个F2:3家系分离群体。同 时还配置了“兰考90 (6)” X “豫麦21”、“兰考90 (6)” X “濮麦9号”、“兰考90 (6) ” X “白 硬冬2号”等抗、感小麦杂交组合，获得了不同组合的F1代、F2代、F2:3家系，用于标记验证。(2)白粉病抗性鉴定采用离体叶段培养法接种小麦白粉病菌鉴定亲本及杂交后 代材料的抗病性。选用合适的培养皿，放置一层中性滤纸，用40mg/L的6-苄氨基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine 6-BA)充分湿润滤纸。待幼苗第一片叶完全展开后，截取3 4cm 叶段，按编号放在滤纸上。接种小麦白粉病菌，用本实验室通过连续单孢子堆分离纯化的 2个白粉病菌株，采用轻拂法人工接种，24小时后再重复接种1次。在光照培养箱内培养， 18°C，每天光照12小时，在感病对照充分发病的情况下(7 10天)按照0 4级反应型 记录白粉病发病情况，48小时后再重复观察一次。(3)抗、感病DNA池的构建在“中国春，，/ “兰考90 (6) 21_12”杂交F3株系中选择 10个纯合抗病家系构建抗病池，10个纯合感病家系构建感病池。(4)小麦叶片基因组DNA的提取参照Sambrook等(1989)编著的《Molecular cloning :a laboratory manual》(Sambrook L, Fritsch EF, Manniatis Τ.Molecular cloning :a laboratory manual. Second Edition, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York :1989.)进行小麦基因组 DNA 的提取。(5) PCR扩增程序PCR扩增反应在PE9600PCR仪上进行，首先在94°C预变性4分； 94°C变性30秒，根据每对引物的特征在50 60°C复性45秒，72°C延伸30秒，35个循环； 72°C延伸10分。取出置于4°C冰箱待检测。(6)扩增产物检测采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术检测扩增产物。(7)多态性标记的筛选选取均勻分布在每条小麦染色体上的120个SSR引物对， 在抗、感DNA池中扩增，初步获得具有多态性产物的引物对gwm265(图1)。根据初筛结果提 示，抗病基因在2AL染色体臂上。再选用小麦遗传图中gwm265附近的SSR引物进行扩增筛 选，发现gdm93能扩增出多态带。在抗、感亲本和抗、感DNA池中扩增出一致多态性条带的 引物gwm265和gdm93，再在139个F3分离群体中进行扩增，计算连锁遗传距离。最终证明 g碰265(图1)和gdm93(图2)引物对扩增的条带与PmLK906基因紧密连锁(表1)。(8)连锁分析采用Joinmap3. 0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析， 计算目的基因与分子标记的遗传距离(图3)。(9)获得可以跟踪PmLK906的共显性分子标记Xgdm93_122，是由SEQ IDNo. 1所示 的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的一对引物扩增。表IF3分离群体的白粉病反应型和gwm265and gdm93引物扩增结果反应型 品系数
Xgdm93.
权利要求
一个与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记，命名为Xgdm93 122，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的一对引物扩增。
2.权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记引物的用法，其特 征在于以待测小麦基因组DNA作为模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作为引物1， 以SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列作为引物2进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有122bp 片段特异带，能扩增出122bp片段特异带的单株携带抗病基因PmLK906，不能扩增出122bp 片段特异带的单株不携带抗病基因PmLK906。
3.根据权利要求2所述的与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记引物的用法， 其特征在于所述PCR扩增反应体系PCR试剂组成为H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ L dNTP(25mmol/L) 1. 6μ L 引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L 引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ L Taq 酶(20u/ μ L) 0. 16 μ L 模板 DNA (50ng/ μ L) l.OyL 总体积20. OyL，PCR扩增程序为先在94°C预变性4分钟；接35个循环的94°C变性30秒，50°C复性45 秒，72°C延伸30秒；最后在72°C延伸10分钟，4°C保存待检测。
4.根据权利要求2或3所述的与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记引物的用 法，其特征在于所述检测扩增产物方法为扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上 进行分离，然后用银染法进行显色。
全文摘要
一个与小麦抗白粉病基因PmLK906连锁的PCR标记及其用法，属于植物分子育种技术领域。标记命名为Xgdm93-122，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的一对引物扩增。用法为以待测小麦基因组DNA作为模板，以Xgdm93-122的引物进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有122bp片段特异带，能扩增出122bp片段特异带的单株携带抗病基因PmLK906，不能扩增出122bp片段特异带的单株不携带抗病基因PmLK906。所述的分子标记可以在不同小麦遗传背景中准确检测PmLK906基因的存在，该技术可以加快PmLK906基因向小麦生产品种中的转育速度。
文档编号C12Q1/68GK101955986SQ20091006542
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者倪永静, 尹钧, 牛吉山, 王保勤, 王正阳 申请人:河南农业大学