专利名称：小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD标记研究的制作方法
技术领域：
本发明小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD标记研究，利用集群分离分析法(BSA)对 抗性基因Pm23进行RAPD分析，以期找到与Pm23紧密连锁的RAPD标记，应用于分子标记辅 助选择育种实践中，属于作物遗传育种学领域。
背景技术：
小麦抗白粉病基因Pm23是在普通小麦栽培品种中发现的，该基因对当前我国各 大麦区流行的小麦白粉菌优势小种表现免疫，并且因其载体品种为普通栽培小麦，没有不 良基因的连锁累赘，所以Pm23是小麦抗白粉病育种中不可多得的一个优质抗源。该基因已 被定位到5A染色体上，但到目前为止，还没能找到与之连锁的分子标记，这在一定程度上 限制了它在抗病育种中的应用。
发明内容
本研究的主要目的是用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行RAPD和SSR 分析，以期找到与Pm23紧密连锁的RAPD标记或SSR标记，应用于分子标记辅助选择育种实 践中。 小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD标记研究
1.材料与方法
1. 1实验材料 以带有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小 麦品种Chancellor为感病亲本(同时也兼作感病对照)，配制杂交组合Pm23 X Chancellor， ^代自交，获得101株&单株作为分离群体，用于分子标记的筛选和遗传连锁分析。
实验所用材料小麦品系Pm23、 Chancellor由中国国家小麦改良中心泰安分中心 保存提供。 1. 2白粉病抗性接种及鉴定 用当前小麦白粉菌的优势小种NO. 15号小种对抗、感亲本、所有的&单株进行 两次接种， 一次在三叶期(盛宝钦等，植物保护，1988， 1 :49-50)， 一次在开花后灌浆期 (CI匪TY)，在感病对照充分发病的条件下，调查抗、感分离情况，每隔2-3天重复调查一次， 病级鉴定按盛宝钦等(1988)提出的反应型分级标准进行。
1.3基因组DNA的提取DNA的提取采用Devos(Theor.A卯l.Genet，1992，84 :567-572)的酚-氯仿提取
法，稍有改动，以适于1. 5ml离心管提取。 1. 4BSA(Bulked Segregate Analysis)分池 按Michelmore等(1991)提出的分离群体集群分析法(BSA法)，建立抗病基因池 和感病基因池，对在双亲间表现多态性的引物进行进一步的筛选。 抗病池和感病池将F2群体的单株分别提取总基因组DNA，随机选取10个抗病单株将其DNA等量混合，随机选取10个感病单株将其DNA等量混合，分别建立抗病池和感病 池。 1.5SSR分析 1.5. 1SSR反应体系扩增程序 小麦SSR引物共97个，其中18个位于5A染色体上，根据Roder等(Mo 1. Gen.
Genet. 1998,246 :327-333) 、 Gupta等(TheorAppl. Genet，2002， 105 :413-422)公布的序列 合成。 SSR-PCR反应体系如下 H20 15. 8 ill 10 X Buffer 2. 5 ii 1 1. 5. 2. SSR扩增程序 扩增反应在Thermal Cycler 9600PCR上进行。先进行一次预扩增95"C变性5分 钟，然后进行30个循环的扩增，每个循环95t:变性1分钟，55t:(复性温度因引物不同而
^)复性l分钟，72t:延伸l分钟，最后72t:延伸5分钟。扩增结束后，置于4t:保存待检 1. 5. 3.扩增产物的检测 扩增产物在1. 6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳，印染显色，然后用 TanonGis-2010型凝胶成像系统照相观察。 1. 5. 4.硝酸银染色步骤 (1)电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3分钟。 (2)用去离子水快速冲洗2-3次，每次30-40秒。 (3)于银然液中染色5-7分钟。 (4)用水快速冲洗(10秒钟左右)，不超过20秒钟。 (5)放入显影液中显影至第一条带出现( 一般以泳道出现为准)。 (6)最后放入停影液中停影。 1. 5. 5.所用试剂的配制 1. 6%聚丙烯酰胺凝胶的配方( 一块板用量30ml) 去离子水 19. 5ml 5XTBE缓冲液 6ml 39 : l(丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺) 4.5ml(39g+lg+100ml水)用之前先过滤。 TEMED 16 ii 1 过硫酸氨(0. lg/ml)160 iil
