专利名称：与小麦Brock抗白粉病基因紧密连锁的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与白粉病抗性基因连锁的AFLP分子标记及其所用引物。
背景技术：
由专性寄生真菌小麦白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)引起的小麦白粉病是危害小麦生产的主要病害之一。近年来，随着矮秆、半矮秆小麦品种的推广，田间栽培密度的增加以及水肥条件的改善，该病害在我国南北麦区危害程度日趋严重，成为当前小麦高产、稳产的主要障碍因素之一。1990年小麦白粉病在全国39％的小麦种植区流行，造成产量损失达4亿公斤。目前，小麦白粉病已经成为威胁我国小麦生产的常见病害之一，所以对该病的防治刻不容缓。
尽管实践中可以采取化学药剂来防治小麦白粉病，但是，培育抗病品种是最为安全、经济、有效的措施。70年代初，我国引入具1B/1R的小麦衍生品种做为抗源，曾经一度有90％以上的品种携有Pm8抗白粉病基因，由于抗性基因的单一性，结果导致小麦白粉病在全国范围内多次大流行。此后，我国小麦育种家致力于多方引入和转育具有新抗病基因的品种，但由于有些抗病基因在不同遗传背景中表达不一致，致使真正用于生产实际的抗白粉病基因很少，在育种中应用的仅有Pm4a、Pm4b、Pm6、Pm8及其组合Pm2+6、Pm2+4等，再加上小麦白粉病菌具有群体大，适应范围广，生理小种多且毒力变异快等特点，使得许多花费多年时间培育的抗病品种(系)刚应用不久，有的甚至还未应用，便由于病菌群体毒性的变化而丧失了抗性。“九五”期间，Pm4a、Pm6在全国各地均已开始丧失抗性。二十世纪末，北京地区推出了我国第一个自行转育成功并定名的Pm21基因。目前，我国小麦育种项目中较为广泛地利用了该基因，应引起警惕，防止抗源单一现象再次发生，有效地控制白粉病的流行。为此就必须大力挖掘和利用新抗源并不断地进行抗病基因的累加，培育抗性持久的小麦品种。
为实现上述任务，挖掘新抗源，以往，育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，但这类标记具有工作量大、标记数量少、易受环境影响等缺点。随着分子生物学的发展，一类基于DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于小麦抗白粉病研究。应用分子标记，可以免除传统育种中繁重的工作程序，跟踪、检测外源基因，还可以把多个抗白粉病基因聚合到同一优良品种中，获得持久抗性。此外，将基因精确定位于高密度的分子图谱上，以紧密连锁的分子标记为起点，应用染色体步行(Chromosome Walking)等方法，逐渐逼近目标基因，最终克隆该基因。实践证明DNA分子标记是进行抗病性鉴定和辅助育种研究的重要工具。
小麦对白粉病的抗性主要由主效基因控制，早期基因符号为M1，正式命名的基因符号为Pm(powdery mildew)。自从1930年澳大利亚学者首次报道了澳大利亚春小麦品种Thew携带一个显性抗白粉病基因以来，至今已鉴定出30个Pm基因位点，除Pm29外，其余主效基因已被定位到染色体或染色体臂上。此外尚有抗病基因未被正式命名，临时以M1表示。自从90年代初开展小麦抗白粉病基因分子标记研究以来，已有接近一半的抗病基因找到了相应的分子标记，但仍有很多抗白粉病的未知基因，尚未筛选出分子标记。因此，继续用分子标记的方法，筛选与抗白粉病基因相关的标记，在农业上有重要应用价值。
栽培小麦Brock，由中国农业大学杨作民教授从英国引进，强抗白粉病。用白粉病菌15号生理小种感染Brock、京411及由它们配制的近等基因系，2周后发现Brock及近等基因系抗性单株叶片上没有任何菌斑出现，表现强抗白粉病，而轮回亲本京411严重染菌。据报道，Brock中含有Pm2(Liu Z Y，Sun Q X，Ni Z F，et al.1999.Development of SCAR markers linked to the Pm21 gene conferring resistance topowdery mildew in common wheat.Plant Breeding，118215-219)，但是，生产上含有pm2的小麦品种对白粉病菌大多已经丧失抗性(李隆业，黄元江.小麦白粉病已知抗性基因的效应及评价.中国农业科学，1990，23(3)20-26)。