专利名称：小麦抗白粉病基因复壮30的ssr标记及其获得方法
技术领域：
本发明小麦抗白粉病基因复壮30的SSR标记及其获得方法，提供了与小麦 抗白粉病基因复壮30紧密连锁的分子标记，属于作物遗传育种学领域。可以有 效用于复壮30的跟踪检测和标记辅助育种。
二背景技术：
由专性寄生真菌小麦白粉菌引起的小麦白粉病是危害小麦生产的一种世界 性病害。小麦白粉菌具有小种多、变异快、适应范围广等特点，小麦生产中使 用抗性基因时，白粉菌群体往往会因寄主抗性基因的选择作用而发生协同进化， 克服抗性基因，导致病害大流行(植物病理学报，1995， 25: 116)。近年来白粉 病在我国各大麦区常有发生和流行，危害程度日趋严重，已成为影响和限制小 麦高产和稳产的一大障碍。化学防治白粉病虽有一定成效，但需花费大量的人 力、物力，而且还会引起环境污染等生态问题。培育和推广抗病品种被公认为 是防治小麦白粉病最经济、有效、安全的途径(张增艳等2002中国农业科学,2002, 35(7) :789-793)。随着分子标记技术的产生和不断发展完善，利用分子标记技术 标记抗病基因，并用于标记辅助育种已成为筛选抗病基因聚合体、选育抗病品 种的有效方法(张庆利等2004 Agricultural Science in China, 2004， 3(6): 409-415)。而建立与抗病基因紧密连锁的分子标记，是进行分子标记辅助育种的 基础。寻找基因分子标记的最常用方法之一是Michelmore(1991 /Voce饥iV"f""/. JowfeWc.&z>we.t/5^,.1991， 88: 9828-9832)提出的分离群体分组分析法(BSA)。在小麦中，SSR已被证实是一种非常有效的分子标记，它与其 它标记技术相比能检测到更高的多态性(Roder等1995 Mol.Gen.Genet. 1995, 248:163-167)。
小麦品种复壮30是由陕西泾惠农场从泾阳30系统选育而成，它携带的抗 白粉病基因对当前我国各大麦区流行的小麦白粉菌优势小种表现高抗或免疫， 本研究经田间和温室抗性鉴定，证明其对白粉病的抗性达到高抗至免疫水平， 因此是小麦抗白粉病育种中的一个优良抗源。该基因已被定位到7B染色体上， 现己被定名为户m5e。目前，已报道的尸m^基因的SSR标记的研究报道较少。 而与其紧密连锁的分子标记还未见报道。
本研究利用F2分离群体分组法(BSA)对抗白粉病基因复壮30进行了 SSR 标记分析，寻找与复壮30连锁的SSR标记。
本研究以复壮30、感病品种Chancellor为材料，配制杂交组合复壮 30xChancellor，获得杂种F,， Fi代自交，获得F2分离群体。
发明内容
本发明的目的是:提供了与小麦抗白粉病基因复壮30紧密连锁的分子标记， 有效用于复壮30的跟踪检测和标记辅助育种；而且利用该分子标记在早代就可 以进行选择，提高选择的准确性，缩小育种群体，并且不受环境、生长季节的 限制，结合加代技术能大大缩短育种年限、提高育种效率。
1、小麦抗白粉病基因复壮30的SSR标记，其特征在于.'