总体积(Total)
4
其中，后两者是催化剂，用量可随温度升高酌情减少。
固定液40ml乙醇+360ml水+2ml乙酸
印染液0. 6克AgN03+300ml水 S卩2% AgN03 显影液3% NaOH(12gNaOH+400ml水+2ml甲醛)，甲醛用时现用现加 [OO51 ]停影液10 %乙酸(30ml乙酸+270ml水) 其中，固定液和印染液可以重复利用，前者2次，后者可用3次。 电泳电压一般掌握在低于120V. 1. 6RAPD-PCR分析 1. 6. 1引物来源及引物的稀释 用于扩增的350个十碱基随机引物中，230个(S1-S230)购自上海生物工程公司 (Sangon) ， 120个(0PA1_20、 0PE1_20、 0PF1_20、 0PH1_20、 0PT1-20和0PV1-20)购自北京鼎 国生物工程公司。S系列引物为0. 20D/管，每管加入200 超纯水稀释。 1. 6. 2RAPD-PCR反应体系 10 XPCR Buffer 2. 5 ii 1 Mg2+ (25mM) 2 ii 1 d證(2.5mM) 1.5iU TaqE(5U/iU) 0. 25 ii 1 Primer pair (5 li M) 1 li 1 DNA(30ng/ii 1) 2 ii 1 ddH20 15. 75 ill _ 总体积(Total) 25 ii 1 附10XPCR Buffer Tris(pH8.3) lOOmM KC1 500mM MgCl2 15mM 1. 6. 3RAPD-PCR反应程序 PCR反应在Thermal Cycler 9600PCR上进行。先进行一次预扩增94°C 3分钟、 36 °C 1分钟、72 °C 2分钟，然后进行45个循环的扩增，每个循环94°C 15秒、36 °C 30秒、72 °C 1 分钟，最后72t:延伸4分钟。扩增结束后4t:保存待检测。
1.6. 4扩增产物的检测 扩增产物中加入适量溴酚兰(产物/溴酚兰4V/1V)，混匀，用1. 4%琼脂糖凝胶电 泳分离(电泳电压5V/cm)，凝胶经EB染色后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察。
1. 7数据分析 1.根据最大似然法计算重组率(莫惠栋，1984)，并按Kosambi (Ann Eugen. 1944， 12 :172-175)系数将重组率转化为CentiMorgan(cM)。
2.结果与分析 2. 1小麦抗白粉病基因Pm23的SSR分析 由于Pm23已被定位到5A染色体上，在实验的早期，我们首先用位于5A上的18对 SSR引物在抗、感亲本和抗、感池间进行了扩增，检测结果表明，这18个引物在抗、感池间均
5不表现多态性。随后，我们又对79对非5A染色体的SSR引物进行筛选，亦未发现在抗、感 池间表现多态性的引物。 2. 2小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD分析 本研究采用350个随机单引物对抗病亲本Pm23和感病亲本Chancellor进行分 析。除引物S186， S210， S212， S219， 0PV05没有扩增产物外，其余345个引物都能在抗感亲本 间扩增出比较清晰的条带，多的可达8条带，平均4. 5条，扩增片断长度在250bp 2200bp 之间。经4次以上重复扩增检测，其中6个引物能在抗感亲本间稳定扩增出有差异的条带 (考虑到相斥相标记在辅助选择中应用价值不大，那些能在抗感亲本间扩增出相斥相条带 的引物没有重复扩增和统计在内)。这6个引物分别是S203，S109，0PE01，0PE05，0PE13和 0PA06。它们在抗感亲本间扩增出的差异见图1、图2、图3、图4。 从Pm23X Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株将其DNA等量混 合，随机选取10个感病单株将其DNA等量混合，分别建立抗病池和感病池。将以上6个引 物再在抗、感池间进行扩增检测，结果只有一个引物0PE05在抗、感池间表现多态性，多次 重复扩增，结果稳定。0PE05产生的差异片段长约1100bp，记作标记0PE05n。。。初步推断， 该标记与抗病基因Pm23连锁。扩增结果见图5。