为了证实Brock中Pm2的抗性是否存在，我们曾经用华北地区流行的白粉病菌优势种15号生理小种感染含有Pm2包括Brock在内的11个小麦栽培种，结果发现，除Brock具有强抗特性外，其余10个栽培种为中等程度甚至高度感染白粉病，因而，我们推测，栽培小麦Brock的抗性并非来自于Pm2，而是来自于Pm2以外的另一个强抗白粉病的新基因(见参考文献Wang Zhenying，Zhao Pei，Chen Hong，et al.2005.Identifiation ofRAPD markers and development of SCAR msrkers linked to a powdery mildew resistance gene，and their location on chromosome in wheat cultivar Brock.Plant Production Science.8(5)578-585)。我们前期的研究表明，Brock中强抗白粉病的新基因为显性单基因遗传，为抗白粉病的主效基因(见参考文献ZhenyingWang，Qi Zheng，Yongkang Peng，et al.，2004.Identification of Random Amplified Polymorphic DNA and Simple Seqence RepeatMarkers Linked to Powdery Mildew resistance in Common wheat cultivar Brock.PlantProduction Science.7(3)318-322)。利用抗源供体亲本Brock、近等基因系及轮回亲本京411及Brock×京411的F2分离抗、感单株为材料，用RAPD、SSR、SCAR分子标记方法，找到Brock中与抗白粉病目的基因连锁的分子标记OPP15917、S2092972、及Xgwm114120，它们与Brock中目的基因的遗传距离分别为6.0cM、4.9cM和9.3cM(见参考文献Wang Zhenying，Zhao Pei，Chen Hong，et al.2005.Identificationof RAPD markers and development of SCAR markers linked to a powdery mildew resistance gene，and their location on chromosome in wheat cultivar Brock.Plant Production Science.8(5)578-585)。在上述研究的基础上，用多态性更高的AFLP分子标记技术，进一步寻找更加逼近Brock中未知抗白粉病基因的分子标记和引物，筛选比现有抗白粉病基因的RAPD、SSR、SCAR标记更贴近目标基因的分子标记，以利于小麦分子标记辅助选择育种及抗病基因的图位克隆。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供基于PCR的与普通小麦Brock中抗白粉病未知基因连锁的AFLP标记获得的方法和引物组合以及该标记的核苷酸序列。以抗白粉病小麦栽培种Brock为供体亲本，品质优良但对白粉病敏感的小麦品种京411为轮回亲本，通过杂交、回交和自交后配制抗白粉病特性稳定的近等基因系(NILs)，用扩增片段长度多态性(AFLP)分析方法，对Brock、京411和近等基因系进行引物筛选，引物组合P7/M14在上述材料中表现出扩增产物的多态性，获得与抗白粉病基因相连锁的AFLP标记P7/M14227，该引物组合在所有的抗性单株中都能检测到特征带，可以用于小麦白粉病辅助选择育种。
技术方案与小麦Brock抗白粉病基因紧密连锁的分子标记P7/M14227，是应用AFLP分子标记技术采用下述方法得到的以小麦栽培种Brock为抗性供体亲本，品质优良但对白粉病敏感的小麦品种京411为轮回亲本，通过杂交、回交和自交后配制抗白粉病特性稳定的近等基因系Brock/015京4117(NILs)，以Brock、京411和近等基因系为材料，用苯酚-氯仿方法分别提取它们的总体DNA，采用AFLP分子标记技术，用225对引物筛选与小麦白粉病抗性相关的分子标记，筛选出一个AFLP分子标记P7/M14227，经过连锁性鉴定，该标记与小麦抗白粉病基因紧密连锁，与抗性基因的遗传距离为1.9cM；筛选P7/M14227标记所用AFLP引物序列为P7CACTGCGTACATGCAGAGC
M14GATGAGTCCTGAGTAAACCP7/M14227的碱基序列为GATGAGTCCTGAGTAAACCCTGAGAATGCAGAGCACGTAAATAAATATCGACGTTCAAATCCCTGAAATCCATACCCTGACCTCCCTGATCCCGGTCGTTTCTGACCTTTAGGTTGTATCCAAACAGGGGGATTTTTACCTGGGCAGAGAACGGACGGGATCAAGGTGAGTCATCTACATGCAGGTGGGTCTCATGGTCTCCTGGATTGCTCTGCATGTACGCAGTC。