采用已定位在7B染色体上的56对SSR引物分析结果表明，8个引物能在
亲本间稳定的揭示多态性差异，3个引物Xwmc364 、 Barc065和Xwmc517在
抗、感亲本，抗、感池间和F2分离群体的抗、感单株间扩增出特异 带，经5 次以上重复扩增，结果稳定。3对引物所扩增的特异谱带分别记为Xwmc364175、Barc0659o和Xwmc517細，它们与复壮30中的抗白粉病基因/>m5e间的遗传距离 分别为4.9cM， 5.1cM和18.5cM，可作为户w5e的SSR标记。其中标记 Xwmc364175和Barc06590与抗病基因紧密连锁，在对户/w^的标记辅助选择中具 有利用价值。
2、权利要求1所述小麦抗白粉病基因复壮30的SSR标记的获得方法，包
括-
步骤一分离群体的创建
复壮30xChancellor获得Fi种子，^自交，得F2分离群体。 步骤二白粉病抗性接种及鉴定
用当前小麦白粉菌的优势小种Nai5号小种对抗、感亲本、所有的F2单株 进行两次接种， 一次在三叶期， 一次在拔节期，同时以感病亲本Chancellor为感 病对照。在感病对照充分发病的条件下，调査抗、感分离情况，每隔2-3天重复 调査一次，病级鉴定按盛宝钦等(盛宝钦等1988植物保护，1988， l'. 49-501988) 提出的反应型标准(0-4级)进行。
步骤三F2代群体的分子标记分析
(1) 用Devos (Theor.Appl.Genet， 1992， 84:567-572)的酚-氯仿提取法,稍有 改动，适于1.5ml离心管提取。
提取抗、感亲本及F2代群体各单株的DNA;
(2) 首先用已定位在7B染色体上的56对SSR引物在抗病亲本复壮30和 感病亲本Chancellor间进行多态性筛选，利用第一轮筛选出的在抗、感材料间具 有多态性差异的引物在抗、感池间进行第二轮筛选-
建立抗病池和感病池从复壮30 x Chancellor的F2代分离群体中随机选取 10个抗病单株的DNA等量混合，随机选取10个感病单株的DNA等量混合。SSR-PCR反应体系:PCR反应体积为25nl，其中含有2.5nl 10xPCRBuffer(100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.3), 500 mmoi/L KCI)， 2pl 30 ng膜板DNA， 0. 2^1 (5U4U) Taq酶,2nl (25Mm) MgCI2,3pl (2.5nmol/L)引物，2pl (2.5mmol/L )dNTP。
SSR扩增程序扩增反应在Thermal Cycler 9600 PCR上进行。先进行一次 预扩增95'C变性5分钟，然后进行30个循环的扩增，每个循环95'C变性1分 钟，55'C (复性温度因引物不同而异)复性l分钟，72'C延伸1分钟，最后 72'C延伸5分钟。
扩增产物的检测扩增产物在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳， 银染显色，然后用TancmGis-2010型凝胶成像系统照相观察，记录结果
选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态性的引物为与复 壮30连锁的SSR分子标记3对，将这3对分子标记在F2代群体单株中扩增获 取群体各单株的抗、感反应型资料。
步骤四分子标记获得
根据连锁交换规律，利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴 定获得的对应各单株的抗、感反应型资料构建3对SSR标记与复壮30的连锁图 谱，利用MAPMARKER3.0计算各标记与复壮30中的抗白粉病基因户附5e间 的遗传距离分别为4.9cM， 5.1cM和18.5cM，其中标记Xwmc364175和Barc065 与复壮30基因表现为紧密连锁。
本发明的有益效果是
1、 本发明在国际上首次获得了 2个与小麦抗白粉病基因复壮30紧密连锁 的SSR标记；
2、 鉴定方便，提高效率。SSR标记的特点是多态性强、共显性、在整个基因组中随机分布、稳定性好、操作简单；在小麦中，SSR已被证实是一种非 常有效的分子标记。利用紧密连锁标记在早代就可以进行选择，提高选择的准 确性，縮小育种群体，并且不受环境、生长季节的限制，结合加代技术能大大 缩短育种年限、提高育种效率。
3、可用于克隆抗白粉病基因尸m^的研究。图位克隆Pm5e基因的前提在 于获得与/^&基因紧密连锁的分子标记。标记Xwmc364ns和Barc065与复壮 30基因表现为紧密连锁。
以下结合附图对本发明作进一步的说明。
四
图l从左至右分别为引物Barc065、 Xwmc364和Xwmc517在抗、感亲本，抗、 感池间的扩增结果。(M:标准分子量，S:感病池，R:抗病池，SP:感病亲 本Chancellor, RP:抗病亲本复壮30)。
图2引物Xwmc364在F2分离群体中的部分扩增结果(S表示感病单株，R表 示抗病单株，M表示标准分子量)。
图3引物Barc065在F2分离群体中的部分扩增结果(S表示感病单株，R表示 抗病单株，M表示标准分子量)。