2. 3Pm23XChancellor F2分离群体的RAPD分析 为进一步探讨标记0PE05n。。和Pm23基因间的连锁关系，对Pm23XChancellor杂 交产生的F2分离群体进行了 RAPD分析。种植于温室的101株F2植株，苗期和成株期分别 接种并调查记载发病情况。其中有73株表现抗病，28株表现感病，经^检验，抗病株感病 株符合3 : 1分离比例(x2 = 0. 974 < x2 = 3. 841)，证实小麦抗白粉病基因Pm23是一个 单显性基因。 引物0PE05对101株&植株的扩增结果表明，73株抗病单株中有71株能扩增出 长约llOObp的特异带，28个感病株中有8株能产生此带；部分感病单株中也能扩增出特异 带，这可能是由于标记与基因间还有一段距离所致。F2作图群体的检测结果和扩增结果见 图6。 根据最大似然法计算重组率(莫惠栋，遗传，1984,6(5) :42_48)，并按 Kosambi (1944)系数将重组率转化为cM，可以得出标记0PE05n。。与Pm23基因之间的遗传距 离为10. 65±3. 25cM。
图1随机引物S209和S203在抗病亲本(R)和感病亲本(S)间扩增出的多态性 图2随机引物0PA06在抗病亲本(R)和感病亲本(S)间扩增出的多态性 图3随机引物0PE05和0PE13在抗病亲本(R)和感病亲本(S)间扩增出的多态性 图4随机引物0PE01在抗病亲本(R)和感病亲本(S)间扩增出的多态性 图5随机引物0PA06 (A) ， 0PE13 (B) ， 0PE05 (C) ， 0PE01 (D) ， S209 (E)和S203 (F)在
抗病池(R)和感病池(S)间的扩增结果(箭头示0PE05产生的特异带) 图6引物0PE05在F2分离群体中的扩增结果(R示交换单株，箭头示引物0PE05产
生的特异带) 讨论
Dweikat等(Theoretical and Applied Genetics, 1993，85 :497-505)认为，RAPD 引物在任意两个小麦品种之间扩增出多态性的频率为2%左右。胡等(生物技术通报， 2000(6) :5-8)、王心宇等(遗传学报，2000，27(10) :1072-1079)、隋新霞等(2001)的研究 结果也表明RAPD引物在小麦中扩增出多态性的频率相对较低，需筛选大量的随机引物才 能找到与目标基因紧密连锁的分子标记。本研究筛选了 350个随机引物，有6个引物在抗 感亲本间表现多态性，这与Dweikat等(1997)报道的频率相符。 根据Flor的基因对基因假说，携Pm23基因的小麦品种、感病对照及其F2分离群 体应该用对Pm23基因无毒的小种接种鉴定，但是由于目前还未能分离到该无毒小种；并且 Pm23对当前我国主要麦区小麦白粉病的优势小种表现高抗或免疫，所以用小麦白粉菌优势 生理小种No. 15小种接种实验材料也能反应其真实的抗感分离情况。
Pm23已被定位到5A染色体上(Mcintosh等，University Extention Press, 1998， Vol, 5 :123-127)，本实验首先用位于5A上的18对SSR引物在抗、感亲本和抗、感池间进行 筛选，结果没有找到在抗感池间表现多态性的引物。随后又对79对非5A染色体的SSR引 物进行筛选，亦未发现在抗感池间表现多态性的引物。推测其原因可能是目前5A染色体上 SSR标记密度不高所以难以找到与Pm23相连锁的标记。 RAPD的稳定性和重复性一直是该项标记技术应用于理论研究和育种实践的最大 障碍。本实验数百次的稳定性重复扩增表明，只要建立其优化的RAPD-PCR反应程序，该技 术仍不失为一种很实用的分子标记技术。在本实验的早期，我们研究了影响RAPD-PCR反应 重复性的因子，如Mg2+浓度、引物质量、模板DNA和Taq酶质量等，结果表明，模板DNA的质 量对扩增结果影响不大；合适的Mg2+浓度，高质量的引物和Taq酶是多次重复扩增获得一致 性结果的保证。只要在实验中动作快捷，操作细心认真，保证每次扩增从样品准备到电泳检 测的一致性和所用试剂和药品的质量，获得好的重复性结果是相当容易的。另外，好的扩增 结果和重复性还要求操作环境洁净、低温(配置反应体系最好用冰盒)，点样前凝胶凝固时 间不可过短或过长(以30分钟左右为宜)。 小麦抗白粉病基因Pm23对当前我国各大麦区流行的小麦白粉菌优势小种表现免 疫，并且其载体品种为普通栽培小麦，没有其他不良基因的连锁累赘，所以Pm23基因是小 麦抗病育种中不可多得的一个优质抗源。但到目前为止，还未见与之相连锁的分子标记的 报道。本研究获得的RAPD标记0PE05n。。是Pm23第一个标记。在本实验数百次的扩增过程 中，按照已优化的反应程序，该标记每次均能稳定地扩增出清晰一致的特异性条带。