采用AFLP分子标记方法，筛选与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记，其的具体做法是以Brock、京411及近等基因系的基因组DNA为模板，通过Pst I和Mse I双酶切后与接头引物在T4 DNA连接酶的作用下连接，连接产物作为AFLP分析用模板。本发明共选择225对引物组合在3个供试材料中进行AFLP分析，结果发现有28个引物组合出现扩增产物多态性，连锁性鉴定分析发现，只有引物组合P7/M14的扩增片段P7/M14227与抗白粉病基因有连锁关系，其与抗白粉病基因之间的遗传距离为1.9cM。将P7/M14227克隆并测序，发现其长227bp。
有益效果白粉病是影响小麦生产的一种严重病害。本发明是利用分子标记方法得到一个新的与白粉病抗性基因连锁的AFLP分子标记。利用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，而且能够有目标地将抗病基因在实验室内选择得到，还可以有目的地聚合多个抗白粉病基因、培育出具有稳定抗性的小麦新品种，同时也可利用这个新白粉病抗性基因的分子标记克隆抗白粉病基因，对于进一步了解小麦抗白粉病的分子遗传学机理有积极意义。因此，本研究结果在小麦育种实践及抗病理论研究上都很有价值。其优点具体归纳如下1、本发明的与白粉病抗性基因连锁的分子标记，是在对华北地区白粉病菌免疫的小麦品种Brock及其抗性稳定的杂交后代单株中获得的新的标记，对15号生理小种均有抗性，而且稳定存在，可以用于小麦白粉病品种鉴定和小麦抗病后代的辅助选择育种。
2、本研究所用材料为对15号生理小种(为混合型生理小种，为华北地区流行的多种白粉病病菌)免疫的小麦品种，对华北地区白粉病菌具有比较广普的抗性。因此，根据所得分子标记有望克隆到新的白粉病抗性基因。
3、本发明用多态性更高的AFLP分子标记技术，得到的分子标记P7/M14227与抗白粉病新基因间的遗传距离为1.9Cm，比以前筛选到的该抗白粉病基因的RAPD、SSR、SCAR标记更贴近目标基因，更有可能用于生产实践。
图1京411、抗性单株、Brock基因组DNA电泳图；图2部分引物组合在京411、抗性单株、Brock中的AFLP扩增产物电泳图谱；图3P7/M14227与抗白粉病基因连锁性分析谱带图；图4P7/M14227核苷酸序列；其中图1-4中符号分别表示为1 感病亲本京411；2抗性单株；3抗病亲本Brock；2A引物组合P7/M14扩增产物电泳图谱；2B引物组合P13/M13扩增产物电泳图谱；2C引物组合P3/M10扩增产物电泳图谱；2D引物组合P6/M10扩增产物电泳图谱；2E引物组合P9/M5扩增产物电泳图谱MλDNA Hind III/EcoR I Markers；R杂交后代抗病单株；S没有特异带的杂交后代感病单株；S*有特异带，但表型为感病的杂交后代单株；
具体实施例方式(结合附图具体说明)实施例1·近等基因系的配制该分子标记实验的抗白粉病供体基因为Brock，是一种对白粉病具强抗特性的小麦栽培种，京411是优良小麦品种，015为优良品系。本研究实验材料的获得是通过Brock与015杂交，F1与京411杂交，所得后代与京411连续回交7代自交1代后得到的一个抗白粉病特性稳定品系，这个品系在连续回交过程中，每回交后代是通过白粉病菌的胁迫后选择得到的。
·基因组DNA的分离分别取Brock、京411和上述近等基因系0.2g黄化幼苗叶片，于液氮中研磨，尽量呈粉末，迅速加入2毫升提取Buffer(50mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；50mM NaCl)，轻轻混合，65℃温浴15min，其间颠倒混匀2-3次。0℃冰浴10分钟，0-4℃，3000转/分离心15分钟，轻取上清，加入到一新管中，加等体积Tris-HCl(pH 8.0)饱和酚，轻轻混合。0-4℃，3000转/分离心10分钟，取上清，加入等体积酚、氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提，轻轻混匀。0-4℃，3000转/分离心10分钟，取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提，轻轻混匀。0-4℃，3000转/分，离心10分钟，取上清，加2倍体积冷乙醇，-20℃沉淀1小时以上。0-4℃，12000转/分，离心20分钟，弃上清，75％乙醇0-4℃短暂离心，洗沉淀2次，晾干，溶于100μl TE(pH8.0)。加1μl RNase(10mg/ml)，37℃保温1小时，以除去样品中的RNA。加等体积酚、氯仿，抽提一次，0-4℃，3000转/分离心10分钟。取上清，加等体积仿，抽提一次，0-4℃，3000转/分离心10分钟。取上清，加两倍体积冷乙醇，-20℃沉淀2小时以上。0-4℃，12000转/分，离心20分钟。弃上清，75％乙醇洗涤产物，0-4℃短暂离心，洗沉淀2次，晾干，溶于50μl TE(pH8.0)中。分别用紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性见图1。