图4引物Xwmc517在F2分离群体中的部分扩增结果(S表示感病单株，R表 示抗病单株，M表示标准分子量)。
图5小麦染色体7B上户m^基因与SSR标记的连锁图谱。
五具体实施例方式
本试验所用材料冬小麦品种复壮30来源于陕西泾惠农场，从泾阳30系统 选育而成，它携有一对抗白粉病隐性基因，该基因对我国流行的白粉病小种表现为高抗或免疫。本研究以复壮30、感病品种Chancellor为材料，利用&分离 群体分组分析法(BSA)对复壮30的抗白粉病基因进行SSR标记分析。
目前获得的Pm5e的SSR标记很少，而与其紧密连锁的分子标记还未见报道。
本研究筛选出3个与基因连锁的SSR标记，其中2个为紧密连锁标 记，它们可有效地用于户附5e基因的标记辅助选择。以该标记为路标，可以进行 P加^基因的精细定位或通过染色体步移法接近户w5e基因，从而为P附5e基因 的克隆打下基础。
步骤一分离群体的创建
复壮30xChancellor获得F,种子，R自交，得F2分离群体。 步骤二白粉病抗性接种及鉴定
用当前小麦白粉菌的优势小种N0.15号小种对抗、感亲本、所有的F2单株 进行两次接种， 一次在三叶期， 一次在拔节期，同时以感病亲本Chancellor为感 病对照。在感病对照充分发病的条件下，调査抗、感分离情况，每隔2-3天重复 调査一次，病级鉴定按盛宝钦等提出的反应型标准(0-4级)进行。
步骤三F2代群体的分子标记分析
(1) 用Dews (1992)的酚-氯仿提取法，稍有改动，适于1.5ml离心管提取。 提取抗、感亲本及F2代群体各单株的DNA;
(2) 首先用已定位在7B染色体上的56对SSR引物在抗病亲本复壮30和 感病亲本Chancellor间进行多态性筛选，利用第一轮筛选出的在抗、感材料间具 有多态性差异的引物在抗、感池间进行第二轮筛选
建立抗病池和感病池从复壮30 x Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株的DNA等量混合，随机选取10个感病单株的DNA等量混合。
SSR-PCR反应体系PCR反应体积为25jil，其中含有2.5nl 10xPCRBuffer(100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.3)， 500 mmol/L KCI)， 2|il 30 ng膜板DNA， 0. 2^1 (5UV1) Taq酶,2^(25Mm)MgCl2，3nl (2.5nmol/L)引物,2^1 (2.5mmol/L)dNTP。
SSR扩增程序扩增反应在Thermal Cyder 9600 PCR上进行。先进行一次 预扩增95'C变性5分钟，然后进行30个循环的扩增，每个循环95'C变性1分 钟，55'C (复性温度因引物不同而异)复性l分钟，72'C延伸1分钟，最后 72'C延伸5分钟。
扩增产物的检测扩增产物在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳， 银染显色，然后用TaiionGis-2010型凝胶成像系统照相观察，记录结果
选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态性的引物为与复 壮30连锁的SSR分子标记3对，将这3对分子标记在F2代群体单株中扩增获 取群体各单株的抗、感反应型资料。
步骤四分子标记获得
根据连锁交换规律，利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴 定获得的对应各单株的抗、感反应型资料构建3对SSR标记与复壮30的连锁图 谱，利用MAPMARKER3.0计算各标记与复壮30中的抗白粉病基因P附56间 的遗传距离分别为4.9cM， 5.1cM和18.5cM，其中标记Xwmc364175和Barc065 与复壮30基因表现为紧密连锁。 步骤五结果与分析
采用定位于小麦7B染色体上的56对SSR引物，在抗病亲本复壮30和感 病亲本Chancellor间进行多态性筛选，均能扩增出明显可辨的带,其中8对引物、的扩增产物在抗、感材料间具有多态性差异，经多次重复结果稳定。从复壮30x Chancellor的F2代分离群体中随机选取10个抗病单株将其DNA等量混合，随 机选取10个感病单株将其DNA等量混合，分别建立抗病池和感病池。利用第 一轮筛选出的8对引物在抗、感池间进行第二轮扩增检测，结果有3个引物 Xwmc364、 Barc065和Xwmc517在抗、感亲本，抗、感池间和F;j分离群体的 抗、感单株间扩增出特异谱带，经5次以上重复扩增，结果稳定。引物Xwmc364、 Barc065和Xwmc517，扩增的差异片段长分别约为:175bp、 90bp和200bp。