所以， RAPD标记0PE05n。。可用于Pm23基因的聚合、跟踪检测和分子标记辅助选择中，从而大幅度 地减轻工作量、提高选择的准确性和效率。 分子标记与目标基因间遗传距离的准确性与研究中作图群体的大小有关，一般 初步的遗传作图只需50-100株F2植株，就可以检测到相距l-3cM的两标记间重组的发生 (Paterson，1996)。如果要绘制更精确的遗传图谱，则应加大作图群体，分析更多的F2单株。 本实验中用随机引物0PE05对F2分离群体的101个单株进行了 RAPD分析，所以只是对Pm23 初步的作图分析。如要对Pm23基因进行更精确的标记和作图，则应创建更大的F2分离群体 (如1000株以上)，结合使用多态性水平较高的分子标记技术如AFLP技术进行分析，以寻 找与之连锁距离更小乃至共分离的分子标记，构建Pm23基因位点附近高密度的连锁图谱， 最终为进行染色体步移或染色体着陆克隆该基因奠定基础。
具体实施例方式1.材料与方法 1. 1实验材料 以带有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小 麦品种Chancel lor为感病亲本(同时也兼作感病对照)，配制杂交组合Pm23 X Chancel lor ， ^代自交，获得101株&单株作为分离群体，用于分子标记的筛选和遗传连锁分析。
实验所用材料小麦品系Pm23、 Chancellor由中国国家小麦改良中心泰安分中心 保存提供。 1. 2白粉病抗性接种及鉴定 用当前小麦白粉菌的优势小种NO. 15号小种对抗、感亲本、所有的&单株进行 两次接种， 一次在三叶期(盛宝钦等，植物保护，1988， 1 :49-50)， 一次在开花后灌浆期 (CI匪TY)，在感病对照充分发病的条件下，调查抗、感分离情况，每隔2-3天重复调查一次， 病级鉴定按盛宝钦等(1988)提出的反应型分级标准进行。
1.3基因组DNA的提取DNA的提取采用Devos (Theor. A卯l.Genet， 1992， 84 :567-572)的酚-氯仿提取
法，稍有改动，以适于1. 5ml离心管提取。 1. 4BSA(Bulked Segregate Analysis)分池 按Michelmore等(1991)提出的分离群体集群分析法(BSA法)，建立抗病基因池 和感病基因池，对在双亲间表现多态性的引物进行进一步的筛选。 抗病池和感病池将F2群体的单株分别提取总基因组DNA，随机选取10个抗病单 株将其DNA等量混合，随机选取10个感病单株将其DNA等量混合，分别建立抗病池和感病 池。 1.5SSR分析 1. 5. ISSR反应体系扩增程序 小麦SSR引物共97个，其中18个位于5A染色体上，根据Roder等(Mo 1. Gen. Genet. 1998,246 :327-333) 、Gupta等(Theor Appl. Genet， 2002， 105 :413-422)公布的序列合成。SSR-PCR反应体系如下H2015. 8ii 110X Buffer2. 5ii 1Mg2+(25,1/L)1. 5ii 1dNTP(2. 5,1/L)2ii 1TaqE(5U/ii 1)0. 2ii 1Primer(2. 5 u mol/L)3ii 1DNA(30ng/ii 1)2ii 1总体积(Total)25 ii 11. 5. 2. SSR扩增程序
扩增反应在Thermal Cycler 9600 PCR上进行。先进行一次预扩增95。C变性5 分钟，然后进行30个循环的扩增，每个循环95t:变性1分钟，55 °C (复性温度因引物不同而
异)复性l分钟，72t:延伸l分钟，最后72t:延伸5分钟。扩增结束后，置于4t:保存待检测。 1. 5. 3.扩增产物的检测 扩增产物在1. 6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳，印染显色，然后用 TanonGis-2010型凝胶成像系统照相观察。 1.5.4.硝酸银染色步骤 (1)电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3分钟。 (2)用去离子水快速冲洗2-3次，每次30-40秒。 (3)于银然液中染色5-7分钟。 (4)用水快速冲洗(10秒钟左右)，不超过20秒钟。 (5)放入显影液中显影至第一条带出现( 一般以泳道出现为准)。 (6)最后放入停影液中停影。 1.5.5.所用试剂的配制 1. 6%聚丙烯酰胺凝胶的配方( 一块板用量30ml) 去离子水 19. 5ml 5XTBE缓冲液 6ml39 : 1 (丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺) 4. 