·标记的筛选AFLP分析参照Vos(Vos，P.，R.Hogers，M.Bleeker，M.Reijans，T.van de Lee，M.Hornes，A.Frijters，J.Pot，J.Peleman，M.Kuiper，M.Zabeau.AFLPA new technique for DNAfingerprinting.Nucleic Acids Res，1995，214407-4414)的方法进行。所用接头和引物见表1。
表1 AFLP分析所用接头和引物
注下画线部分为选择碱基，N为任意碱基A、G、T、C1)基因组DNA双酶切及接头连接100×BSA 0.2μl，NEB buffer 4.0μl，Pst I(20U/μl)0.25μl，Mse I(10U/μl)0.5μl，Pst I接头(5pM)1.0μl，Mse I接头(50pM)1.0μl，T4 DNA ligase 0.4μl，10×T4 buffer 2.0μl，DNA(100ng/μl)5.0μl，ddH2O补齐40μl。37℃条件下保温8个小时。
2)预扩增反应体系为25μL，内含1μL连接产物，0.6pmol/L引物，10×PCR缓冲液2.5μL，0.2mmol/L的dNTPs，1U Taq聚合酶。PCR扩增程序为94℃ 2min；94℃ 35S，56℃ 35S，72℃ 60S，30个循环；72℃ 5min。预扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，稀释20倍保存备用。
3)选择性扩增稀释的预扩增产物为选择性扩增模板进行AFLP分析。选择性扩增体积为20μL，AFLP选扩体系Pst I接头引物(50ng/μL)0.8μL，MseI接头引物(50ng/μL)0.8μL，10×Buffer 2.0μL，MgCl2(25mM)1.2μL，dNTP(10mM)0.45μL，TaqE(5U/μL)0.2μL，模板DNA 2.0μL，ddH2O补齐20μL。
PCR扩增采用递降式方法，其程序为94℃ 2min94℃ 35S，65℃ 35S，72℃ 30S，以后每个循环退火温度降低0.7℃，共12个循环；然后94℃ 35S，56℃ 35S，72℃，60S，30个循环；最后72℃ 5min。扩增在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行。
4)扩增产物的检测扩增产物8μL加等量loading Buffer(98％甲酰胺；10mMEDTA pH8.0；0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青)，95℃变性5min，立即于冰浴待用。用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(含6mol/L尿素)电泳分离，银染法显示电泳图谱。
5)P7/M14227标记的筛选与连锁性鉴定及遗传距离计算以Brock、京411及近等基因系为材料，在表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子筛选， 结果发现有28个引物组合出现扩增产物多态性(图2.A、B、C、D、E)。为检测上述筛选出的28个引物组合产生的多态性条带与抗白粉病基因间的连锁关系，我们用上述28个引物组合对Brock与京411杂交、F1代自交后分离得到79个抗病单株和27个感病单株进行PCR扩增，其所采用的PCR扩增体系为Pst I接头引物(50ng/μL)0.8μL，Mse I接头引物(50ng/μL)0.8μL，10×Buffer 2.0μL，MgCl2(25mM)1.2μL，dNTP(10mM)0.45μL，TaqE(5U/μL)0.2μL，模板DNA2.0μL，ddH2O补齐20μL。PCR扩增反应程序为94℃ 2min；94℃ 35S，65℃ 35S，72℃ 30S，以后每个循环退火温度降低0.7℃，共12个循环；然后94℃ 35S，56℃ 35S，72℃，60S，30个循环；最后72℃ 5min。扩增在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行。结果发现，图2.B，2C，2D，2E所显示的扩增产物多态性与抗白粉病特性无关，只有引物组合P7/M14产生的227bp特异片段与抗病基因间具有较强连锁性(见图2.A)。在27株感病株中有2株出现了特异条带，25株未出现特异条带；79株抗病株中均出现特异条带(见图3)。将该片段定名为P7/M14227。用MAPMAKER3.0软件计算，该标记与Brock中抗白粉病基因的遗传距离为1.9cM。P7/M14227可作为Brock中抗白粉病未知基因的分子标记。