将复壮30 xChancellorF2分离群体，种植于试验网室，并在12月上旬移栽于 温室内。利用15号白粉病菌种在苗期和拔节期分别接种，待充分发病后进行抗 病性调査并记载反应型。在调查的F2群体中，苗期共调査191株，其中62株表 现抗病，129株表现感病，经chi-squaref检验，抗病株感病株符合1: 3分离 比例(X2=2.126<x2-3.841)。成株期(灌浆期)共调査154株，其中，55株表现 抗病，99株表现感病，经chi-squaref检验，抗病株感病株符合l: 3分离比 例(3.536<x2(0,o5> -3.841)。进一步证明Pm5e是1个抗白粉病隐性基因。利用筛 选出的3对特异引物对154株F2植株进行扩增，获得了稳定的特异标记带，分 别记为Xwmc364175、 Barc065邻和Xwmc517200，利用MAPMARKER3.0计算各 标记与复壮30中的抗白粉病基因P附5e间的遗传距离分别为4.9cM、 5.1cM和 18.5cM (图5)，其中标记Xwmc364175和Barc065与复壮30基因表现为紧密连 锁。引物Xwmc364、 Barc065和Xwmc517在抗、感亲本，抗、感池间及F2分 离群体中的部分扩增结果分别见图l、图2、图3和图4。
权利要求
1、小麦抗白粉病基因复壮30的SSR标记，其特征在于采用已定位在7B染色体上的56对SSR引物分析结果表明，8个引物能在亲本间稳定的揭示多态性差异，3个引物Xwmc364、Barc065和Xwmc517在抗、感亲本，抗、感池间和F2分离群体的抗、感单株间扩增出特异谱带，经5次以上重复扩增，结果稳定；3对引物所扩增的特异谱带分别记为Xwmc364175、Barc06590和Xwmc517200，它们与复壮30中的抗白粉病基因Pm5e间的遗传距离分别为4.9cM，5.1cM和18.5cM，可作为Pm5e的SSR标记；其中标记Xwmc364175和Barc06590与抗病基因紧密连锁，在对Pm5e的标记辅助选择中具有利用价值。
2、 权利要求1所述小麦抗白粉病基因复壮30的SSR标记的获得方法，包括步骤一分离群体的创建复壮30xChancellor获得F,种子，F,自交，得F2分离群体； 注Chancellor为感白粉病亲本；步骤二白粉病抗性接种及鉴定用当前小麦白粉菌的优势小种N0.15号小种对抗、感亲本、所有的F2单株 进行两次接种， 一次在三叶期， 一次在拔节期，同时以感病亲本Chancellor为感 病对照，在感病对照充分发病的条件下，调查抗、感分离情况，每隔2-3天重复 调查一次，病级鉴定按盛宝钦等(l诉8)提出的反应型标准(04级)进行；步骤三F2代群体的分子标记分析U)用Devos (1992)的酚-氯仿提取法，稍有改动，适于L5ml离心管提取， 提取抗、感亲本及F2代群体各单株的DNA;(2)首先用已定位在7B染色体上的56对SSR引物在抗病亲本复壮30和 感病亲本Chancellor间进行多态性筛选，利用第一轮筛选出的在抗、感材料间具有多态性差异的引物在抗、感池间进行第二轮筛选-建立抗病池和感病池从复壮30 x Chancellor的F2代分离群体中随机选取 10个抗病单株的DNA等量混合，随机选取10个感病单株的DNA等量混合；SSR-PCR反应体系PCR反应体积为25nl，其中含有2.5nl 10xPCR Buffer(lOO mmol/L Tris-HCI (pH 8.3)， 500 mmol/L KCI)， 2^1 30 ng膜板DNA, 0. 2^1 (5U/pl) Taq酶，2nl (25Mm) MgCI2, 3^1 (2.5pmol/L)引物，2^1 (2.5mmol/L )d^fTP;SSR扩增程序扩增反应在Thermal Cyder 9600 PCR上进行，先进行一次 预扩增95X:变性5分钟，然后进行30个循环的扩增，每个循环95"C变性1分 钟，55°C (复性温度因引物不同而异)复性l分钟，72'C延伸1分钟，最后 72t:延伸5分钟；扩增产物的检测扩增产物在6%聚丙烯酰胺非变性凝胶上稳压110V电泳， 银染显色，然后用TanonGis-2010型凝胶成像系统照相观察，记录结果-选择在亲本间和F2代群体的抗、感池间扩增出相同有多态性的引物为与复 壮30连锁的SSR分子标记3对，将这3对分子标记在F2代群体单株中扩增获 取群体各单株的抗、感反应型资料；步骤四；分子标记获得根据连锁交换规律，利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴定获得的对应各单株的抗、感反应型资料构建3对SSR标记与复壮30的连锁图 谱，利用MAPMARKER3,0计算各标记与复壮30中的抗白粉病基因户w5e间 的遗传距离分别为4.9cM, 5.1cM和18.5cM，其中标记Xwmc364175和Barc065与复壮30基因表现为紧密连锁。
全文摘要
本发明小麦抗白粉病基因复壮30的SSR标记及其获得方法，属于作物遗传育种学领域。本研究筛选出3个与复壮30中的抗白粉病基因Pm5e连锁的SSR标记，其中2个为紧密连锁标记，它们可有效地用于复壮30中抗白粉病基因Pm5e的标记辅助选择。以该标记为路标，可以进行Pm5e基因的精细定位或通过染色体步移法接近Pm5e基因，从而为Pm5e基因的克隆打下基础。
文档编号C12Q1/68GK101659988SQ20081013907
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日 公开号200810139073.发明者祥 李 申请人:祥 李 被以下专利引用 (1),