5ml (39g+lg+100ml水)用之前先过滤。 TEMED 16 ii 1 过硫酸氨(0. lg/ml) 160 iil 其中，后两者是催化剂，用量可随温度升高酌情减少。 固定液40ml乙醇+360ml水+2ml乙酸 印染液0. 6克AgN03+300ml水即2% AgN03 显影液3% NaOH(12gNaOH+400ml水+2ml甲醛)，甲醛用时现用现加停影液10% 乙酸(30ml乙酸+270ml水) 其中，固定液和印染液可以重复利用，前者2次，后者可用3次。 电泳电压一般掌握在低于120V. 1. 6RAPD-PCR分析 1. 6. 1引物来源及引物的稀释 用于扩增的350个十碱基随机引物中，230个(S1-S230)购自上海生物工程公司 (Sangon) ， 120个(0PA1_20、 0PE1_20、 0PF1_20、 0PH1_20、 0PT1-20和0PV1-20)购自北京鼎 国生物工程公司。S系列引物为0. 20D/管，每管加入200 iU超纯水稀释。 1. 6. 2RAPD-PCR反应体系
:0151] 10XPCR Buffer 2. 5 ii 1
:0152] Mg2+(25mM) 2 ii 1
:0153] d證(2.5mM) 1.5iU
:0154] TaqE(5U/iU) 0. 25 ii 1
:0155] Primer pair (5 ii M) 1 u 1
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DNA(30ng/ii 1) 2 ii 1 ddH20 15. 75 ill _ 总体积(Total) 25 ill 附10XPCR Buffer Tris(pH8. 3) lOOmM
KC1 500mM MgCl2 15mM 1. 6. 3RAPD-PCR反应程序 PCR反应在Thermal Cycler 9600PCR上进行。先进行一次预扩增94°C 3分钟、 36 °C 1分钟、72 °C 2分钟，然后进行45个循环的扩增，每个循环94°C 15秒、36 °C 30秒、72 °C 1 分钟，最后72t:延伸4分钟。扩增结束后4t:保存待检测。
1.6. 4扩增产物的检测 扩增产物中加入适量溴酚兰(产物/溴酚兰4V/1V)，混匀，用1. 4%琼脂糖凝胶电 泳分离(电泳电压5V/cm)，凝胶经EB染色后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统照相观察。
1.7数据分析 根据最大似然法计算重组率(莫惠栋，1984)，并按Kosambi (Ann Eugen. 1944， 12 : 172-175)系数将重组率转化为CentiMorgan(cM)。
权利要求
小麦抗白粉病基因Pm23的RAPD标记研究，其特征在于本研究以携有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小麦品种Chancellor为感病亲本，配制杂交组合，用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行了RAPD分析，350个十碱基随机引物在抗感池间的扩增结果显示，相引相标记OPE051100可能与Pm23紧密连锁，对F2分离群体进行RAPD分析表明，该标记与Pm23基因之间的连锁距离为10.65±3.25cM，目前国内外尚未见Pm23分子标记的报道，OPE051100是Pm23的第一个分子标记，可以有效用于小麦抗病育种分子标记辅助选择中。
全文摘要
Pm23是从我国一个普通小麦品系中鉴定到的小麦抗白粉病基因，该基因对世界上很多麦区流行的白粉病表现高抗或免疫，已被定位到5A染色体上。本研究以携有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小麦品种Chancellor为感病亲本，配制杂交组合，用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行了RAPD分析。350个十碱基随机引物在抗感池间的扩增结果显示，相引相标记OPE051100可能与Pm23紧密连锁。对F2分离群体进行RAPD分析表明，该标记与Pm23基因之间的连锁距离为10.65+3.25cM，可以有效用于小麦抗病育种分子标记辅助选择中。
文档编号C12Q1/68GK101760512SQ20081016029
公开日2010年6月30日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者李祥 申请人:李祥