表2 AFLP标记的引物组合
·P7/M14227的克隆与测序主要参阅pGEM-T easy Vector System(Promega公司)说明书按下列顺序在冰上加入以下成分建立连接反应2×Buffer 5μl，pGEM-Teasy vector(50mg/ml)1μl，加A尾的PCR产物2μl，T4连接酶(3U/μl)1μl，无菌双蒸H2O补齐10μl；轻轻吹吸混匀，4℃连接过夜。将连接产物2μl转化到100μl感受态细胞DH5α中，筛选出阳性克隆子，委托上海生工生物工程公司测序。其结果AFLP分子标记P7/M14227实际长度为227bp(见图4)。
SEQUENCE LISTING<110>天津师范大学<120>与小麦Broek抗白粉病基因紧密连锁的分子标记<130>060518<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1cactgcgtac atgcagagc 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2gatgagtcct gagtaaacc 19<210>3<211>227<212>DNA<213>小麦Brock(Triticum aestivum)
<400>3gatgagtcct gagtaaaccc tgagaatgca gagcacgtaa ataaatatcg acgttcaaat60ccctgaaatc cataccctga cctccctgat cccggtcgtt tctgaccttt aggttgtatc120caaacagggg gatttttacc tgggcagaga acggacggga tcaaggtgag tcatctacat180gcaggtgggt ctcatggtct cctggattgc tctgcatgta cgcagtc 22权利要求
1.与小麦Brock抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，其特征在于所述的分子标记P7/M14227，是应用AFLP分子标记技术采用下述方法得到的以小麦栽培种Brock为抗性供体亲本，品质优良但对白粉病敏感的小麦品种京411为轮回亲本，通过杂交、回交和自交后配制抗白粉病特性稳定的近等基因系Brock/015//京4117(NILs)，以Brock、京411和近等基因系为材料，用苯酚-氯仿方法分别提取它们的总体DNA，采用AFLP分子标记技术，用225对引物筛选与小麦白粉病抗性相关的分子标记，筛选出一个AFLP分子标记P7/M14227，经过连锁性鉴定，该标记与小麦抗白粉病基因紧密连锁，与抗性基因的遗传距离为1.9cM；筛选P7/M14227标记所用AFLP引物序列为P7CACTGCGTACATGCAGAGCM14GATGAGTCCTGAGTAAACC
2.按照权利要求1所述的与小麦Brock抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，其特征在于P7/M14227的碱基序列为GATGAGTCCTGAGTAAACCCTGAGAATGCAGAGCACGTAAATAAATATCGACGTTCAAATCCCTGAAATCCATACCCTGACCTCCCTGATCCCGGTCGTTTCTGACCTTTAGGTTGTATCCAAACAGGGGGATTTTTACCTGGGCAGAGAACGGACGGGATCAAGGTGAGTCATCTACATGCAGGTGGGTCTCATGGTCTCCTGGATTGCTCTGCATGTACGCAGTC。
全文摘要
与小麦Brock抗白粉病基因紧密连锁的分子标记，属于农业生物工程，涉及与白粉病抗性基因连锁的AFLP分子标记及所用引物。本发明为寻找更逼近Brock抗白粉病未知基因新的分子标记，我们以抗病小麦Brock和感病小麦京411及Brock与京411配制的近等基因系为材料，用225个AFLP引物组合进行标记筛选，其中引物组合P7/M14产生的227bp特异片段与抗病基因间具有较强连锁性，定名为P7/M1文档编号C12N15/65GK1884578SQ20061001380
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月23日 优先权日2006年5月23日
发明者王振英, 彭永康, 陈宏 申请人:天津师范大学